绿茶多糖的制备方法以及含有所述多糖的用于皮肤增白、保湿和抗皱效果的化妆品组合物

摘要

本发明公开的是一种绿茶多糖的制备方法，且更具体地，涉及一种包括以下步骤的绿茶多糖的制备方法：a)用溶剂除去绿茶粉中的叶绿素和低分子量的多元酚；b)热水萃取步骤a)得到的绿茶残渣中的水溶性活性成分；以及c)通过超滤和乙醇沉淀从步骤b)得到的热水萃取物中分离出绿茶多糖。此外，本发明还涉及一种用于皮肤增白、保湿和具有抗皱效果的化妆品组合物，该化妆品组合物含有所述绿茶多糖作为有效成分。

说明书

技术领域

本发明涉及一种绿茶多糖的制备方法，且更具体地，涉及一种包括以下步骤的绿茶多糖的制备方法：

a)用溶剂除去绿茶粉中的叶绿素和低分子量的多元酚；

b)热水萃取步骤a)得到的绿茶残渣中的水溶性活性成分；以及

c)通过超滤和乙醇沉淀从步骤b)得到的热水萃取物中分离出绿茶多糖。此外，本发明还涉及一种用于皮肤增白、保湿和具有抗皱效果的化妆品组合物，该化妆品组合物含有所述绿茶多糖作为有效成分。

背景技术

绿茶含有很多对人有益的活性成分。这些活性成分包括儿茶酸，例如表儿茶素(epicatechin)、表没食子儿茶素(epigallocatechin)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechingallate)以及表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate)。这些儿茶酸在抗肿瘤作用、抗氧化作用、抗菌作用、重金属解毒和抑制高血压方面是广为人知的。

目前，正在进行积极的研究，以寻找除了儿茶酸之外的绿茶中的药理活性物质。据报道，从绿茶中提取的多元酚具有光老化抑制效果，并且可用作紫外光保护剂。没食子酸儿茶素没食子酸酯(gallocatechingallate)作为一种同分异构体也进行了对其萃取的研究。进一步地，对含有绿茶萃取物的皮肤外用制剂在改善由皮肤老化引起的起皱纹和弹性衰退方面进行了研究。这是因为绿茶中含有的多元酚可以消除自由基并激活与皮肤抗氧化有关的防御因子，从而改善皱纹和皮肤弹性。

此外，公知的是存在于绿茶中的水溶性多糖具有免疫、抗辐射、阻凝、抗肿瘤、抗艾滋病和降低血糖浓度的活性。从绿茶中分离并提纯的多糖具有抑制痤疮丙酸杆菌和特应性金黄色葡萄球菌之间的键合，以及抑制幽门螺旋菌和人体内宿主细胞之间的键合的活性。在参考文献中，用离子交换和凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)来分离绿茶多糖。然而，在经济效率方面，离子交换和凝胶过滤层析是较不可取的，因为需要过长的时间，并且还没有可用于大批量生产的技术。

由于绿茶萃取物具有较差的制剂稳定性，例如褪色，并且尽管具有多种活性物质，但不能大量使用以提供期望的效果，例如增白、保湿和抗皱效果，因此，绿茶萃取物不可避免地有必要用于与其它的有效成分结合。

作为绿茶的具有代表性的成分并且已知具有抗氧化作用的多元酚必须进行二次处理，例如，装入胶囊，因为它们在稳定的同时具有较差的制剂稳定性。然而，即使装入胶囊，多元酚也会随着时间快速褪色，并且因此不能用作化妆品材料。

发明内容

因此，本发明的发明人致力于寻求一种以更经济的方式来制备绿茶多糖的方法，结果披露了一种绿茶多糖的制备方法，该方法包括以下步骤：

a)用溶剂除去绿茶粉中的叶绿素和低分子量的多元酚；

b)热水萃取步骤a)得到的绿茶残渣中的水溶性活性成分；以及

c)通过超滤和乙醇沉淀从步骤b)得到的热水萃取物中分离出绿茶多糖。通过这种方法，在很短的处理时间内并大量地制备出绿茶多糖是可能的，使得经济效率得以提高。基于这一发现，完成了本发明。

