L-岩藻糖α1→6特异性凝集素

摘要

本发明公开了一种新型凝集素，其可以特异性地结合到L-岩藻糖α1→6糖链。本发明还公开了该凝集素的用途。本发明L-岩藻糖α1→6特异性凝集素的特征在于：(1)该凝集素提取自担子菌或子囊菌，(2)该凝集素具有4,000-40,000的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分子量，和(3)该凝集素对L-岩藻糖α1→6糖链具有亲和力，该亲和力由1.0×10

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素，及其制备方法，以及其应用。特别地，本发明涉及一种新型的得自担子菌或子囊菌的凝集素，及其制备方法，以及使用该凝集素检测和分别糖链的方法。

背景技术

人们公知的是，α1→6岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的表达与肝细胞的癌变是一致的，α1→6岩藻糖基转移酶将L-岩藻糖残基经由α1→6链合转移到N-联聚糖的还原端N-乙酰葡糖胺上从而形成中心岩藻糖基化。当前，肝细胞癌使用对中心岩藻糖基化的单和双叉N-葡聚糖具有亲和力的小扁豆凝集素(LCA)通过凝集素亲和力电泳检测。

抗体依赖性细胞毒性(以下称为ADCC活性)是一种人体自带的免疫功能。ADCC活性是一种经由抗体例如天然杀伤细胞和单核细胞的粒性白细胞经由其杀死例如癌细胞的靶细胞的活性。ADCC活性与通过例如作为人源化抗体的赫赛汀(转移乳腺癌治疗剂)和作为嵌合抗体的B细胞单克隆抗体(非Hodgkin淋巴瘤治疗剂)(非专利文献1)的抗体医疗药物对抗肿瘤的抗肿瘤机理相关。当这些抗体医疗药物具有较低ADCC活性时，就需要较大的抗体医疗药物的使用量，这将同时导致例如成本和副作用(即，免疫低下引起的感染)增加的问题。

在转移了α1→6L-岩藻糖的抗体和未转移L-岩藻糖的抗体之间，ADCC活性相差50-200倍(非专利文献2)。如果可以得到未转移L-岩藻糖的抗体，就可以提供具有高ADCC活性的抗体制品。

一般地，除LCA外，其他已知的中心岩藻糖结合的凝集素有例如豌豆凝集素(PSA)，橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)，黄水仙凝集素(NPA)，蚕豆凝集素(VFA)，和米曲霉凝集素(AOL)(专利文献1-5)。非专利文献1：Clynes RA等，Inhibitory Fc receptors modulate in vivocytoxicity against tumor targets.NATURE MED 2000 APR；6(4)：443-446非专利文献2：Toyohide Shinkawa等，The absence of L-fucose but notthe presence of galactose or bisecting N-acetyl glucosamine of human IgG1complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancingantibody-dependent cellular cytotoxicity.J Biol Chem.2003年1月31日；278(5)：3466-73.Epub 2002年11月8日。专利文献1：WO2002/030954专利文献2：WO2003/084569专利文献3：特开平H02-083337的实施例专利文献4：特开2002-112786的实施例5专利文献5：特开2007-161633

发明公开

已知用于L-岩藻糖α1→6糖链检测的凝集素还对L-岩藻糖α1→6连接糖链以及具有除α1→6连接的L-岩藻糖的糖脂糖链和不具有L-岩藻糖的高甘露糖糖链有亲和力。特别地，AAL和AOL还对例如α1→2L-岩藻糖和α1→3L-岩藻糖具有亲和力。甘露糖特异的LCA，PSA和VFA还对非岩藻糖基化的单和双叉N-葡聚糖具有亲和力。因此，L-岩藻糖α1→6糖链的精确检测是不可能的，同时分离L-岩藻糖α1→6糖链也是不可能的。目前只对L-岩藻糖α1→6糖链特异性结合的凝集素是未知的。

综上所述，本发明的一个目的是提供一种新型的凝集素，其可以特异性地结合到L-岩藻糖α1→6糖链。本发明可以提供一种相比传统方法更精确的使用新型凝集素检测L-岩藻糖α1→6糖链的方法，以及一种基于L-岩藻糖α1→6糖链检测的分离L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖α1→6糖链的方法。

本发明发明人发现了一种新型的凝集素，其具有对具有L-岩藻糖α1→6的糖链很高的亲和力。发明人发现，该新型凝集素可以特异性地检测L-岩藻糖α1→6糖链，并且该凝集素可以用于L-岩藻糖α1→6糖链或非L-岩藻糖α1→6糖链(L-岩藻糖α1→2，1→3，1→4糖链)的提纯。术语“L-岩藻糖α1→6糖链”指的是一种结构，在该结构中，L-岩藻糖通过一个α1→6键连接于N-联聚糖还原末端的N-乙酰葡萄糖胺。术语“非L-岩藻糖α1→6糖链”指的是在分子中不具有α1→6连接的L-岩藻糖的糖。

特别地，本发明发明人提供了一种L-岩藻糖α1→6特异性凝集素：(1)其得自于担子菌类或子囊菌，(2)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳其具有4,000-40,000的分子量，和(3)其对L-岩藻糖α1→6糖链具有缔合常数为1.0×10⁴M^-1或更高(25℃时)的亲和力。这里的缔合常数指的是在25℃的试验温度下通过正面亲和色谱(FAC)测定的数值。

L-岩藻糖α1→6糖链可以包括唾液N-聚糖。

此外，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素(4)优选地基本上不与不包含L-岩藻糖α1→6糖链的高甘露糖糖链和/或糖脂结合。

此外，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素优选地(5)对α1→6岩藻糖基化的、单、双、三和四叉N-聚糖具有1.0×10⁴M^-1或更高(25℃时)缔合常数的亲和力。

担子菌属于例如球盖茹科、口蘑科、捕蝇蕈科或多孔菌科。

担子菌是例如土生环锈伞，翅磷伞，多脂鳞伞，大球盖菇，亚砖红沿丝伞，花脸香蘑，或毒蝇伞。

特别地，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素(6)的氨基酸序列显示在序列号1中。

本发明还提供了L-岩藻糖α1→6特异性凝集素，其是(a)包括显示在序列号2-5的任一序列中的氨基酸序列的蛋白质或肽，或(b)其中显示在序列号2-5的任一序列中的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被删除，插入或取代的蛋白质或肽，并且这些蛋白质或肽与具有显示在序列号2-5中的任一氨基酸序列是功能相当的。术语“功能相当”指的是对L-岩藻糖α1→6糖链具有缔合常数为1.0×10⁴M^-1或更高(25℃时)的亲和力。

显示在(b)中的蛋白质或肽具有例如序列号6显示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种L-岩藻糖α1→6特异性凝集素，其是与显示在序列号2-6的任一序列中的氨基酸序列具有至少37％的同源性，并且与具有显示在序列号2-6的任一序列中的氨基酸序列的蛋白质或肽功能相当的蛋白质或肽。

本发明还提供了一种L-岩藻糖α1→6特异性凝集素的制备方法，通过该方法，担子菌和/或子囊菌的水性介质提取物(水溶性提取物)可以应用于(i)疏水色谱和反相色谱，(ii)亲合色谱，或(iii)离子交换色谱和凝胶过滤，从而可以获得凝集素，该凝集素(vi)具有4,000-40,000的由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量，和(v)对L-岩藻糖α1→6糖链具有缔合常数1.0×10⁴M^-1或更高(25℃时)的亲和力。

担子菌优选地选自至少球盖茹科，口蘑科，捕蝇蕈科，多孔菌科的一种。

担子菌优选地至少是选自土生环锈伞，翅鳞伞，多脂鳞伞，大球盖菇，亚砖红沿丝伞，花脸香蘑，或毒蝇伞的一种。

L-岩藻糖α1→6特异性凝集素制备方法中使用的担子菌和/或子囊菌优选地是子实体柄(子实体)。

本发明还提供了一种检测L-岩藻糖α1→6糖链的方法，包括使糖链作用于L-岩藻糖α1→6特异性凝集素的步骤。

糖链例如是一种肿瘤标记物。

本发明还提供了一种分别L-岩藻糖α1→6糖链的方法，包括使糖链作用于L-岩藻糖α1→6特异性凝集素的步骤。特别地，本发明提供了一种通过使用固定化的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素分别L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖α1→6糖链的方法。

分别方法中作用的糖链例如与抗体结合。

本发明还提供了一种检测L-岩藻糖α1→6糖链的诊断剂和诊断剂试剂盒。该诊断剂包括作为活性成分的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素。

本发明的新型凝集素相比传统凝集素对具有L-岩藻糖α1→6的糖链、糖肽和糖蛋白具有缔合常数为1.0×10⁴M^-1或更高的亲和力。特别地，只有具有L-岩藻糖α1→6的糖链可以被特异性地识别。使用该特异性，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素可以用于下面所示的各种应用。

