用于治疗口腔疾病的来自蓝细菌的糖脂级分

摘要

本发明涉及来自Oscillatoria Planktothrix sp.的糖脂级分的制备和用途，所述糖脂级分用于治疗和/或预防主要由下列细菌引起的细菌性龈疾病：伴放线放线杆菌、牙龈红棕色单胞菌、福塞思坦纳菌、齿垢密螺旋体并且甚至更优选由牙龈红棕色单胞菌引起。所述龈疾病，尤其是龈炎和牙周炎(脓溢)主要由导致牙周组织的破坏的对牙龈红棕色单胞菌组分的促炎性反应引起，并且常伴有破骨细胞发生(造成骨组织损伤的破骨细胞数目增加)和慢性感染。

说明书

发明领域

本发明涉及用于口腔卫生和口腔疾病治疗的辅佐剂领域。

背景技术

牙周炎是由某些革兰氏阴性菌物种引起的口腔疾病。它是一种慢性口腔组织炎性疾病，特征是引起支撑牙齿的组织不可逆损坏的慢性细菌感染。这是一种极为常见的疾病，它以不同的严重程度影响着约3/4的成年人群(1)。龈下组织的特征是存在许多细菌物种，但是它们中仅有少数是牙周炎开始和进展的原因。这些细菌是作为兼性厌氧菌或专性厌氧菌的4种革兰氏阴性菌物种(伴放线放线杆菌(Actinobacillum actinomycetemconcomitans)、牙龈红棕色单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福塞思坦纳菌(Tannerella forsythia)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola))，它们产生容许它们定殖在龈下区域的大量因子以抵抗宿主免疫系统并引起组织损坏(2-4)。然而，在这些细菌中，牙龈红棕色单胞菌(P.gingivalis)是最常与晚期牙周炎相关的细菌。牙周疾病的发病率和进展程度涉及牙周致病菌(periodontopatic bacteria)和宿主免疫系统之间的复杂的相互作用。已显示这些细菌和它们的产物对宿主免疫细胞的激活导致诸如细胞因子和基质金属蛋白酶(MMP)的大量促炎性介质的分泌，所述促炎性介质调控牙周组织的损坏并且还诱导破骨细胞发生(2)。在革兰氏阴性菌的细胞壁上所存在的脂多糖(lypopolisaccharide，LPS)是可以触发免疫细胞释放促炎性介质的主要因子，所述免疫细胞位于口腔粘膜中或在感染过程期间被募集，例如单核细胞、巨噬细胞、多形核白细胞、树突细胞(4-6)。牙周炎的专业治疗是通过使用口腔卫生辅助用品如牙膏和漱口剂维持的，口腔卫生辅助用品优选含有消毒剂或广谱抗菌剂，例如三氯生、氯己定或者在某些情况下是抗体。然而，根据最近的研究，这种消毒剂和/或抗菌剂的使用由于若干原因而不是完全可取的，首要原因当然是诸如三氯生的某些化合物的明显的细胞毒性。这是它们的使用甚至在欧共体的一些国家被禁止的一个原因，并且第二大原因是主要的促炎性刺激物LPS(或与LPS类似的分子)不会被漱口剂和/或牙膏中所通常存在的杀菌活性灭活；然后LPS作为促炎性刺激物的影响甚至维持到细菌感染根除之后。第三大原因是广谱抗微生物活性具有还会除去“有用”或“有益”菌丛的不良副作用。因此，重要的是即便使用正常的口腔卫生保护剂也不特异性地消除促炎活性。因此，在牙科领域中高度期望的是开发除了消除细菌病原体外还促进特异性地抑制相关的促炎性刺激物的口腔卫生制剂。

发明概述

本发明涉及用于治疗和/或预防细菌性龈疾病的来自Oscillatoria Planktothrix sp.的糖脂级分，其中蛋白污染低于2％并且核酸污染低于5％。龈疾病的病因优选是由于选自包括下列的组的厌氧菌所引起的感染：伴放线放线杆菌、牙龈红棕色单胞菌、福塞思坦纳菌、齿垢密螺旋体和更优选牙龈红棕色单胞菌。龈疾病优选为龈炎和牙周炎(脓溢)。本发明的又一目的是包含上述糖脂级分的牙科组合物，所述糖脂级分优选以在0.1至100μg/ml之间的范围内的量，所述组合物包含作为成分和/或稀释剂和/或稳定剂和/或添加剂的适于口服施用的化合物和任选的一种或多种不同的活性成分。优选地，活性级分的浓度包括1至50μg/ml，对于糊剂或凝胶优选为4-20μg/ml并且对于漱口剂优选为1-5μg/ml。本发明的另一目的是用于由Oscillatoria Planktothrix sp.制备适于口服使用的糖脂级分的方法。