此外，本发明还发现了一种含有绿茶多糖的化妆品组合物，该组合物表现出优异的皮肤增白、皮肤保湿和抗皱效果。

因此，本发明的一个目的是提供一种高经济性的绿茶多糖的制备方法。

进一步地，本发明的另一个目的是提供一种用于皮肤增白、皮肤保湿和具有抗皱效果的化妆品组合物。

为了达到上述目的，本发明提供了一种绿茶多糖的制备方法，该方法包括以下步骤：

a)用溶剂除去绿茶粉中的叶绿素和低分子量的多元酚；

b)热水萃取步骤a)得到的绿茶残渣中的水溶性活性成分；以及

c)通过超滤和乙醇沉淀从步骤b)得到的热水萃取物中分离出绿茶多糖。

另一方面，本发明提供一种用于皮肤增白、保湿和具有抗皱效果的化妆品组合物，该化妆品组合物含有绿茶多糖作为有效成分。

根据本发明的方法制备绿茶多糖时，缩短制备时间并且大量地制备出绿茶多糖是可能的，使得经济效率得以提高。再者，根据本发明，含有绿茶多糖作为有效成分的化妆品组合物还可以提供优异的皮肤增白、保湿并具有抗皱效果而没有皮肤刺激。

附图说明

图1为绿茶多糖的细胞毒性测试结果图。

图2为绿茶多糖对抑制黑色素产生的效果图。

图3为绿茶多糖对抑制基质金属蛋白酶(MMP-1)的表达的效果图。

具体实施方式

本发明涉及一种绿茶多糖的制备方法，且更具体地，涉及一种包括以下步骤的绿茶多糖的制备方法：

a)用溶剂除去绿茶粉中的叶绿素和低分子量的多元酚；

b)热水萃取步骤a)得到的绿茶残渣中的水溶性活性成分；以及

c)通过超滤和乙醇沉淀从步骤b)得到的热水萃取物中分离出绿茶多糖。

此外，本发明还涉及一种用于皮肤增白、保湿和抗皱效果的化妆品组合物，该化妆品组合物含有绿茶多糖作为有效成分。

下面对本发明进行详细说明。

根据本发明，绿茶多糖源自茶(camellia sinensis)，该茶是属于茶科和山茶属的茶树中的一员，是一种公知的具有免疫、抗辐射、阻凝、抗肿瘤、抗艾滋病和降低血糖浓度的活性的常青灌木。此外，绿茶多糖还能抑制黑色素的产生和基质金属蛋白酶(MMP-1)的表达，并且能增加皮肤保湿性，没有导致皮肤刺激的细胞毒性，因此，可表现出皮肤增白、皮肤保湿和抗皱效果。

下面对根据本发明的制备绿茶多糖的方法的各个步骤进行详细描述。

步骤a)用溶剂除去绿茶粉中的叶绿素和低分子量的多元酚：

为了除去绿茶粉中的叶绿素和低分子量的多元酚，采用溶剂萃取。萃取溶剂优选选自由己烷、乙醇和甲醇组成的组中的至少一种。为了防止残留在化妆上而导致的毒性，更优选使用乙醇。

将溶剂加入到绿茶粉中并且在室温下充分搅拌。然后，通过离心分离除去溶解了叶绿素和低分子量的多元酚的溶剂。干燥得到的残渣以获得不含有叶绿素和低分子量的多元酚的产物。

步骤b)热水萃取步骤a)得到的绿茶残渣中的水溶性活性成分：

为了从步骤a)得到的残渣中萃取水溶性活性组分，采用热水萃取。所述热水萃取优选在温度为30-40℃之间进行。这是因为如果温度超过40℃，可能发生热变性，然而，如果温度低于30℃，则不能充分萃取多糖。热水萃取的时间优选为6-8小时。这是因为如果时间超过8小时，可能发生被微生物污染，然而，如果时间少于6小时，则不能充分萃取多糖。用过滤装置过滤通过热水萃取得到的萃取物，并且在真空下进行浓缩。