与具有对L-岩藻糖α1→6糖链的亲和力的传统凝集素大不相同的是，本发明可以以更加选择特异性的方式检测α1→6L-岩藻糖糖链。

本发明提供了分别L-岩藻糖α1→6糖链的方法，其基于α1→6L-岩藻糖的精确识别，L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖α1→6糖链之间的严格分别。因此，L-岩藻糖α1→6糖链或非L-岩藻糖α1→6糖链可以以高纯度提纯。特别地，通过使用本发明的分别方法从包括L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖α1→6糖链混合物的抗体制品中除去L-岩藻糖α1→6糖链，抗体医疗药物可以具有增强的ADCC活性。因此，可以以减少的剂量制得抗体制品，从而实现例如成本的降低和副作用的减少。此外，抗体制品还可以根据症状和副作用进行配药。

附图简要说明

附图1是本发明操作实施例和对照实施例中所用的α1→6L-岩藻糖低聚糖和非α1→6L-岩藻糖低聚糖的结构图。附图2是本发明操作实施例和对照实施例中所用的L-岩藻糖α1→6低聚糖和非L-岩藻糖α1→6低聚糖的结构图。附图3表明了实施例1中PTL的提纯过程。附图4是实施例1的PTL离子交换色谱的洗脱图。附图5是实施例1的PTL亲合色谱的洗脱图。附图6表明了实施例1的PTL的SDS-PAGE结果(照片作为图画的替代)附图7表明了实施例2的SRL的提纯过程。附图8是实施例2的SRL的疏水色谱的洗脱图。附图9是实施例2的SRL的反相色谱的洗脱图。附图10图示了实施例2的SRL的SDS-PAGE结果(照片作为图画的替代)。附图11图示了实施例1的PTL的MS光谱的结果。附图12图示了实施例2的SRL的MS光谱的结果。附图13图示了使用实施例1的PTL的西式印迹法的结果(照片作为图画的替代)。附图14图示了使用实施例1的SRL的西式印迹法的结果(照片作为图画的替代)。附图15图示了使用对照实施例1的AAL的西式印迹法的结果(照片作为图画的替代)。附图16图示了使用对照实施例2的AOL的西式印迹法的结果(照片作为图画的替代)。附图17图示了使用对照实施例3的LCA的西式印迹法的结果(照片作为图画的替代)。附图18图示了当只有蛋白质由作为对照的CBB染色时的结果(照片作为图画的替代)。附图19图示了使用实施例1的PTL的ELISA糖蛋白检测结果。附图20图示了使用实施例2的SRL的ELISA糖蛋白检测结果。附图21图示了使用对照实施例1的AAL的ELISA糖蛋白检测结果。附图22图示了使用对照实施例2的AOL的ELISA糖蛋白检测结果。附图23图示了使用对照实施例3的LCA的ELISA糖蛋白检测结果。附图24图示了糖链中α-胎蛋白L1和L3之间不同的使用实施例1的PTL的ELISA检测结果。附图25图示了糖链中α-胎蛋白L1和L3之间不同的使用实施例2的SRL的ELISA检测结果。附图26图示了糖链中α-胎蛋白L1和L3之间不同的使用对照实施例1的AAL的ELISA检测结果。附图27图示了糖链中α-胎蛋白L1和L3之间不同的使用对照实施例2的AOL的ELISA检测结果。附图28图示了糖链中α-胎蛋白L1和L3之间不同的使用对照实施例3的LCA的ELISA检测结果。附图29图示了实施例3的NSL的提纯过程。附图30是实施例3的NSL疏水色谱洗脱图。附图31是实施例3的NSL反相色谱洗脱图。附图32图示了实施例3的NSL的SDS-PAGE结果(照片作为图画的替代)。附图33图示了实施例4的LSL的提纯过程。附图34是实施例4的LSL疏水色谱洗脱图。附图35是实施例4的LSL反相色谱洗脱图。附图36图示了实施例4的LSL的SDS-PAGE结果(照片作为图画的替代)。附图37图示了实施例3的NSL的MS光谱结果。附图38图示了实施例4的LSL的MS光谱结果。

实现发明的最佳模型

下面的内容将给出一个L-岩藻糖α1→6特异性凝集素结合的L-岩藻糖α1→6糖链的例子。

[化学式1][在化学式中，Man意思是甘露糖，GlcNAc意思是N-乙酰葡萄糖胺，Fuc意思是L-岩藻糖。]

除了上面那个，L-岩藻糖α1→6糖链包括例如游离低聚糖，糖基氨基酸复合物，糖肽，糖脂，糖蛋白，蛋白多糖，和细胞。此外，L-岩藻糖α1→6糖链还可以例如是由CyDye，4-乙基氨基苯甲酸酯(ABEE)，和氨基吡啶荧光标记的。N联糖链包括例如高甘露糖型的，复合物型的，杂合型的。此外，N联糖链还可以例如是糖链部分被酸或肼分解所得的，或唾液酸酶，半乳糖苷酶，N-乙酰氨基己糖苷酶，岩藻糖苷酶和甘露糖苷酶的任何酶同时或分步部分分解糖链所得的糖链。任选地，N连接的糖链还可以是通过向糖链加入例如葡萄糖的糖或例如乙酰基，硫酸基，或磷酸基的功能基团而获得的糖链。

(1)获得L-岩藻糖α1→6特异性凝集素的担子菌或子囊菌属于例如球盖茹科，口蘑科，多孔菌科，捕蝇蕈科。球盖茹科包括例如土生环锈伞，大球盖菇，亚砖红沿丝伞，翅鳞伞属，多脂鳞伞，和多脂鳞伞。口蘑科包括例如花脸香蘑。多孔菌科包括例如勺形囊孔菌和褐芝小孔菌。捕蝇蕈科包括例如毒蝇伞。在这些担子菌或子囊菌中，从凝集素回收效率和糖结合特异性的观点看，球盖茹科，口蘑科或捕蝇蕈科是特别优选的。更优选地担子菌或子囊菌是土生环锈伞，翅鳞伞，多脂鳞伞，大球盖菇，亚砖红沿丝伞，花脸香蘑，或毒蝇伞。

L-岩藻糖α1→6特异性凝集素具有(2)SDS-PAGE上4,000-40,000，优选地4,000-20,000的分子量。SDS-PAGE测定的分子量是由例如Laemmi法测定的(Nature，第227卷，第680页，1976年)。

L-岩藻糖α1→6特异性凝集素具有(3)对L-岩藻糖α1→6糖链缔合常数(Ka)为1.0×10⁴M^-1或更高，优选地1.0×10⁵M^-1或更高，更优选地1.0×10⁶M^-1或更高的亲和力。特别地，当L-岩藻糖α1→6特异性凝集素与传统已知的对L-岩藻糖α1→6有亲和力的AAL，AOL，LCA，NPA，和PSA相比，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素具有显著较高的缔合常数。这意味着，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素相比传统凝集素以更高的选择性结合到L-岩藻糖α1→6糖链。

L-岩藻糖α1→6糖链可以在它的非还原端具有唾液酸。传统中心岩藻糖特异性凝集素(例如，LCA，NPA，和PSA)具有对还原端具有唾液酸的L-岩藻糖α1→6糖链较低的亲和力。另一方面，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素在对上述糖链具有高亲和力方面优于传统凝集素。

下面的内容将描述一种通过正面亲和色谱法(FAC)计算缔合常数的方法。该发明基于以下原理。当固定浓度荧光标记糖链的稀释液(例如，附图1和2中所示的)流过固定有凝集素的柱时，糖链会在凝集素和糖链不发生相互作用的短时间内从柱流出。然后，会立即观察到洗脱的前端(前面)。当其中与凝集素有亲和力时，那么糖链的洗脱就会延迟。

装置中所用凝集素柱的制备以下面所述的方法实现。1、将提纯的凝集素溶解于0.1-0.2M NaHCO3缓冲溶液中(pH 8.3-8.5)。2、经由凝集素一级氨基，例如NHS活化琼脂糖的载体将凝集素固化。3、然后，通过包含例如伯胺或乙醇胺的三羟甲基氨基甲烷缓冲液将凝集素阻滞。4、将岩藻糖-琼脂糖悬浮于10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，其包含0.8％NaCl(pH 7.4，TBS)。然后，将凝集素固定的树脂装入微型柱(φ2mm×10mm，31.4μl)。5、用支架将装有凝集素固定的树脂的微型柱进行保护，并且将凝集素柱连接到FAC自动分析装置(FAC-1，SHIMADZU公司)。

为了平衡凝集素柱，将通过分析缓冲液(10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液，包含0.8％NaCl(pH 7.4，TBS))稀释而具有显著低于凝集素解离常数(Kd)浓度(2.5nM)的吡啶基氨化糖链(PA糖链)以0.125ml/min的流速倒入300μl。然后，通过荧光检测器(激发波长/荧光波长：310nm/380nm)检测来自柱的PA糖链的洗脱物。

