一种关节软骨修复再生用支架及其制备方法

摘要

本发明公开了一种关节软骨修复再生用支架及其制备方法，属于医用材料领域。该支架的材料为脱钙松质-皮质骨，脱钙松质-皮质骨上设有贯穿脱钙松质骨和脱钙皮质骨的小孔。小孔垂直于脱钙皮质骨水平表面设置，小孔的直径为0.1-1mm。小孔为两个以上，小孔的孔中心距为0.5～5mm。本发明提供的制备方法，将骨骼浸泡于脱钙液中进行脱钙处理；用原子吸收分光光度计监测脱钙进程；脱钙后的标本进行X线和CT检测，以证明骨骼完全脱钙，得到脱钙松质-皮质骨；在脱钙皮质骨水平表面以0.1-1mm的直径激光打孔；将脱钙皮质骨剪裁成一定的大小规格，冷冻贮存。本发明采用的天然胶原支架材料，无免疫排斥反应，易于细胞吸附，生物相容性好，并兼有良好的机械强度。

说明书

技术领域

本发明涉及医用材料领域，特别涉及一种关节软骨修复再生用支架及其制备方法。

背景技术

关节软骨损伤是运动医学领域的难治性损伤。运动引起的关节软骨损伤发生率很高，北京大学运动医学研究所的调查结果显示软骨损伤占膝关节运动创伤的40.5％以上。软骨损伤后常会引起关节肿痛等症状。由于软骨组织结构特殊，其内无神经、血管和淋巴管，软骨的营养供给是通过关节活动产生的压力变化，使滑液在关节腔与软骨基质之间进行交流，故损伤后的关节软骨不能修复与再生，且易导致明显的功能障碍。国内、外软骨修复方法很多，但是尚无一种公认的完善修复方法。目前，利用自身骨髓修复软骨缺损，如：软骨下骨微骨折技术成为了软骨缺损修复的重要方法之一。由于它操作简单，对于小面积的软骨缺损取得良好结果，在临床软骨修复上已经广泛应用。但由于微骨折是通过骨髓形成的瘢块填充缺损，瘢块的机械应力太低，无法承受关节活动产生的压力。因此微骨折术后较长时间6周不能负重；修复位置可能出现塌陷或过度增生；微骨折方法对于大面积和非水平位置的软骨微骨折效果并不理想，而且新生软骨多为纤维软骨。因此，寻找适合的软骨缺损填充支架也成为软骨修复的主要研究方向之一。

目前使用的软骨修复支架材料可大体分为天然支架材料和人工支架材料两大类。天然支架材料是来源于动、植物或者人体内天然存在的大分子材料，具有良好的生物相容性、组织亲合性。人工支架材料是目前研究较多的材料，主要有聚羟基乙酸、聚乳酸、以及聚酸酐等，可根据需要调整其物理、化学、生物力学和降解性能，容易加工成形，生产重复性好。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：天然支架材料存在材料性质无法改变，机械强度及降解速度难于控制等问题。常用的天然支架材料有胶原蛋白、羟基磷灰石等，天然支架生物力学性质难以调整，很难找到和软骨生物力学性质相似的。有些天然生物材料支架的机械力学差，无法抵抗关节运动时产生的机械应力，容易造成修补处的塌陷，也同时影响材料上细胞的生长，而如羟基磷灰石支架弹性和蠕变性较软骨差，硬度过高易造成相对应的软骨关节面的磨损。人工支架材料的生物相容性相对较差，存在不同程度的炎性反应，以及免疫原性问题，甚至致癌性问题。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种兼有良好的生物相容性和机械强度的关节软骨修复再生用支架。

本发明的另一个目的是提供关节软骨修复再生用支架的制备方法。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：

所述支架的材料为脱钙松质-皮质骨，所述脱钙松质-皮质骨上设有贯穿脱钙松质骨和脱钙皮质骨的小孔。

所述小孔垂直于所述的脱钙皮质骨水平表面设置，所述小孔的直径为0.1-1mm。

所述小孔为两个以上，相邻所述小孔的中心距离为0.5～5mm。

所述小孔的孔隙率为5％-50％。

本发明提供的另一个技术方案是：一种关节软骨修复再生用支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)选择包括皮质骨和松质骨双层结构的骨骼；

