一种孜然种子中有效部位的制备方法

摘要

本发明涉及一种孜然种子有效部位的制备方法，该方法通过回流提取和快速制备色谱技术得到具有生物活性的有效部位，该有效部位能有效抑制脂肪酸合酶活性，为维吾尔药食两用植物孜然的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依据。该方法制备过程简单，所得有效部位抑制脂肪酸合酶活性高，热稳定性好，易于扩大规模生产，降低生产成本，是制备生物活性部位理想方法之一。通过该方法获得的有效部位作为制备食品、药品添加剂的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及一种孜然种子中有效部位的制备方法，通过该方法获得的有效部位具有抑制脂肪酸合酶活性。

背景技术

20世纪以来，肥胖已成为世界性的疾患，且和高血脂，脂肪肝，II型糖尿病等重大疾病关系密切。2000年Loftus等人报道用脂肪酸和酶(FAS)抑制剂显著降低肥胖小鼠的摄食量和体重，其机制为以丙二酸单酰辅酶A为中介抑制下丘脑进食激素NPY表达。提出FAS和动物进食控制密切相关，是治疗肥胖症新的潜在靶点(T.Loftus et al.Science，2000)。此后该酶迅速受到人们关注，相关研究进入快速发展。而近年研究表明，脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FAS)在肿瘤组织中高表达，而在正常组织中含量较低。FAS作用的产物是肿瘤细胞增殖的物质和能量来源，提示FAS可成为肿瘤治疗的靶点。因此从天然产物中寻找一种高效低毒的脂肪酸合酶抑制剂成为了广大科研工作者的目标。

孜然(Cuminum cyminum L.)属于伞形科(umbellifereae)，孜然芹属，在新疆有悠久的生长历史，是维吾尔医常用药材，据文献记载，孜然味辛、性温.具有散寒止痛、理气调中的功效，主治脘腹冷痛、消化不良、寒疝坠痛、月经不调。虽然孜然药用历史悠久，但其功能因子尚不明确。

本发明提供一种孜然种子中有效部位的制备方法，该方法通过回流提取和快速制备色谱技术得到具有抑制脂肪酸合酶的有效部位，为维吾尔药食两用植物孜然的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依据。该方法制备过程简单，所得有效部位抑制脂肪酸合酶活性高，热稳定性好，易于扩大规模生产，降低生产成本，是制备生物活性部位理想方法之一。通过该方法获得的有效部位作为制备食品、药品添加剂的用途。

发明内容

本发明目的在于，提供一种孜然种子中有效部位的制备方法，该方法通过回流提取和快速制备色谱技术得到具有生物活性的有效部位，该有效部位能有效抑制脂肪酸合酶活性，为维吾尔药食两用植物孜然的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依据。该方法制备过程简单，所得部位抑制脂肪酸合酶活性高，热稳定性好，易于扩大规模生产，降低生产成本，是制备生物活性部位理想方法之一。通过该方法获得的有效部位作为制备食品、药品添加剂的用途。

本发明所述的一种孜然种子中有效部位的制备方法，按下列步骤进行：

a、将孜然种子使用粉碎机粉碎后，用石油醚室温下浸泡脱脂3次，每次6h；

b、将步骤a浸泡脱脂后的孜然种子晾干，用浓度为60-90％乙醇水溶液热提，温度为65℃，提取3次，提取时间每次4h，收集提取液；

c、将步骤b得到的提取液合并，减压蒸馏除去溶剂后得到孜然种子提取浸膏；

d、将步骤c提取浸膏用蒸馏水分散，再依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，即可得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；

e、将步骤d中乙酸乙酯部位，用甲醇溶解，硅胶拌样后，利用快速制备色谱技术，洗脱剂使用氯仿-甲醇体系梯度洗脱，再将得到的洗脱部分进行抑制脂肪酸合酶活性实验以确定洗脱部分抑制脂肪酸合酶活性。