基于检测数据，通过使用与凝集素不发生相互作用的糖链(PA鼠李糖)的洗脱物前端(Vo)作为参照，与凝集素相互作用的糖链的前端(V)的延迟(V-Vo)计算作为干扰强度。然后，基于以下FAC标准公式，糖链和凝集素之间的缔合常数(Ka)基于V-Vo和Bt进行计算。如果干扰强度(V-Vo值)和缔合常数较高，那么凝集素和L-岩藻糖α1→6糖链之间的亲和力较高。

[公式1]$K_d=\frac{\left[A\right]\left[B\right]}{\left[\mathrm{AB}\right]}=\frac{B_t}{V-V_o}-\left[A\right].---\left(1\right)$$\frac{1}{{\left[A\right]}_o(V-V_o)}=\frac{K_d}{B_t}·\frac{1}{{\left[A\right]}_o}+\frac{1}{B_t}---\left(2\right)$$K_d=\frac{\left[A\right]\left[B\right]}{\left[\mathrm{AB}\right]}=\frac{B_t}{V-V_o}---\left(3\right)$[在公式中，A意思是用于洗脱的物质，Ao意思是物质A的起始浓度，B意思是固定化配基，V意思是洗脱体积，Vo意思是不与固定化配基B相互作用的物质的洗脱前端体积，Bt意思是有效配基量，Kd意思是电离常数(缔合常数的倒数)。]

凝集素的糖结合特异性还可以通过使用红细胞确认，红细胞可以被凝集素特异性地凝集从而研究可以抑制红细胞凝集及其浓集的糖类型，

此外，L-岩藻糖特异性凝集素是(4)优选地基本上不与高甘露糖糖链和/或糖脂结合的，不包括L-岩藻糖α1→6糖链。因而，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素具有较高的结合特异性。术语“基本上不结合”这里指的是缔合常数为1.0×10³M^-1或更低，优选地缔合常数为1.0×10²M^-1或更低，特别优选地缔合常数为0

此外，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素(5)优选地对α1→6岩藻糖基化的，单、双、三、四叉N-葡聚糖具有亲和力。亲和力表现为缔合常数1.0×10⁴M^-1或更高(25℃时)，更优选地表现为缔合常数1.0×10⁵M^-1或更高。

对本发明的凝集素具有亲和力的α1→6岩藻糖基化的、单、双、三、四叉N-葡聚糖结构的例子如下所示。[化学式2]

特别地，本发明L-岩藻糖α1→6特异性凝集素具有序列号1所示的普通氨基酸序列。序列号1中的第4、第5、第6、第7个Xaa意思分别是天冬氨酸/天门冬酰胺/谷氨酸/苏氨酸，苏氨酸/丝氨酸/丙氨酸，酪氨酸/苯丙氨酸，谷氨酰胺/赖氨酸/谷氨酸，其中的斜杠意思是“或”。

本发明L-岩藻糖特异性凝集素的特殊例子是序列号1-6所示的蛋白质或肽。

序列号2所示的凝集素是可以从土生环锈伞提取的新型凝集素(后面称为PTL)。序列号2的第10和第17个Xaa可以是任何的氨基酸残基，优选地是半胱氨酸。第20、23、27、33、35和39个Xaa分别是酪氨酸/丝氨酸，苯丙氨酸/酪氨酸，精氨酸/赖氨酸/天门冬酰胺，天冬氨酸/甘氨酸/丝氨酸，天门冬酰胺/丙氨酸，和苏氨酸/谷氨酰胺。

序列号3所示的凝集素是一种可以从大球盖菇提取的新型凝集素(后面称为SRL)。序列号3的第10和第17个Xaa可以是任何氨基酸残基，优选地是半胱氨酸。第4、7、9、13、20、27、29、33、34和39个Xaa分别为脯氨酸/甘氨酸，谷氨酸/赖氨酸，缬氨酸/天冬氨酸，天门冬酰胺/天冬氨酸/谷氨酸，组氨酸/丝氨酸，赖氨酸/组氨酸，缬氨酸/天门冬酰胺/丝氨酸，丙氨酸/苏氨酸，和精氨酸/苏氨酸。

序列号4所示的凝集素是一种可以从花脸香蘑提取的新型凝集素(后面称为LSL)。序列号3的第10和第17个Xaa可以是任何氨基酸残基，优选地是半胱氨酸。第1、4、7、8、9、13、16、20、22、25、27、31和34个Xaa分别为丙氨酸/谷氨酰胺，脯氨酸/赖氨酸，丙氨酸/丝氨酸，蛋氨酸/异亮氨酸/缬氨酸，酪氨酸/苏氨酸，天冬氨酸/天门冬酰胺，赖氨酸/谷氨酰胺，丙氨酸/天门冬酰胺，缬氨酸/天冬氨酸/天门冬酰胺，天冬氨酸/天门冬酰胺，精氨酸/组氨酸/天门冬酰胺，谷氨酰胺/精氨酸，和苏氨酸/缬氨酸。

序列号5所示的凝集素是一种可以从亚砖红沿丝伞提取的新型凝集素(后面称为NSL)。序列号5的第10和第17个Xaa可以是任何氨基酸残基，优选地是半胱氨酸。第13、14和16个Xaa分别为天冬酰胺/苏氨酸，丝氨酸/丙氨酸，和谷氨酰胺/赖氨酸。

序列号6所示的凝集素是一种可以从亚砖红沿丝伞提取的新型凝集素(后面称为NSL)。序列号6显示了一种变异体，其中一个天门冬酰胺插入到了序列5的肽中。因而序列号6的第10和第18个Xaa可以是任何氨基酸残基，优选地是半胱氨酸。第14、15和17个Xaa分别为天冬酰胺/苏氨酸，丝氨酸/丙氨酸，和谷氨酰胺/赖氨酸。

由于序列2-6所示的蛋白质或肽是新的，因此本发明提供了一种L-岩藻糖α1→6特异性凝集素，其是(a)由任何序列2-5中所示的氨基酸序列组成的蛋白质或肽，或(b)其中任何序列2-5中所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被删除、插入或取代，并且与具有任何序列2-5中所示的氨基酸序列的蛋白质或肽功能相当的蛋白质或肽。术语“功能相当”在这里意思是对L-岩藻糖α1→6糖链具有缔合常数1.0×10⁴M^-1或更高的亲和力，优选地1.0×10⁵M^-1或更高，更优选地1.0×10⁶M^-1或更高。(b)中所示变异体的例子是序列号6所示的蛋白质或肽。

本发明还提供了一种基因，其编码了(a)由任何序列2-5中所示的氨基酸序列组成的蛋白质或肽，或(b)其中任何序列2-5中所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被删除、插入或取代，并且与具有任何序列2-5中所示的氨基酸序列的蛋白质或肽功能相当的蛋白质或肽。术语“功能相当”与上面的意思相同。

序列号2-6所示的蛋白质或肽之间的同源性至少为37％(参见表4)。因而，本发明还提供了一种L-岩藻糖α1→6特异性凝集素，其是与任何序列号2-6中所示的氨基酸序列具有至少37％或更高同源性，并且与与具有任何序列2-5中所示的氨基酸序列的蛋白质或肽功能相当的蛋白质或肽。术语“功能相当”与上面的意思相同。

L-岩藻糖α1→6特异性凝集素可以通过例如合适的已知提取方法、分离方法、和提纯方法的组合从担子菌和/或子囊菌分离出来。例如，一种方法可以是使用水性溶剂从而获得担子菌或子囊菌的水溶性提取物。从该提取物中，获得凝集素，其(vi)SDS-PAGE测得的分子量为4,000-40,000，优选地4,000-20,000，并且(v)具有表现为对L-岩藻糖α1→6糖链缔合常数1.0×10⁴M^-1或更高的亲和力，优选地1.0×10⁵M^-1或更高，更优选地1.0×10⁶M^-1或更高(25℃时)。

担子菌优选地选自球盖茹科，口蘑科，多孔菌科，和捕蝇蕈科中的至少一种。特别地，球盖茹科例如土生环锈伞(Pholiota terrestris Overholts)，翅鳞伞(Pholiota squarrosa(Fr.)Kummer)，多脂鳞伞(Pholiota adiposa(Fr.)Kummer)，大球盖菇(Stropharia rugosoannulata Farlow in Murr.)，亚砖红沿丝伞(Naematoloma sublateritium(Fr.)Karst或Hypholoma sublateritium(Fr.)Quel)，口蘑科例如花脸香蘑(Lepista sordida(Schum.：Fr.)Sing.)，多孔菌例如勺形囊孔菌(Trichaptum elongatum)，褐芝小孔菌(Microporusvernicipes)，捕蝇蕈科例如毒蝇伞(Amanita muscaria).在这些担子菌和/或子囊菌中，优选地使用子实体。

例如获得担子菌提取物的方法没有特别的限制，只要例如该方法可以使水性溶剂与担子菌的子实体接触就行。就提取效率的而言，例如使担子菌子实体在水性介质中粉末化从而获得悬浮液的方法是优选的。粉末化的方法可以是例如使用混合机或均质机的一般粉末化方法。