步骤c)通过超滤和乙醇沉淀从步骤b)得到的热水萃取物中分离绿茶多糖。

为了从步骤b)得到的热水萃取物中分离多糖，采用超滤和乙醇沉淀。所述多糖含有约60-65％的多糖部分和约8-9％的蛋白质部分。这两部分通过氨基酸-糖键链接，且剩余部分含有蛋白分离物。因此，多糖具有100,000-300,00道尔顿的分子量，该分子量远大于那些蛋白分离物。依靠分子量的不同，可使用超滤来分离绿茶多糖。超滤具有如下优点，一方面它是连续操作，能同时进行低分子量物质的分离和滤液的浓缩，并且另一方面由于超滤可在室温下进行，因而不会发生热变性。

然后，将乙醇缓慢加入到超滤浓缩液中以进行乙醇沉淀。这里，加入乙醇的速率优选为100-200ml/min。如果加入乙醇的速率大于200ml/min，会导致最终产物颗粒过大或结块(bulk up)。在乙醇沉淀完成之后，除去乙醇并且在40-50℃、在真空下干燥产物以得到粉末状的绿茶多糖。

本发明的绿茶多糖表现出优异的热稳定性、pH稳定性和体稳定性(body stability)以及制剂稳定性。根据本发明，以相对较高的产率制备绿茶多糖是可能的。

不像传统的由于褪色问题而使其应用受到了限制的绿茶提取物，根据本发明的绿茶多糖不含诸如是导致褪色的主要原因的多元酚成分，因而可大量应用到制剂中。因此，在没有额外的有效成分的情况下，含有绿茶多糖的化妆品组合物可具有最大化的皮肤增白、保湿和抗皱效果。

因此，本发明的化妆品组合物含有绿茶多糖作为有效成分，并且表现出优异的皮肤增白、保湿和抗皱效果。所述化妆品组合物在配方上没有特别的限制，并且可制成柔肤水、润肤液、保湿乳液、按摩霜、面膜、凝胶、身体护理乳液(body lotion)、身体护理油(body oil)和身体护理精华(body essence)。根据制剂类型和最终用途，每种化妆品组合物制剂可以含有除绿茶多糖之外的其它成分，并且本领域技术人员可以毫不费力地适当选择该额外的成分。

进一步地，以所述化妆品组合物的总重量为基准，化妆品组合物优选含有0.1-20重量％的绿茶多糖。如果所含的绿茶多糖的量超过20重量％，可能影响制剂稳定性，例如产生相分离。如果所含的绿茶多糖的量少于0.1重量％，制剂的效果会受到限制。

下面，将结合实施例对本发明进行更详细的描述。然而，应该理解的是，这些实施例只是为了达到举例说明的目的，不应理解为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：绿茶多糖的制备

将干燥的绿茶叶子粉碎并且通过筛网进行筛滤，以得到绿茶粉(d50＝100～1000μm)。将10kg绿茶粉分散在150L浓度为95％(v/v)的乙醇中，并且在室温下进行搅拌。离心分离该混合物，以除去叶绿素和低分子量的多元酚。将所得残渣用同样的溶剂进行一次萃取，并且干燥。

将通过萃取除去了叶绿素和低分子量的多元酚的萃取产物添加到125L水中，并且在35℃下搅拌7小时，进行热水萃取。通过压滤机将得到的绿茶多糖的萃取产物进行过滤、收集并且在真空、在62℃下浓缩至原始体积的1/10。

将绿茶多糖浓缩液进行超滤(截留分子量：30,000道尔顿)，以除去低分子量蛋白分离物，然后缓慢加入乙醇进行乙醇沉淀，加入乙醇的量为超滤终产物的5倍，加入速率为100ml/min。将沉淀的绿茶多糖于45℃下进行真空干燥，以得到250g粉末状的绿茶多糖。

实验实施例1：细胞毒性试验

将人体角化细胞(human keratinocyte HaCaT cell)接种到96孔细胞培养板中，每个孔含有1×10⁴个细胞，并且培养24小时。将该细胞培养板用100μL的PBS(磷酸盐缓冲液)清洗一次，换成含有1ppm、10ppm、50ppm和100ppm的绿茶多糖培养基，并且培养48小时。将WST-1溶液(RocheDiagnostic GmbH.，Germany)稀释10倍，加入到每个孔中。将该细胞培养板在37℃下培养2小时。随后，测量所得溶液在450nm处的吸光度。对照组用二甲基亚砜溶解样本。用对照组的数据对吸光度数据进行修正，结果如图1所示。