步骤a、d和e中使用的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿和甲醇均为分析纯。

步骤b中乙醇浓度为70-80％。

步骤e洗脱剂氯仿-甲醇体系中甲醇体积分数为0-100％。

本发明所述的方法，在经过选用浓度70％乙醇提取浸膏中，测定正丁醇部位109.24ug/ml的活性欠佳，二氯甲烷部位＞250ug/ml没有活性；石油醚部位＞250ug/ml没有活性；乙酸乙酯部位33.51ug/ml活性最好。依据脂肪酸合酶活性检测结果，选择乙酸乙酯部位抑制脂肪酸合酶活性最好。

具体实施方式

实施例1

将孜然种子5.3kg粉碎后，用石油醚于室温下浸泡脱脂3次，每次时间为6h；

将浸泡脱脂后的孜然种子5kg晾干，用浓度为70％乙醇水溶液热提，温度为65℃，提取3次，时间为每次4h，收集提取液；

合并提取液，减压蒸馏除去溶剂后得到孜然种子取浸膏852g；

将提取浸膏用蒸馏水分散，再依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯各萃取3次，得到石油醚部位39g，二氯甲烷部位20g和乙酸乙酯部位55.6g，正丁醇部55g；

将乙酸乙酯部位，用甲醇溶解，硅胶拌样后，利用快速制备色谱技术，洗脱剂使用氯仿洗脱(甲醇体积分数为0)，再将得到的洗脱部分进行抑制脂肪酸合酶活性实验来测定洗脱部分抑制脂肪酸合酶的活性。

实施例2

将孜然种子5.3kg粉碎后，用石油醚于室温下浸泡脱脂3次，每次时间为6h；

将浸泡脱脂后的孜然种子5kg晾干，用浓度为70％乙醇水溶液热提，温度为65℃，提取3次，时间为每次4h，收集提取液；

合并提取液，减压蒸馏除去溶剂后得到孜然种子取浸膏852g；

将提取浸膏用蒸馏水分散，再依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯各萃取3次，得到石油醚部位39g，二氯甲烷部位20g和乙酸乙酯部位55.6g，正丁醇部55g；

将乙酸乙酯部位，用甲醇溶解，硅胶拌样后，利用快速制备色谱技术，洗脱剂依次用氯仿，氯仿-甲醇体系(甲醇体积分数为4.9％)梯度洗脱，再将得到的洗脱部分进行抑制脂肪酸合酶活性实验以测定洗脱部分抑制脂肪酸合酶的活性。

实施例3

将孜然种子5.3kg粉碎后，用石油醚于室温下浸泡脱脂3次，每次时间为6h；

将浸泡脱脂后的孜然种子5kg晾干，用浓度为70％乙醇水溶液热提，温度为65℃，提取3次，时间为每次4h，收集提取液；

合并提取液，减压蒸馏除去溶剂后得到孜然种子取浸膏852g；

将提取浸膏用蒸馏水分散，再依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯各萃取3次，得到石油醚部位39g，二氯甲烷部位20g和乙酸乙酯部位55.6g，正丁醇部55g；

将乙酸乙酯部位，用甲醇溶解，硅胶拌样后，利用快速制备色谱技术，洗脱剂使用氯仿、氯仿-甲醇体系甲醇体积分数为4.9％，再用氯仿-甲醇体系(甲醇体积分数为14.9％)梯度洗脱，再将得到的洗脱部分进行抑制脂肪酸合酶活性实验以测定洗脱部分抑制脂肪酸合酶的活性。

实施例4

将孜然种子5.3kg粉碎后，用石油醚于室温下浸泡脱脂3次，每次时间为6h；

将浸泡后的孜然种子5kg晾干，用浓度为70％乙醇水溶液热提，温度为65℃，提取3次，时间为每次4h，收集提取液；

合并提取液，减压蒸馏除去溶剂后得到孜然种子取浸膏852g；

将提取浸膏用蒸馏水分散，再依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯各萃取3次，得到石油醚部位39g，二氯甲烷部位20g和乙酸乙酯部位55.6g，正丁醇部55g；