水性溶剂可以例如是缓冲溶液，或水或缓冲溶液与有机溶液的混合物，其可以与水相混合，优选地为缓冲溶液或有机溶液与缓冲溶液的混合物。

缓冲溶液没有特别的限制，可以是已知的缓冲溶液，其中在pH3-10范围内有缓冲作用的缓冲溶液是优选的，在pH6-8范围内有缓冲作用的缓冲溶液是更优选的。特别地，可以使用例如磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液，其中出于提取效率的观点，磷酸缓冲液是优选的。

缓冲溶液可以不具有特别限定的盐浓度。出于提取效率和缓冲作用的观点，盐浓度优选地为1-100mM，更有选地5-20mM。

缓冲溶液还可以包含盐。例如，磷酸缓冲溶液中进一步添加食用盐获得的磷酸缓冲生理盐水是本发明中优选的水性溶剂。

有机溶液可以是任何有机溶剂，其可以与水混合而没有任何限制，其中丙酮，甲醇，乙醇，2-丙醇，和乙腈是优选的。有机溶液优选地可以与水或缓冲溶液以10-40重量％的含量混合。

提取过程优选地还包括从例如水性溶液和担子菌子实体的混合物中除去水性介质的不溶性物质的过程。除去不溶性物质的方法可以是例如过滤或离心分离，出于除去效率的观点，离心分离是优选的。

提取过程优选地是例如将磷酸缓冲生理盐水中的担子菌子实体粉碎，通过离心分离除去不容性物质，从而获得水性溶液提取物的过程。

当使用任何以下提纯方法时，制备L-岩藻糖特异性凝集素的方法可以提供更有效的提纯。

(提纯方法)通过上述方法获得的水溶剂提取物经过硫酸铵沉淀法从而获得含有凝集素的成分。然后，所得凝集素成分通过疏水色谱和反相色谱提纯。

(提纯方法2)通过上述方法获得的水溶剂提取物使用载体经过亲和色谱，其中将甲状腺球蛋白固定到琼脂糖。

(提纯方法3)通过上述方法获得的水溶剂提取物经过硫酸铵沉淀法从而获得含有凝集素的成分，并且对含有凝集素的成分相对蒸馏水进行透析，并且低压冻干。此后，将粗凝集素成分溶解于三羟甲基氨基甲烷缓冲液，随后进过离子交换色谱。然后，将所得活性成分浓缩，并且随后通过凝胶过滤分离。

本发明的制备方法可以包括让通过提纯获得的包含凝集素的成分经过透析处理的步骤，让通过透析处理获得的凝集素溶液经过低压冻干的步骤。从而，可以轻易分离凝集素。透析步骤和低压冻干步骤可以通过常规使用的已知方法完成。

L-岩藻糖α1→6特异性凝集素既可以通过从天然植物中提取也可以通过不同于自然起源的宿主中的人工表达或化学合成而获得，其是(a)由任何序列2-5中所示的氨基酸序列组成的蛋白质或肽，或(b)其中任何序列2-5中所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被删除、插入或取代，并且与具有任何序列2-5中所示的氨基酸序列的蛋白质或肽功能相当的蛋白质或肽。上述物质也在本发明的技术范围内。宿主中的表达和化学合成可以通过常规使用的已知方法实现。

本发明还提供了一种使用L-岩藻糖α1→6特异性凝集素检测L-岩藻糖α1→6糖链的方法。L-岩藻糖α1→6凝集素相比传统情况中可以更加特异性地识别L-岩藻糖α1→6糖链，并且与之结合。因而，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素优选地用于特异性地检测包含L-岩藻糖糖链的糖链化合物，例如多糖，糖脂或糖蛋白。

检测方法中使用的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素优选地使用标记凝集素。本发明的标记凝集素至少包括一种L-岩藻糖α1→6特异性凝集素和一种标记法，并且标记凝集素被标记从而标记凝集素可以被检测。

标记法没有特别的限制，可以是已知的标记方法，包括例如，放射性核素标记或标记化合物的结合。

标记化合物没有特别的限制，可以是该用途常规使用的一种，包括例如，直接或间接标记化合物，酶，或荧光化合物。标记化合物的特定例子包括例如生物素，异羟洋地黄毒苷配基，辣根过氧化酶，异硫氰酸荧光素，或CyDye。

L-岩藻糖α1→6特异性凝集素优选地为得自担子菌的凝集素，特别优选地为PTL，SRL，NSL，LSL，和AML，更优选地为PTL和SRL。如例子中所示，PTL和SRL与传统L-岩藻糖特异性凝集素不同，其中PTL和SRL不与除了L-岩藻糖α1→6和不具有L-岩藻糖的高甘露糖链的L-岩藻糖结合。因而，PTL和SRL是用于本发明检测方法中最优的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素。

L-岩藻糖α1→6糖链的检测可以通过例如使用固定化的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素的凝集素色谱法实现。凝集素色谱法是使用了凝集素特异性地结合于糖链特性的亲和色谱法。当凝集素色谱法与HPLC(HPLAC)联合时，可以期望高流通量分析。

L-岩藻糖α1→6特异性凝集素固定的载体通常包括凝胶物质，例如琼脂糖，葡聚糖，纤维素，淀粉，或聚丙烯酰胺。这些凝胶物质可以是商业可得的，没有特别限定，包括例如，葡聚糖4B和葡聚糖6B(GE Healthcare Bioscience)。

凝集素色谱法中使用的柱包括其中凝集素被固定到微平板或纳米槽的柱。

固定的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素通常具有0.001-100mg/ml的浓度，优选地0.01-20mg/ml。当载体是琼脂糖凝胶时，载体可以被例如CNBr活化，随后与凝集素配对。凝集素还可以使用活化的间隔物固定到凝胶。任选地，凝集素还可以使用甲酰基固定到凝胶，随后通过NaCNBH₃还原。任选地，可以使用商业可得的活化的凝胶，例如NHS-琼脂糖(GE Healthcare Bioscience)。

将L-岩藻糖α1→6糖链样品应用于柱，然后出于清洗和平衡的目的让缓冲溶液流入其中。缓冲液的一个例子具有5-500mM的克分子浓度，优选地10-500mM，具有4.0-10.0的pH，优选地6.0-9.0，具有0-0.5M的NaCl含量，优选地0.1-0.2M，并且具有0-10mM的CaCl₂，MgCl₂，或MnCl₂含量，优选地0-5mM。

在不结合物质被缓冲液洗掉后，L-岩藻糖α1→6糖链被中性非变性缓冲溶液洗脱，缓冲溶液可以通过其中例如氯化钠或半抗原糖的吸收剂将糖链有效洗脱。该缓冲溶液还可以与上面的缓冲溶液相同。吸收剂具有优选地1-500mM的浓度，特别优选地10-200mM。

除了上述方法，糖链还可以通过例如色谱法，凝集素片，酶联免疫吸附测定(ELISA)，凝集法，例如系统的表面细胞质基因组共振法，或电泳法的本领域技术人员公知的方法检测。

包括糖链的样品没有特别限制。包括糖链的样品可以包括，例如，血，血浆，血清，眼泪，唾液，体液，乳汁，尿，细胞培养上清液，和转基因动物的分泌物。

作为检测方法对象的L-岩藻糖α1→6糖链的特定例子是α1→6岩藻糖基转移酶(FUT8)合成的糖链。L-岩藻糖α1→6糖链可以位于例如α-胎蛋白，α5β1-整联蛋白，TGFβ受体，或EGF受体中。检测方法中作用的糖链优选地为癌瘤标记物。

α1→6岩藻糖基化的α-胎蛋白的精确检测对于例如临床上复杂肝硬化的肝细胞癌的早期诊断，肝细胞癌的实时追踪观察，疗效的精确测定，胚组织瘤的早期检测，和爆发性肝炎中肝再生的指标是有用的。L-岩藻糖α1→6转移的α5β1-整联蛋白还可以作为肝癌诊断的指标。

本发明检测方法的对象除肝细胞外包括肿瘤(例如，前列腺癌，乳癌，胃癌，小肠癌，大肠癌，结肠直肠癌，肾细胞癌，胰腺癌，小细胞肺癌，非小细胞癌，子宫癌，卵巢癌，甲状腺癌，软组织肉瘤，骨癌，黑素瘤，恶性胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，急性的淋巴瘤，恶性淋巴瘤，何杰金病，非何杰金病，敏锐的骨髓性白血病，慢性的淋巴细胞性白血病)，变态反应疾病，自身免疫性疾病，和例如肺气肿的心血管疾病的诊断。

L-岩藻糖α1→6特异性凝集素是在例如对糖链的结合特异性的物理化学特性和生物化学特性上与传统已知凝集素不同的新型凝集素。特别地，由于L-岩藻糖α1→6特异性凝集素特异性地识别L-岩藻糖α1→6结合，因此L-岩藻糖α1→6特异性凝集素可以用作例如诊断剂、试验试剂、碳水化合物分离分析的特异性吸收剂，和免疫调节药物。因而，本发明提供了一种诊断剂和包括该诊断剂的诊断剂试剂盒，该诊断剂包括作为活性成分的L-岩藻糖α1→6糖链，并且其用于检测L-岩藻糖α1→6转移酶合成的L-岩藻糖α1→6糖链。诊断剂或诊断剂试剂盒用于诊断例如肝细胞癌。