如图1所示，应当注意到的是，含有本发明的绿茶多糖的样本表现出和对照组类似的细胞存活力，并且在使用的浓度范围内不具有细胞毒性或者不会引起皮肤刺激。

实验实施例2：对黑色素形成的抑制效果

为了与酸性的绿茶多糖在细胞内对黑色素形成的抑制效果进行比较，本实施例使用了被认为是黑色素形成抑制剂的熊果苷作为比较试剂展开试验。将黑色素A细胞接种到24孔细胞培养板中，每个孔含有3×10⁴个细胞。一天之后，用10ppm、50ppm和100ppm的熊果苷或者用1ppm、10ppm、50ppm和100ppm的绿茶多糖对细胞培养板上的孔处理三次。在37℃下培养三天后，再次用熊果苷或者绿茶多糖按照如上所述的相同的方法对细胞培养板上的孔进行处理。再培养三天之后，用PBS冲洗细胞培养板。用1N NaOH溶液溶解形成的黑色素，并且随后测量所得溶液在405nm处的吸光度。对照组用二甲基亚砜溶解样本。用对照组的数据对吸光度数据进行修正，结果如图2所示。

如图2所示，应当注意到的是，含有本发明的绿茶多糖的样本抑制黑色素合成的效果与浓度成比例，并且绿茶多糖具有50ppm的IC50。因此，本发明的绿茶多糖表现出与熊果苷类似的对黑色素合成的抑制效果。所述IC50被定义为吸光度降到50％时的浓度。

实验实施例3：对经紫外光照射MMP-1的表达的抑制效果

为了证明对基质金属蛋白酶(MMP-1)的表达的抑制效果(所述基质金属蛋白酶的表达在暴露于紫外光时会增加)，将成纤维细胞(p6)接种到12孔细胞培养板中，每个孔含有0.75×10⁵个细胞，并且在无血清培养基中饥饿培养24小时。用PBS冲洗经饥饿培养的细胞，并且用紫外光照射(40mJ)。然后，在48小时内，向细胞中用10μM的视黄酸(RA)，或者1ppm、10ppm和50ppm的绿茶多糖注入(reject)两次。用试剂盒(Amersham，RPN2610)测量培养基中分离的MMP-1。用无紫外照射的对照组的数据对所得数据进行修正，结果如图3所示。

如图3所示，应当注意到的是，含有本发明的绿茶多糖的样本对MMP-1的表达的抑制效果与浓度成比例。特别地，当浓度为50ppm时，绿茶多糖在对MMP-1的表达的抑制水平上与无紫外光照射的对照组相当。

制剂实施例1和对比实施例1：润肤液的制备

通过如下常规的方法，根据表1中列出的组合物制备了制剂实施例1和对比实施例1(单位：重量％)。

表1

  成分  制剂实施例1  对比实施例1  纯净水  至100  至100  实施例1的绿茶多糖  0.5  蜂蜡  4.0  4.0  聚山梨醇酯60  1.5  1.5  失水山梨糖醇倍半油酸酯  1.5  1.5  液体石蜡  0.5  0.5  Montana 202(seppic)  5.0  5.0  甘油  3.0  3.0  丁二醇  3.0  3.0  丙二醇  3.0  3.0  聚羧乙烯  0.1  0.1  三乙醇胺  0.2  0.2

实验实施例4：对人体皮肤的皮肤保湿效果的提高

将50个年龄在50-60岁之间、皮肤干燥的男性成人和女性成人分成两组，并让他们使用由制剂实施例1或对比实施例1所制得的润肤液。将化妆水施用于面部，一天两次，使用四周。在使用之前，用皮肤测试仪在24℃恒温和相对湿度为40％的控制条件下测量皮肤水分以作为参照。开始使用一周、二周和四周后，以及暂停使用两周后，测量皮肤水分。结果如表2所示。数据表明，基于实验前用皮肤测试仪测得的数值，在使用预定时间后，皮肤水分增加了。

表2

如图2所示，相对于不含绿茶多糖的对比实施例1而言，含有本发明的绿茶多糖的制剂实施例1表现出更大的提高率。而且，即使在暂停使用两周后(共经过六周)，制剂实施例1仍保持与开始使用1-2周后相当的皮肤水分，这表明在停止使用润肤液后，制剂实施例1能在一段时间内保持皮肤水分。