(2)将所述骨骼浸泡于脱钙液中进行脱钙处理；

(3)用原子吸收分光光度计监测脱钙进程；

(4)脱钙后的标本进行X线和CT检测，当骨骼完全脱钙后，得到脱钙松质-皮质骨；

(5)垂直于脱钙皮质骨水平表面以0.1-1mm的直径激光打孔，钻孔贯穿脱钙皮质骨和脱钙松质骨两层，穿透整个支架；

(6)将脱钙松质-皮质骨剪裁成使用需要的规格，冷冻贮存。

所述脱钙液为0.1M-0.7M乙二胺四乙酸，pH值6-10，温度：2-10℃。

进一步地，在移植所述生物支架前，所述生物支架进行钴60照射12-72小时。

所述骨骼为低温冷冻的人髂骨、椎体骨或长骨干骺端。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

1.运用成熟的商业骨库中的人骨为原料，骨库骨是已经通过药监局批准，并应用于临床多年的原料，供体来源充分且安全，易于临床普及。很多动物松质-皮质骨(牛、羊等)脱钙经本发明的方法处理也可以用于人软骨损伤的修复。牛、羊养殖数量多，取骨做材料更为广泛。

2.本发明运用了保护脱钙骨支架生物特性脱钙新方法，同时解决了用乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙所存在的问题。普遍运用的酸(盐酸、硝酸和甲酸等)脱钙方法，对骨的胶原支架损伤很大，造成支架变脆，弹性模量下降等生物学和生物力学性质的改变，无法再用于软骨修复。本发明中运用EDTA(中性钙离子螯合剂)(此种中性脱钙剂对骨胶原支架损伤最小)进行人骨的脱钙。但由于EDTA脱钙剂只能渗透人皮质骨表面2mm，无法完全脱去皮质骨中心的钙质，而且时间过长，无法满足临床应用需要。因此本发明放弃单纯脱钙皮质骨支架而选用皮质-松质骨，支架中皮质骨厚度只取0.1-1mm，其余用松质骨的厚度补足缺损深度，由于松质骨的多孔隙结构，使脱钙液很容易进入材料中心。不仅能完全脱钙，而且显著缩短了脱钙时间，满足临床应用。

3.利用材料中的薄层皮质骨，可以运用固定钉将修复材料固定于软骨缺损处，增加软骨修复支架的牢固程度，缩短病人术后负重行走、恢复运动功能的时间。

4.支架中松质骨的疏松多孔结构，可以容纳更多软骨下骨释放的骨髓及骨髓来源干细胞，有更加宽阔的空间让骨髓干细胞进行粘附、迁移和营养物质的交换，加速干细胞的增殖和分化，软骨缺损的修复。

5.本发明采用的天然胶原支架材料，无免疫排斥反应的问题，易于细胞吸附，生物相容性好。

6.在脱钙松质-皮质骨支架自身富含骨形态蛋白(BMPs)，可促进诱导支架中的骨髓中间的干细胞或骨髓基质细胞转化成软骨细胞或骨细胞，促进干细胞分泌、软骨或骨基质的分泌。对软骨修复的启动、发育、调控及塑形均有重要作用。

7.操作简便，不需二次手术，节省了手术中取材时间，易于临床应用。本发明的纵向钻孔的脱钙松质-皮质骨关节软骨再生用支架，使用时利用微骨折技术释放自身的骨髓干细胞，使其通过支架上的纵向钻孔扩散至脱钙松质骨支架内部，脱钙松质骨支架支撑自体骨髓干细胞三维立体生长，同时支架上的骨形态蛋白(BMPs)诱导骨髓干细胞向骨、软骨生长、分化。本发明避开了组织工程中体外支架培养细胞，外源因子诱导，生成物回植等复杂的步骤，无需二次手术，更适用于临床应用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的关节软骨修复再生用支架示意图；