本发明还提供了一种分别L-岩藻糖α1→6糖链的方法，其包括使用L-岩藻糖α1→6特异性凝集素作为L-岩藻糖α1→6糖链结合介质从而分别L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖α1→6糖链的步骤。

用于分别L-岩藻糖α1→6糖链方法中的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素优选地为担子菌凝集素，特别优选地为PTL，SRL，NSL，LSL和AML，更优选地为PTL和SRL。

本发明分别方法为例如使用固定化L-岩藻糖α1→6特异性凝集素的凝集素色谱法。其细节与所述的相关检测方法是相同的。当提纯L-岩藻糖α1→6糖链时，L-岩藻糖α1→6特异性凝集素经由功能基团结合到包括琼脂糖或纤维素的柱载体，从而然后应用糖链样品。在样品通过柱后，收集吸附的L-岩藻糖α1→6糖链。当提纯非L-岩藻糖α1→6糖链时，这些未吸附的糖链样品在糖链样品通过柱时进行收集。

本发明分别方法提纯的对象可以是L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖糖链两种类型。其特定例子是抗体结合的糖链，优选地是人IgG的糖链。

通过分别方法分别的糖链的纯度(即，在L-岩藻糖α1→6糖链中，L-岩藻糖α1→6糖链比上L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖α1→6糖链总量的比例，和在非L-岩藻糖α1→6糖链中，非L-岩藻糖α1→6糖链比上L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖α1→6糖链总量的比例)通常为90-100％，优选地95-100％，特别优选地99-100％。

本发明还提供了一种抗体制品，其包括作为活性成分的具有通常90-100％，优选地95-100％，特别优选地99-100％纯度的L-岩藻糖α1→6糖链或非L-岩藻糖α1→6糖链。特别地，包含抗体的抗体制品被期望能提供改善的ADCC活性，其中L-岩藻糖α1→6转移的抗体从抗体制品中除去。其候补包括例如Rituxan(嵌合抗体，NH淋巴瘤)，Herceptin(人源化抗体，乳癌)，Erbitux(嵌合抗体，大肠癌，头颈癌)，Zevalin(小鼠抗体，NH淋巴瘤)，Campath(人源化抗体，B细胞慢性淋巴性白血病)，Bexxar(小鼠抗体，NH淋巴瘤)，和Avastin(人源化抗体，转移大肠癌)。

通过本发明分别方法获得的抗体医疗药物可以以与传统方法相同的方法使用(在例如药理学允许的载体，辅剂或添加剂，给药途径，或给药形式方面)，除了通过本发明分别方法获得的抗体医疗药物可以以低剂量给药和低剂量使用，这是因为该药物具有比传统药物更高的比活性。

本发明还提供了一种由分别方法分别的具有90-100％纯度的L-岩藻糖α1→6糖链或非L-岩藻糖糖链，以及一种包括作为活性成分的具有90-100％纯度的L-岩藻糖α1→6糖链或非L-岩藻糖糖链的医疗药物。纯度的意思是，在L-岩藻糖α1→6糖链的情况中，L-岩藻糖α1→6糖链比上L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖α1→6糖链总量的比例，在非L-岩藻糖α1→6糖链的情况中，非L-岩藻糖α1→6糖链比上L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖α1→6糖链总量的比例。医疗药物优选地为抗体制品。

本发明还提供了一种L-岩藻糖α1→6糖链的筛选方法。该方法包括使糖链作用于L-岩藻糖α1→6特异性凝集素和收集L-岩藻糖α1→6特异性凝集素吸附的L-岩藻糖α1→6糖链的步骤。该筛选方法对于搜寻具有L-岩藻糖α1→6糖链的肿瘤标记物是有用的。使用可以用于本发明检测方法的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素轻易筛选包括L-岩藻糖α1→6糖链的疾病标记物也是可能的。

用于筛选方法中的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素优选地为得自担子菌的凝集素，特别优选地为选自至少球盖茹科，口蘑科，多孔菌科和捕蝇蕈科的一种，更优选地为PTL，SRL，NSL，LSL，和/或AML，其中PTL和SRL是最优选的。

本发明还提供了一种筛选L-岩藻糖α1→6糖链特异性凝集素的方法。该方法使用例如固定化的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素。包括多个糖链的流体可以作用于固定化凝集素。然后，当流体作用于固定化的PTL和SRL时，将吸附到固定化凝集素的糖链的试验曲线与凝集素吸附的糖链的对照曲线进行对比。如此，可以提取该L-岩藻糖α1→6特异性凝集素，其具有与对照凝集素一样的曲线。由于不需要鉴别吸附到样品凝集素的糖链，因此目标凝集素可以通过非常简单的操作筛选。如此提取的L-岩藻糖α1→6特异性凝集素可以用作下一个筛选方法的对照。另一个也可以使用部分或完全编码序列号1中所示的氨基酸序列的cDNA作为引发剂从而从样品凝集素获得L-岩藻糖α1→6特异性凝集素的cDNA。

糖链包括至少附图1和附图2所示的L-岩藻糖α1→6糖链的一种，优选地包括至少一种非L-岩藻糖α1→6糖链和至少一种不具有L-岩藻糖的糖链(例如高甘露糖糖链)，其中L-岩藻糖而非α1→6结合转被移到所述非L-岩藻糖α1→6糖链。通过它的添加，可以确认的是，除了L-岩藻糖α1→6糖链外，对其他糖链都不具有亲和力。

吸附的糖链的曲线可以通过本领域技术人员公知的方法测定，例如各种色谱法，质量分析，凝胶电泳，凝集素碎片，酶联免疫吸附测定(ELISA)，例如系统的表面细胞质基因组共振，或电泳。

实施例

以下内容将通过实施例和对照实施例的方式对本发明做更详细的说明。然而，本发明不限定于以下实施例。

[实施例1和2](PTL和SRL的制备、特性测定和特征)(1)PTL的制备(实施例1)基于附图3所示的提纯方法，从蘑菇土生环锈伞提纯土生环锈伞凝集素(PTL)。

(提取)所有的操作都在4℃完成。土生环锈伞冻干粉用50ml 10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.2)在4℃时提取2小时。所得液体进行离心(15,000rpm，20分钟，4℃)。然后，上清液经过纱布过滤从而获得第一提取物。该提取的残留物用50ml 10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.2)在4℃时再提取过夜。在将液体离心(15,000rpm，20分钟，4℃)之后，上清液经过纱布过滤从而获得第二提取物。然后，将这些提取物一起通过滤纸过滤从而获得土生环锈伞提取物。

(离子交换色谱)将提取物(87ml)应用于用10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.2)平衡的DEAE-琼脂糖柱(GE Healthcare Bioscience)。在用缓冲液清洗柱之后，用0.1MNaCl在缓冲液中将结合部分吸附。然后，显示血细胞凝集活性的部分(附图4←→所示)相对蒸馏水进行大范围透析，然后低压冻干。

(亲和色谱)将低压冻干的透析液用10mM磷酸缓冲盐缓冲生理盐水(pH 7.4，以下简称为PBS)复溶。然后，将提取溶液应用于用相同缓冲液平衡的甲状腺球蛋白固定化的琼脂糖柱。在用PBS清洗柱之后，用0.2M氨水吸附结合部分。然后，收集表现血细胞凝集活性的部分，超滤，然后低压冻干，从而获得1.07mg PTL。

(SDS-PAGE)SDS-PAGE通过快速电泳系统(GE Healthcare Bioscience)的电泳装置和Gradient8-25(GE Healthcare Bioscience)凝胶完成。使用1μl的样品溶液和分子量标记物。基于产品规约和传统方法完成电泳。附图6显示了PTL的SDS-PAGE结果。在附图6中，泳道M，泳道1和2相应如下。泳道M：分子量标记物(APRO)，泳道1：PTL，2-巯基乙醇(-)，泳道2：PTL，2-巯基乙醇(+)，凝胶：Gradient8-25，样品：1μl/泳道，染色剂：考马斯亮蓝(CBB)。

在8-25％凝胶的SDS-PAGE上，主要成分确认为是PTL。

(2)SRL的制备(实施例2)基于附图7所示的提纯过程，从蘑菇大球盖菇中提纯大球盖菇凝集素(SRL)。

(提取)所有的操作都在4℃完成。大球盖菇冻干粉(400g)用1.6L PBS在4℃下提取2小时。所得液体进行离心(15,000rpm，20分钟，4℃)。然后，上清液经过纱布过滤从而获得第一提取物。该提取的残留物用0.8L PBS在4℃时再提取过夜。将该液体离心(10,000rpm，20分钟，4℃)之后。然后，上清液经过纱布过滤从而获得第二提取物。然后，将这些提取物混合从而获得大球盖菇提取物。