附图简述

图1.在来自牙龈红棕色单胞菌的LPS之后30、60、120、240分钟同时添加的蓝细菌提取物(CE)(20μg/ml)存在下对促炎性细胞因子产生的抑制。部分A：TNF-α；部分B：IL-6；部分C：IL-8；部分C：IL-1β。

发明详述

最近，据显示由蓝细菌Oscillatoria Planktothrix FP1制备的糖脂提取物能够在人树突细胞中拮抗TLR4受体LPS激动剂如来自大肠杆菌(E.coli)和马流产沙门氏菌(S.abortus equi)的LPS所触发的促炎作用(10)。本发明是源于如下的进一步观察：所述提取物还拮抗来自牙龈红棕色单胞菌(P.gingivalis)的LPS的促炎作用。牙龈红棕色单胞菌是与牙周炎或慢性牙周炎相关的最常见细菌，已显示它是牙周炎或慢性牙周炎的主要病原体。具体地，促炎反应与如(9)中所述纯化的其组分LPS和Fim1的存在相关。目前认为这些组分是与牙龈红棕色单胞菌感染相关的牙周组织损坏的主要起因，牙龈红棕色单胞菌感染通常伴有破骨细胞发生(造成骨组织损伤的破骨细胞数目增加)和慢性感染。由于之前显示的对大肠杆菌和马流产沙门氏菌LPS的活性，本发明的发现尤其令人惊讶，这是因为来自牙龈红棕色单胞菌的LPS通过与TLR2受体的相互作用发挥其活性(7-9)，而许多细菌LPS则通过与属于Toll样受体家族(TLR)的TLR4膜受体的相互作用激活先天性免疫细胞。因此，根据第一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗龈疾病和细菌性牙周炎的Oscillatoria Planktothrix sp.糖脂级分，其分离和生长条件描述于(12)中。

对人单核细胞系的体外研究已显示来自Oscillator Planktothrix sp.的糖脂级分能够主要拮抗牙龈红棕色单胞菌的LPS所诱导的促炎作用(即，细胞因子和促炎性趋化因子的产生)。因此，这代表了抵抗以下病症的良好候选物：齿龈炎症(龈炎)和轻度与重度牙槽炎症病症(牙周炎或脓溢)、与慢性感染相关的牙周组织的损坏和在这些感染中常见的最严重的破骨细胞发生现象。体外研究还显示如在细胞系以及从人血分离的PBMC中的细胞毒性测定所估计的，根据本发明制备的蓝细菌提取物对于哺乳动物细胞没有细胞毒性，所述蓝细菌提取物显示出低于2％的蛋白污染水平和低于5％的核酸污染水平。因此，可以要求保护它们以如下两种形式用于口腔治疗的用途：用于专业治疗齿龈疾病尤其龈炎、脓溢和牙周炎的组合物形式和用作口腔卫生辅剂的组合物形式，例如漱口剂、凝胶、糊剂或可以在口中咀嚼或溶解的装置，例如口香糖或糖果。已经体外在细胞系统中在最多比最小有效浓度高100倍的浓度(100μg/ml)下测试出本发明的提取物缺乏细胞毒性。如下所述制备的本发明的提取物是无嗅、无色和无味的：因此如果与具有相同特征的其他成分或组分组合，其还可能用于可在口腔中咀嚼或溶解的食物制剂中，例如以糖衣丸剂、口香糖、糖果或丸剂(还与如木糖醇的其他活性物质组合)形式。因此，含有提取物的组合物具有在所描述的条件下缺乏细胞毒性和感官品质令人满意的有利特性。然而，为了改善后者，组合物可以包含少量的芳香剂或着色剂和增甜剂。