图2是图1的剖视图；

图3是本发明实施例提供的关节软骨修复再生用支架的制备流程图；

图4是本发明实施例提供的关节软骨修复再生用支架扫描电镜结构图；

图5是本发明实施例提供的人脱钙皮质-松质骨支架修复膝关节软骨缺损手术图；

图6是本发明实施例提供的人脱钙皮质-松质骨支架修复膝关节软骨缺损后12周取材观察膝关节软骨缺损修复处大体图；

图7是本发明实施例提供的人脱钙皮质-松质骨支架修复膝关节软骨缺损12周HE染色图；

图8是本发明实施例提供的人脱钙皮质-松质骨支架修复膝关节软骨缺损12周甲苯胺蓝软骨特异性染色图；

图9是本发明实施例提供的人脱钙皮质-松质骨支架修复膝关节软骨缺损12周II型胶原免疫组化染色图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

参见图1和图2，一种关节软骨修复再生用支架，所述支架的材料为脱钙松质-皮质骨，脱钙皮质骨1连接着脱钙松质骨3，所述脱钙松质-皮质骨上设有贯穿脱钙松质骨3和脱钙皮质骨1的小孔2。

作为一种优选，小孔2垂直于脱钙皮质骨1水平表面设置，小孔2的直径为0.1-1mm，可以为0.1mm、0.5mm、1mm。小孔2为两个以上，相邻小孔2的孔中心的距离为0.5～5mm，孔中心距离可以为0.5mm、1.2mm、3.4mm、5mm。小孔2的孔隙率为5％-20％，支架总体厚度大于2mm。

实施例1

参见图3，一种关节软骨修复再生用支架的制备方法，包括以下步骤：

步骤101：选择皮质骨下带有松质骨的骨骼，将皮质骨厚度修整在0.5-3mm，脱钙液为0.1M-0.7M 乙二胺四乙酸，pH值6-10，温度：2-10℃；

步骤102：将骨骼浸泡于脱钙液中进行脱钙处理；

步骤103：用原子吸收分光光度计监测脱钙进程；

步骤104：脱钙后的标本进行x线和CT检测，以证明骨骼完全脱钙，得到脱钙松质-皮质骨；

步骤105：在脱钙皮质骨水平表面以0.1-1mm的直径激光打孔；

步骤106：通过纳米压痕生物力学测试仪检测脱钙松质-皮质骨支架各部分纳米弹性模量，筛选出和正常软骨弹性模量相似的脱钙松质-皮质骨作为关节软骨修复再生用支架，将脱钙松质-皮质骨剪裁成使用需要的规格，冷冻贮存；

步骤107：在移植所述生物支架前，所述生物支架进行钴60照射12-24小时。

采用本实施例的关节软骨修复再生用支架的修复方法主要步骤为：

首先，在骨软骨缺损区域进行刨刮去除纤维变、不规则的病变软骨和软骨下骨。继而，进行软骨下骨磨削，将骨软骨缺损修成比较规则的形状。然后进行软骨下骨的钻孔使能够释放自身的骨髓。

接着，将激光钻孔处理的脱钙骨支架，修整成符合骨软骨缺损的形状，填入缺损处，皮质骨部分为底层。软骨下骨由于钻孔而释放的自身的骨髓，会通过支架皮质骨上的小孔渗透入脱钙松质骨中，进而修复骨软骨缺损处。释放出的自身骨髓干细胞，增强了修复能力。单纯软骨下骨钻孔释放出的自身骨髓，无支架不能承担应力且无法按照特定结构规范修复，生成的关节软骨缺乏正常的结构。而采用了本发明的脱钙骨关节软骨再生用支架，使释放的骨髓经过支架中的脱钙皮质骨孔道渗入脱钙松质骨中，既增加了修复早期的修补处的机械强度，修补处的机械应力有可按缺损形状三维立体的调控骨髓修复作用。

实施例2

关节软骨修复再生用支架的制备方法：

制备流程图如图3所示，购置深低温冻存人髂骨或椎体骨，浸泡于0.1M-1MEDTA脱钙液中，脱钙液的温度为6℃内，pH为8，利用螯合脱去皮质骨中的钙，脱钙液每日更换。用去离子水配制EDTA脱钙液，用塑料容器盛载。每日换下的脱钙液用原子吸收分光光度计检测钙离子浓度以监测脱钙进程，当脱钙液中的Ca螯合物浓度＜0.5g/L，即为完全脱钙，脱钙后的标本进行x线和CT检测，证明完全脱钙。由于脱钙皮质骨表面结构过于致密，不宜于细胞的长入。因此本发明通过激光钻孔技术如图2所示，将脱钙皮质骨水平表面以0.5mm的直径垂直钻孔，钻孔采用激光钻孔，(实验兔动物模型上与临床病人应用孔径有所不同，因为人、兔的关节大小不同，所以孔径和孔距都不同)，比较后设定孔间间隔2mm，然后，如图3所示，将激光钻孔脱钙松质-皮质骨支架剪裁成一定的大小规格，冷冻贮存。在移植前，制备的激光钻孔的脱钙松质-皮质骨支架进行钴60照射18小时消毒。