(硫酸铵沉淀)将固体(NH₄)₂SO₄(1.3kg)加入到所得上清液(2.4L)从而获得80％饱和剂量。在4℃下静置过夜之后，通过离心(10,000rpm，20分钟，4℃)收集沉淀物，并且相对蒸馏水大范围透析，然后低压冻干，从而收集大球盖菇-80％硫酸铵沉淀成分。

将大球盖菇-80％硫酸铵沉淀成分应用于用2M硫酸铵-PBS平衡的Butyl-TOYOPEARL 650M(TOSOH CORPORATION)从而完成疏水色谱提纯。在该色谱中，收集蒸馏水洗脱部分，超滤，然后低压冻干，从而获得大球盖菇凝集素粗成分。

(反相色谱)将大球盖菇凝集素粗成分应用于0.05％三氟乙酸(TFA)/乙腈(100/0)平衡的C8柱(Wako Pure Chemical Industries公司)。在该色谱中，收集0.05％TFA/乙腈(70/30)洗脱成分(附图9←→所示)。然后，在室温下通过蒸发除去溶剂，收集所得干粉，从而获得7.5mg SRL。

在快速电泳系统(GE Healthcare Bio-Sciences)中完成SDS-PAGE(PhastGel，Gradient8-25)。样品溶液和分子量标记物的用量均为1μl。然后，基于产品规约和传统方法执行电泳。附图10显示了PTL的SDS-PAGE结果。在附图10中，泳道M，泳道1和2相应如下。泳道M：分子量标记物(APRO)，泳道1：SRL，2-巯基乙醇(+)，泳道2：PTL，2-巯基乙醇(-)，凝胶：Gradient8-25，样品：1μl/泳道，染色剂：银。

在使用8-25％凝胶的SDS-PAGE上，可以确认的是主要成分为SRL。

(3)PTL和SRL的特性(MALDI-TOF质谱测定)分别将10μg 10实施例1的PTL和实施例2的SRL分别溶解于TA(0.1％-TFA和乙腈体积比为2∶1之间的混合物)中。然后，将饱和基质溶解于TA中，并且以4∶1的体积比混入凝集素TA溶液，将所得混合物以1.0μl的量滴入目标平板，从而制备样品。使用质谱分析装置Autoflex(Bruker Daltonics K.K.)从而测定LP模型中PTL和SRL的分子量。结果显示，分子量为约4,500(附图11和12)

(氨基酸序列测定)关于实施例1的PTL和实施例2的SRL，通过蛋白质肽测序仪PPSQ-21系统(SHIMADZU CORPORATION)测定其氨基酸序列。结果分别显示在序列号2和3中。任何序列都是新的。

对PTL和SRL进行兔、马、猪、羊、人(A、B、O)和肌动蛋白酶E处理的兔红血球的红血球凝集活性试验。结果以红血球凝集活性显示在表1中。

[表1]NT：未试验

从氨基酸结构分析和红血球凝集活性试验的结果可以才看出，实施例1的PTL和实施例2的SRL是新型凝集素。

(4)PTL和SRL的糖结合特异性的评估将各种显示于表2中的单糖、低聚糖和多聚糖以及显示于表3中的糖蛋白进行红血球凝集抑制试验从而评估实施例1的PTL和实施例2的SRL的糖结合特异性。

在96槽U底微量滴定板上，制备10μl单糖、低聚糖、多聚糖和糖蛋白的二倍稀释组。然后，将事先调节到滴定度4的凝集素溶液以10μl的量加入各个槽中。然后，将平板在室温下静置一小时以致敏。然后，将10μl4％红细胞悬液加入到各个槽，并且将平板在室温下再静置一小时。之后，血细胞凝集完全抑制的样品溶液稀释就可以从视觉上进行判断。表现抑制的最低浓度假设为是最小抑制浓度。最小抑制能多越低，对凝集素的特异性越高。结果显示在表2和表3中。

为了对照，糖结合特异性使用以下商业可得的凝集素进行评估：对照实施例1：AAL(SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION-J-OIL MILLS，Inc.)，对照实施例2：AOL(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO.，LTD.-Gekkeikan Sake Company，Ltd.)，对照实施例3：LCA(SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION-J-OIL MILLS，Inc.)，对照实施例4：PSA(SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION-J-OIL MILLS，Inc.)。结果显示在表2和表3中。

[表2]

[表3]

从表2和表3可以看出，实施例1的PTL和实施例2的SRL只与具有L-岩藻糖α1→6的甲状腺球蛋白结合。另外，对照实施例1的AAL不仅与甲状腺球蛋白结合，而且与例如L-岩藻糖和果糖的糖以及例如在氧联糖链中具有L-岩藻糖的糖蛋白结合。对照实施例2的AOL与例如L-岩藻糖和果糖的糖结合，并且与例如在氧联糖链中具有L-岩藻糖的糖蛋白结合。对照实施例3的LCA和对照实施例4的PSA不仅与甲状腺球蛋白结合，而且与例如甘露糖的糖和甲基α-甘露糖苷结合。可以说，实施例1的PTL和实施例2的SRL是L-岩藻糖α1→6特异性凝集素，其不与L-岩藻糖和甘露糖结合，并且只与L-岩藻糖α1→6链合的糖链结合。

(5)PTL和SRL对L-岩藻糖α1→6糖链缔合常数的测定。实施例1的PTL和实施例2的SRL对L-岩藻糖α1→6糖链的缔合常数通过以下操作测定。

(低聚糖的制备)附图1和附图2中所示的吡啶氨基化(PA)糖链用于正面亲和色谱(FAC)测定。PA购自TAKARA BIO INC.，SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION，和MasudaChemical Industries co.，LTD。PA糖还可以使用(TAKARA BIO INC.)通过将未标记糖链或将糖链经过例如酶消化获得的糖链吡啶氨基化获得。

(凝集素柱的制备)将凝集素溶解于2M包括0.5M NaCl的NaHCO₃缓冲溶液(pH 8.3)，并且根据以下制造说明与NHS活化琼脂糖(GE Healthcare Bioscience)配对。然后，将凝集素固定的琼脂糖悬浮于10mM包括08％-NaCl的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.4，TBS)，将所得物质填入微型柱中(φ2mm×10mm，31.4μl)。

(正面亲和色谱)使用FAC自动分析装置(FAC-1，SHIMADZU CORPORATION)完成正面亲和色谱。特别地，将上面制得的凝集素柱插入到不锈钢支架，然后将支架连接到FAC-1装置。流量和柱温分别保持在0.125ml/min和25℃。在用TBS平衡微型柱后，PA糖链(3.75nM或7.5nM)的过度体积(0.5ml-4ml)使用自动进料装置被连续地输入到柱。

监视PA洗脱物的荧光强度(310nm的激发波长和380nm的荧光波长)从而测定相互作用强度[与标准低聚糖前端洗出物的不同(PA鼠李糖)：V-V0]。

为了对照，基于与上述相同的操作就AAL(对照实施例1)，AOL(对照实施例2)，LCA(对照实施例3)，和PSA(对照实施例4)对中心-岩藻糖特异性凝集素的缔合常数进行计算。结果显示在表4-7中。

[表4]

[表5]

[表6]

[表7]

从表4-7可以看出，对照实施例1的AAL和对照实施例2的AOL与非α1→6糖脂基的L-岩藻糖链(糖链号718，722，723，727，909，910，和933)和L-岩藻糖α1→6糖链(糖链号15，201-203，和401-418)结合。对照实施例3的LCA和对照实施例4的PSA与许多不具有L-岩藻糖α1→6糖链(糖链号003，005-014)结合。另一方面，实施例1的PTL和实施例2的SRL可靠地与L-岩藻糖α1→6糖链结合，但完全不与非L-岩藻糖α1→6糖链和不具有L-岩藻糖的糖链结合。此外，实施例1的PTL具有相比传统凝集素缔合常数(Ka＝1.0×105M-1或更高的缔合常数)更高的缔合常数。此外，实施例1的PTL和实施例2的SRL还与中心岩藻糖基化的三叉N-葡聚糖(糖链号407-413)和四叉N-葡聚糖(糖链号418)强烈结合。甚至那些添加了硅酸的(糖链号601和602)，可以看出的是，L-岩藻糖α1→6糖链的缔合常数没有降低。

(6)使用PTL和SRL的糖蛋白的检测(i)糖蛋白的制备制备具有以下主糖链结构的糖蛋白(1)-(9)和不具有糖的(10)牛血清白蛋白。

(1)作为具有L-岩藻糖α1→6N联聚糖的糖蛋白，甲状腺球蛋白(猪)具有以下化学式：[化学式3]

(2)作为具有L-岩藻糖α1→6N联聚糖的糖蛋白，乳铁蛋白(牛)具有以下化学式：[化学式4]