将乙酸乙酯部位，用甲醇溶解，硅胶拌样后，利用快速制备色谱技术，洗脱剂使用氯仿，氯仿-甲醇体系甲醇体积分数为4.9％、14.9％，再用氯仿-甲醇体系(甲醇体积分数为35.1％)梯度洗脱，再将得到的洗脱部分进行抑制脂肪酸合酶活性实验以测定洗脱部分抑制脂肪酸合酶的活性。

实施例5

将孜然种子5.3kg粉碎后，用石油醚于室温下浸泡脱脂，浸泡3次，每次时间为6h；

将浸泡后的孜然种子5kg晾干，用浓度为70％乙醇水溶液热提，温度为65℃，提取3次，时间为每次4h，收集提取液；

合并提取液，减压蒸馏除去溶剂后得到孜然种子取浸膏852g；

将提取浸膏用蒸馏水分散，再依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯各萃取3次，得到石油醚部位39g，二氯甲烷部位20g和乙酸乙酯部位55.6g，正丁醇部55g；

将乙酸乙酯部位，用甲醇溶解，硅胶拌样后，利用快速制备色谱技术，洗脱剂依次用氯仿、氯仿-甲醇体系甲醇体积分数为4.9％、14.9％、35.1％，再用氯仿-甲醇体系甲醇体积分数为64.9％的洗脱剂梯度洗脱，再将最终得到的洗脱部分进行抑制脂肪酸合酶活性实验以测定洗脱部分抑制脂肪酸合酶的活性。

实施例6

将孜然种子5.3kg粉碎后，用石油醚于室温下浸泡脱脂3次，每次时间为6h；

将浸泡后的孜然种子5kg晾干，用浓度为70％乙醇水溶液热提，温度为65℃，提取3次，时间为每次4h，收集提取液；

合并提取液，减压蒸馏除去溶剂后得到孜然种子取浸膏852g；

将提取浸膏用蒸馏水分散，再依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯各萃取3次，得到石油醚部位39g，二氯甲烷部位20g和乙酸乙酯部位55.6g，正丁醇部55g；

将乙酸乙酯部位，用甲醇溶解，硅胶拌样后，利用快速制备色谱技术，洗脱剂依次使用氯仿，氯仿-甲醇体系甲醇体积分数为4.9％、14.9％、35.1％、64.9％，再用甲醇(甲醇体积分数为100％)梯度洗脱，再将最终得到的洗脱部分进行抑制脂肪酸合酶活性实验以测定洗脱部分的脂肪酸合酶抑制活性。

实施例7

活性测定

活性测定原理：

测活体系介绍：

原酶50μl(保存于-20℃，使用前室温解冻1小时以上)，用测活缓冲液按所需倍数稀释(一般为15或20倍)后，在室温下稳定1小时以上。

1m M PH＝7.0K-Pi缓冲液       40ml

0.1M乙二胺四乙酸二钠盐       4ml

双蒸水                       320ml

脂肪酸合酶的活性测定体系总体积为2ml，将缓冲液1.8ml，乙酰辅酶A 25μl，丙二酰辅酶A 50μl，烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸50μl依次加入比色杯中，在340nm下连续测定烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的浓度变化。

先测定全反应活力，并以此为酶活力的标准值，最后依次改变加入样品的量，得到一系列的活力值，依此得到酶与抑制剂结合后的剩余活力，绘制抑制浓度-剩余活力值曲线，根据此曲线算出半抑制浓度IC₅₀值见表；

表：

从表中可以看出：氯仿和甲醇体积分数为4.9％的洗脱部位抑制脂肪酸合酶效果最佳。

60-90％不同浓度乙醇水溶液浸膏的抑制脂肪酸合酶活性的活性测试结果如下表所示：

表：

由此表可以看出：70％浓度乙醇浸膏抑制脂肪酸合酶活性结果最好。