参见图4，激光钻孔脱钙松质-皮质骨软骨关节再生用支架松质骨部分的结构扫描电镜图。可见脱钙松质骨中胶原纤维疏松交错排列，胶原纤维间充满空隙，孔隙结构交错相通，有利于骨髓基质和因子的渗入及细胞的附着。脱钙皮质骨天然片层样，有几点优势：1.胶原结构可对抗铅垂方向牵引力和压力，有利于软骨再生支架固定于软骨缺损。2.片层间的间隙有利于骨髓基质和因子的渗入及细胞的附着；有利于细胞营养物质的交换。

在动物模型上进行修补软骨缺损实验的手术过程

为验证本发明的关节软骨修复再生用支架在修补方法中的效果，在动物模型上进行了模拟手术实验。选择2.5-3.0kg的新西兰大耳白兔，麻醉，备皮，消毒，如图5所示，切口膝关节露出股骨滑车，在股骨滑车上做4mm直径，1.5mm深的缺损，在软骨下骨钻孔微骨折处理后，在已消毒好的激光钻孔脱钙松质-皮质骨支架修成4mm直径，高度1.5mm的圆柱体，填充入缺损。分层缝合伤口，术后12周取材，进行组织学的观察。

图6为新西兰大耳白兔使用激光钻孔脱钙松质-皮质骨关节软骨修复再生用支架进行软骨修复12周后的大体图。在大体标本上可见箭头所指的修复处，已呈现软骨样改变，和周围正常组织极为相似，与正常软骨的交界处已不明显，未出现缝隙。未见明显免疫炎症反应。

参见图7、图8和图9的新西兰大耳白兔激光钻孔脱钙松质-皮质骨关节软骨再生用支架进行软骨修复12周后的组织学切片染色。可见箭头所指的修复处的脱钙松质-皮质骨支架已完全被新生的透明软骨所替代，修复处未出现塌陷，与图右侧的正常软骨的交界处紧密接合，界线模糊。由于早期观察软骨下骨还未被骨替代，呈现软骨样组织。未见巨噬细胞等炎症细胞浸润，未见明显免疫炎症反应。新生组织HE染色图如图7；新生组织甲苯胺蓝染色(特异性针对软骨基质中粘多糖成分)阳性如图8；新生组织II型胶原免疫组织化学染色阳性如图9，证明新生组织富含II型胶原为类似正常软骨组织的透明软骨。

本发明的激光钻孔的脱钙骨关节软骨再生用支架是运用同种异体人的脱钙的皮质骨和松质骨制备的，采用激光钻孔的脱钙松质-皮质骨关节软骨再生用支架修复时，操作简便，易于临床应用。而且使用本发明的关节软骨修复再生用支架可以解决异体移植排斥反应的缺点，修复时自体骨髓不仅提供自体干细胞，同时提供细胞生存的微环境，比单纯软骨细胞或干细胞移植有更高的细胞生存率。本发明方法运用同种异体的脱钙人骨支架解决人工合成支架的生物相容性问题。通过生物力学测试表明制备的脱钙骨支架的机械应力和弹性模量更接近于软骨，解决了蚕丝、胶原蛋白、纤维蛋白、人羊膜等天然生物材料支架机械力学差，无法抵抗关节运动时产生的机械应力的问题。不会造成修补处的塌陷，也同时可支持材料上细胞的生长。而且脱钙松质-皮质骨关节软骨再生用支架是使用人的脱钙松质-皮质骨，本身富含骨形态蛋白(BMPs)，可促进诱导支架中的骨髓中间的干细胞或骨髓基质细胞转化成软骨细胞或骨细胞，促进干细胞分泌软骨或骨基质的分泌。对软骨修复的启动、发育、调控及塑形均有重要作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。