(3)作为具有L-岩藻糖α1→6N联聚糖的糖蛋白，免疫球蛋白G(人)具有以下化学式：[化学式5]

(4)作为具有L-岩藻糖α1→6N联聚糖的糖蛋白，运铁蛋白(人)具有以下化学式：[化学式6]

(5)作为具有L-岩藻糖α1→6N联聚糖的糖蛋白，α1-酸性糖蛋白(人)具有以下化学式：[化学式7]

(6)作为具有高甘露糖型糖链的糖蛋白，蔗糖酶(酵母)具有以下化学式：[化学式8]

(7)作为具有L-岩藻糖O-联糖链的糖蛋白，粘蛋白(猪)具有以下化学式：[化学式9]GalNAcGalNAc1→3GalNAcFuc1→2GalNAc1→3GalNAcGlcNAc1→4Gal1→3GalNAc

(8)作为具有L-岩藻糖O-联糖链的糖蛋白，粘蛋白(牛)具有以下化学式：[化学式10]

(ii)西式印迹法糖蛋白检测实施例1的PTL，实施例2的SRL，对照实施例1的AAL，对照实施例2的AOL，和对照实施例3的LCA均经过生物素标记。

(凝集素的生物素化)测定凝集素，并且将其溶解于0.1M碳酸氢钠溶液(5mg/ml)。然后，将生物素化试剂溶解于二甲基亚砜，将所得溶液加入到凝集素溶液从而引起相互间的反应。然后，将试剂蒸馏和低压冻干，从而获得生物素标记的凝集素。

(糖蛋白的SDS-PAGE和印迹)将糖蛋白样品溶于10mM磷酸缓冲生理盐水(pH 7.4，PBS)获得的溶液以2mg/ml分配到微型管，得到18μl的单位。将6μl SDS处理液体(样品缓冲溶液(2ME-)；Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和1.25μl 2-巯基乙醇(Bio-Rad Laboratories，Inc.)加入到各分配的流体，然后将所得的混合物沸腾5分钟。这些通过聚丙烯酰胺凝胶表明，并且转移到PEDF薄膜(Immobilon IPVH304 F0，Millipore K.K.)。

(生物素标记的凝集素的染色)将薄膜浸入10mM添加了1％BSA的包括0.8％NaCl三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.4，1％BSA+TBS)中，并且在室温下振荡1小时。然后，薄膜用10mM包括0.8％NaCl三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.4，TBS)清洗3次。然后，将薄膜浸入生物素标记的凝集素溶液中，并且在室温下振荡1小时。然后，薄膜用TBS清洗3次。然后，将薄膜浸入1μg/ml的HRP标记抗生蛋白链菌素溶液(VectorLaboratories)中，并且在室温下振荡30分钟。薄膜用TBS清洗3次之后，使用POD免疫染色装置(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)完成染色试验。染色试验是为了通过西式印迹法使用生物素标记凝集素检测糖蛋白。附图13-17是显示以下由PTL(附图13)，SRL(附图14)，AAL(附图15)，AOL(附图16)，或LCA(附图17)染色的糖蛋白的照片。

在附图13-17中，泳道0-6相应如下。泳道1：甲状腺球蛋白，泳道2：乳铁蛋白，泳道3：免疫球蛋白，泳道4：运铁蛋白，泳道5：α1-酸性糖蛋白，泳道6：蔗糖酶，泳道0：牛血清白蛋白(对照)

对于对照，同时完成CBB染色从而将蛋白质染色。其染色照片显示在附图18中。在附图18中，泳道M和泳道1-6相应如下。泳道M：分子量标记物，泳道1：甲状腺球蛋白，泳道2：乳铁蛋白，泳道3：免疫球蛋白G，泳道4：运铁蛋白，泳道5：α1-酸性糖蛋白，泳道6：蔗糖酶，泳道0：牛血清白蛋白

[表8]○检测的×未检测的

从附图8和附图13-18的结果可以看出，在对照实施例3的LCA的情况中，检测到了具有L-岩藻糖α1→6糖链的糖蛋白和具有高甘露糖(蔗糖酶)的糖蛋白。与其大不相同的是，在实施例1的PTL和对照实施例2的SRL的情况中，只检测到了具有L-岩藻糖α1→6糖链的糖蛋白，而完全没有检测到非L-岩藻糖α1→6糖链和不具有L-岩藻糖的L-岩藻糖α1→6糖链。

(iii)通过ELISA的糖蛋白检测生物素标记的实施例1的PTL，实施例2的SRL，对照实施例1的AAL，对照实施例2的AOL，和对照实施例3的LCA用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测糖蛋白。

将作为对照的不包括糖链的糖蛋白和白蛋白以1mg/ml溶解于0.1M碳酸缓冲液(pH 9.5)中。然后，将所得溶液加入到微量滴定板(Nunc 439454)，并且在4℃培养过夜。然后，所得溶液用0.05％Tween/PBS清洗3次，之后，将1％BSA/PBS加入到槽，并且在37℃培养1小时。然后，溶液用0.05％Tween/PBS清洗3次之后，将适当的用1％BSA/0.05％Tween/PBS稀释的将生物素标记的凝集素加入到槽中，然后溶液在37℃培养1小时，溶液用0.05％Tween/PBS清洗3次后，将1％BSA/0.05％Tween/PBS稀释的HRP标记的抗生蛋白链菌素溶液加入到槽中，然后溶液在37℃培养30分钟。溶液用0.05％Tween/PBS清洗3次后，加入TMB过氧化物酶底物系统(KPL)，所得溶液在室温下培养10分钟，同时光源被切断。

通过1M磷酸终止反应。然后，使用全自动定量绘图酶标仪(MPR-A4i，TOSOHCORPORATION)在450nm测定吸收率。基于该数值，计算反应值([槽在450nm时的吸收率，此时对于平板来讲糖蛋白是固相的并且反应的]-[槽在450nm时的吸收率，此时对于平板来讲糖蛋白不是固相的并且反应的])。然后，对于各凝集素，基于糖蛋白(甲状腺球蛋白)值为100％的假设计算对于各糖蛋白的相互作用强度(相对值)。计算结果显示在表9和附图19-23中。

[表9]◎相对值120-80○相对值80-50△相对值50-10×相对值10或更小

从表9和附图19-23可以看出，在对照实施例1的AAL和对照实施例2的AOL的情况中，具有L-岩藻糖α1→6糖链的糖蛋白和O-联糖链(粘蛋白)都不希望地被检测到了。与其大不相同的是，在实施例1的PTL和实施例2的SRL的情况中，只检测到了具有L-岩藻糖α1→6糖链的糖蛋白，没有检测到非L-岩藻糖α1→6糖链和不具有L-岩藻糖的糖链。此外，对照实施例1-3的凝集素对乳铁蛋白和免疫球蛋白G的相互作用强度低于对甲状腺球蛋白的强度。与此大不相同的是，实施例1和实施例2的凝集素提供了与对甲状腺球蛋白的强度相同的对乳铁蛋白和免疫球蛋白的相互作用强度。

(iv)通过ELISA的肿瘤标记物糖链的检测α-胎蛋白(以下称为：“AFP”)是一种包括在血清中具有N-联糖链的糖蛋白。基本上没有AFP存在于健康成人的血清中。另一方面，具有良性肝病的患者的血清具有增加的α-胎蛋白L1型糖链(AFP-L1)。此外，在肝癌患者中检测到了α-胎蛋白L3型糖链(AFP-L3)。一般地，糖链中的差异可以通过LCA测定，测定结果用于肝病的诊断。

[化学式12]α-胎蛋白L1型(AFP-L1)肝硬化，慢性肝炎(还存在于脐带血中)α-胎蛋白L3型(AFP-L3)肝癌

生物素标记的实施例1的PTL，实施例2的SRL，对照实施例1的AAL，对照实施例2的AOL，和对照实施例3的LCA用于通过ELISA评估α-胎蛋白的结合特性。

0.1M碳酸缓冲液(pH 9.5)用于稀释α-胎蛋白(得自于人脐带血清，主要为L1-型糖链)和α-胎蛋白-L3(从人肝癌细胞培养上清液制备)，从而达到0.01μg/ml。然后，将所得溶液加入到微量滴定板(Nunc)，并且在4℃培养一晚。溶液用0.05％Tween/PBS清洗3次之后，将1％BSA/PBS加入到槽中，并且溶液在37℃培养1小时。溶液用0.05％Tween/PBS清洗3次之后，将用1％BSA/0.05％Tween/PBS适当稀释的生物素标记的凝集素加入到槽中，并且溶液在37℃培养1小时。溶液用0.05％Tween/PBS清洗3次之后，加入用1％BSA/0.05％Tween/PBS稀释的HRP标记的抗生蛋白链菌素溶液，并且溶液在37℃培养30分钟。加入TMB过氧化物酶底物，所得溶液在室温下培养10分钟，同时光源被切断。用1M磷酸终止反应。然后，使用全自动定量绘图酶标仪(MPR-A4i，TOSOHCORPORATION)在450nm测定吸收率。

测定平板在450nm的吸收率，α-胎蛋白和α-胎蛋白-L 3在平板上与凝集素发生反应。基于该数值，计算反应值([槽在450nm时的吸收率，此时对于平板来讲糖蛋白是固相的并且反应的]-[槽在450nm时的吸收率，此时对于平板来讲糖蛋白不是固相的并且反应的])。然后，对于各凝集素，计算相互作用。然后，反应值的计算结果显示在表10和附图24-28中。

[表10]

从表10可以看出，实施例1的PTL和实施例2的SRL以与对照实施例3的LCA的检测相当或者更高的水平可以检测肿瘤标记物糖链(α-胎蛋白-L1型糖链和L3型糖链)的变化。因而，实施例1的PTL和实施例2的SRL可以通过检测肿瘤标记物糖链的变化用于诊断剂或诊断剂试剂盒。此外，本发明凝集素具有高特异性可能性，其中相对于其他凝集素，目标L-岩藻糖α1→6糖链化合物可以从包括除L-岩藻糖α1→6糖链的糖链化合物组中以更精确的方法检测出来。

[实施例3和4](NSL和LSL的制备和特性测定)(1)NSL的制备(实施例3)基于附图29所示的提纯方法，从亚砖红沿丝伞中提纯亚砖红沿丝伞凝集素(NSL)。

(提取)用0.8L PBS在4℃提取冻干的亚砖红沿丝伞粉(40g)2小时。将该液体离心(10,000rpm，20分钟，4℃)。然后，将上清液纱布过滤从而获得第一提取液体。用0.4L PBS在4℃对该提取残留物再次提取一晚上。离心操作(10,000rpm，20分钟，4℃)后，将上清液纱布过滤从而获得第二提取溶液。将这些提取液混合从而获得亚砖红沿丝伞提取物。

(硫酸铵沉淀)将固体(NH₄)₂SO₄(0.8kg)加入到所得上清液(1.5L)从而获得80％饱和状态。在4℃静止过夜后，通过离心分离(10,000rpm，20分钟，4℃)收集沉淀，并且相对蒸馏水完全透析并且冻干，从而收集亚砖红沿丝伞-80％硫酸铵沉淀成分。

(疏水色谱)将亚砖红沿丝伞-80％硫酸铵沉淀成分用于用2M硫酸铵-PBS平衡的Butyl-TOYOPEARL 650M(TOSOH CORPORATION)从而完成疏水色谱提纯。在该色谱中，收集蒸馏水洗脱物成分，并且低压冻干，从而获得亚砖红沿丝伞凝集素粗成分(附图30←→所示)。

(反相色谱)将通过上述方法所得的亚砖红沿丝伞凝集素粗成分用于用0.05％三氟乙酸(TFA)/乙腈(100/0)平衡的C8柱(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。在该色谱中，收集0.05％TFA/乙腈(70/30)洗脱物成分(附图31←→所示)。然后，将溶剂通过室温蒸发除去从而提供干粉。然后，收集干粉，从而获得NSL。

在快速电泳系统(GE Healthcare Bio-Sciences)中完成SDS-PAGE(PhastGel，Gradient10-15)。样品溶液和分子量标记物的用量均为1μl。基于产品规约和传统方法完成电泳。附图32显示了NSL的SDS-PAGE结果，其中泳道1和2相应如下。泳道M：分子量标记物，泳道1：NSL，2-巯基乙醇(+)，泳道2：NSL2-巯基乙醇(-)，凝胶：Gradient10-15(GE Healthcare Bioscience)，样品：1μl/泳道，染色剂：银。

在使用10-15％凝胶的SDS-PAGE电泳上，主要成分确认为是NSL。

(2)LSL的制备(实施例4)基于附图33所示的提纯方法，从蘑菇花脸香蘑提纯花脸香蘑凝集素(LSL)。

(提取)将0.8L PBS加入到冷冻干燥约400g花脸香蘑获得的冻干花脸香蘑粉(40g)，然后在4℃实行提取2小时。将该液体离心(10,000rpm，20分钟，4℃)之后，将上清液纱布过滤从而获得第一提取溶液。该提取残留物用0.4L PBS在4℃再提取过夜。将该液体离心之后(10,000rpm，20分钟，4℃)，将上清液纱布过滤从而获得第二提取溶液。将这些提取物混合从而获得花脸香蘑提取物。

(硫酸铵沉淀)将固体(NH₄)₂SO₄(0.8kg)加入到所得上清液(0.5L)从而获得80％饱和状态。在4℃下静止过夜后，通过离心分离(10,000rpm，20分钟，4℃)收集沉淀，并且相对蒸馏水完全透析并且冻干，从而收集花脸香蘑-80％硫酸铵沉淀成分。将约0.8kg硫酸铵沉淀加入到0.5L提取液从而达到80％-饱和硫酸铵浓度，搅动所得液体。然后，确认其完全溶解。然后，将液体在7℃静置一晚。然后，该将该液体离心(10,000rpm，20分钟，4℃)，并且将少量蒸馏水加入到沉淀。然后，将所得溶液悬浮从而收集花脸香蘑-80％硫酸铵沉淀成分。将收集的花脸香蘑-80％硫酸铵沉淀用纯水通过透析膜透析(6,000-8,000的成分)。

(疏水色谱)将花脸香蘑-80％硫酸铵沉淀成分应用于用2M硫酸铵-PBS平衡的Butyl-TOYOPEARL 650M(TOSOH CORPORATION)从而完成疏水色谱提纯。在该色谱中，收集PBS洗脱物成分，超滤，然后冻干，从而获得花脸香蘑凝集素粗成分(附图34←→所示)。

(反相色谱)将花脸香蘑凝集素粗成分应用于用0.05％三氟乙酸(TFA)/乙腈(100/0)平衡的C8柱(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。在该色谱中，收集0.05％TFA/乙腈(70/30)洗脱物成分(附图31←→所示)。然后，将溶剂通过室温蒸发除去从而提供干粉。然后，收集干粉，从而获得LSL。

在快速电泳系统(GE Healthcare Bio-Sciences)中完成SDS-PAGE(PhastGel，Gradient10-15)。样品溶液和分子量标记物的用量均为1μl。基于产品规约和传统方法完成电泳。附图36显示了NSL的SDS-PAGE结果，其中泳道1和2相应如下。泳道M：分子量标记物，泳道1：LSL(疏水色谱，反相)，2-巯基乙醇(+)，、凝胶：Gradient10-15(GE Healthcare Bioscience)，样品：1μl/泳道，染色剂：银。

在使用10-15％凝胶的SDS-PAGE电泳上，主要成分确认为是LSL。

(3)NSL和LSL的特性(MALDI-TOF质谱分析)分别将10μg实施例3NSL和实施例的LSL通过实施例1相同的操作溶解于TA(0.1％TFA与乙腈体积比为2∶1的混合物)。然后，将通过溶解于TA的饱和基质获得的混合物和凝集素TA溶液以4∶1的体积比滴注到目标平板，从而制得样品。使用质谱分析装置Autoflex(Bruker Daltonics K.K.)以LP模型测定NSL和LSL的分子量。结果显示，分子量为约4,500(附图37和附图38)。

(氨基酸序列分析)通过蛋白质肽测序仪PPSQ-21系统(SHIMADZU CORPORATION)测定实施例3的NSL的氨基酸序列。实施例3的NSL是序列号5和6所示氨基酸序列的杂种。这些序列都是新的。

相似地，通过蛋白质肽测序仪PPSQ-21系统(SHIMADZU CORPORATION)测定实施例4的LSL的氨基酸序列。结果显示在序列号4中。该序列也是新的。

(4)NSL和LSL糖结合特异性的评估关于实施例3的NSL和实施例4的LSL，以与实施例1中相似的方法评估对L-岩藻糖α1→6糖链的特异性结合特性。特别地，计算NSL和LSL的缔合常数(Ka)。结果显示在表11-13中。

[表11]NT：未测定

[表12]

[表13]

在实施例3的NSL和实施例的4LSL的情况中，只检测到了L-岩藻糖α1→6糖链，完全没有检测到不具有L-岩藻糖的糖链。此外，实施例3的NSL和实施例4的LSL还与三和四叉的L-岩藻糖α1→6糖链强烈结合。此外，甚至在加入硅酸时，L-岩藻糖α1→6糖链的缔合常数也没有降低。

最后，表14显示了序列号2-6所示蛋白质或肽之间的同源性计算结果。从该结果中可以看出，当获得与任何序列2-6中所示的氨基酸序列至少37％时，可以获得L-岩藻糖α1→6特异性凝集素。

[表14]

  序列2  序列3  序列4  序列5  序列6  序列2  100％  61-74％  52-73％  69-79％  65-70％  序列3  -  100％  46 to 64％  58-72％  43-64％  序列4  -  -  100％  46-64％  37-55％  序列5  -  -  -  100％  87 to-92％  序列6  -  -  -  -  100％