提取物以适于口腔施用的组合物形式方便地制备，并且可以作为保护制剂以更高或更低的浓缩形式制备，以便专业用于牙科清洁和用于预防和治疗脓溢、更严重的龈炎和一般的牙周炎，或者仅用作口腔卫生的辅剂。根据本发明的组合物包含来自Oscillator Planktothrix sp.的糖脂提取物，对于专业牙科治疗制剂通常优选为包括0.1至100μg/ml之间的量，更优选为包括1至50μg/ml之间或甚至更优选包括4至20μg/ml之间的量，并且对于口腔卫生的保护制剂在1至5μg/ml的范围内。此外，在一个优选的方面，这些组合物包含适用于口腔的赋形剂、稀释剂和/或其他活性成分，诸如：抑菌剂或杀菌剂，例如季铵衍生物(例如西吡氯铵或氯己定、或表面活性剂、去垢剂、三氯生和类似化合物，如DDDE(2，2，-二羟基-5.5二溴二苯醚)和稳定剂。对于抗菌剂，还可以使用抗生素，诸如青霉素、红霉素或四环素或具有抗菌活性的其他药物。本发明的组合物还可以包含已知的口腔卫生辅剂，例如，防齿垢化合物如多磷酸盐、防蛀剂如氟化盐(例如一氟磷酸盐)、抗斑化合物(例如，尿素、乳酸钙或类似物)、钾盐如脱敏剂(例如，柠檬酸钾或类似物)。

糖脂提取物可以稀释于水和诸如DMSO的非质子溶剂中并且即便在其与例如氯己定混合时在水溶液中也是稳定的，此外，它还是热稳定的。在诸如漱口剂的制剂中，蓝细菌提取物在水溶液中或可以稀释于水中，当为固体组合物(牙膏、凝胶等糖果或口香糖)时，它可以含有增稠剂或胶凝剂，如天然的或合成的多糖(例如，角叉胶、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、葡聚糖、淀粉、植物甘油)；无定形二氧化硅或二氧化钛；天然的或合成的橡胶(例如，阿拉伯胶)聚乙烯吡咯酮、聚乙二醇或本领域的专家所熟知的能够赋予类似特征的化合物。根据又一方面，本发明涉及如Yi等人(11)所描述的由Oscillator Planktothrix sp.培养物制备糖脂级分的方法：在18℃至30℃之间的室温下处理样品，持续至少5分钟，优选至少10分钟的短的孵育时间；所述方法包括另外的纯化步骤，例如在用基于下列的试剂提取之后在乙酸钠和丙酮的存在下沉淀至少糖脂级分：有机溶剂，优选苯酚；离液剂(例如硫氰酸胍)如Trireagent(Sigma目录号T3934)或诸如Trizol(Invitrogen)的类似试剂以及诸如氯仿的第二有机溶剂；随后用70％乙醇洗涤并通过用蛋白酶如蛋白酶K消化而去除蛋白污染物。这些另外的处理容许达到更佳的比活性，因为它们导致诸如磷脂和异源蛋白的污染物的去除，所述污染物可能对于促炎性细胞因子的产生有刺激作用，从而会使得提取物不太有效。污染物浓度的降低容许在口腔中使用更低浓度的粗提取物。此外，用盐(例如乙酸钠)和诸如丙酮的有机溶剂进行的沉淀以及用经水稀释的乙醇对沉淀的进一步洗涤容许消除残留痕量的提取这种类型的细胞组分所需的毒性溶剂。根据优选的实施方案，用于Oscillator Planktothrix sp.提取物制备的方法提供了已经在诸如BG11(Sigma-Aldrich目录号C3061)的培养基中达到静止生长期的蓝细菌培养物的离心，如在Pomati等人(12)中描述的。在提取过程之前可以冷冻如此获得的沉淀，提取过程包括：在解冻之后，

a)稀释沉淀，优选用等体积的水或含水溶剂进行，

b)与适当体积的(13)中所描述的提取溶液(变性剂)混合，所述提取溶液优选由下列组成：基于极性质子有机溶剂的试剂，优选苯酚；和离液剂(例如硫氰酸胍)如Trireagent(Sigma目录号T3934)或类似试剂如Trizol(Invitrogen)；和有机非质子溶剂如氯仿，混合比例为约1体积蓝细菌的含水悬浮液、2-4体积优选约3体积的提取溶液、和约0.5-1体积的氯仿；

c)在室温下孵育混合物至少5分钟，更优选至少10分钟；

d)离心，优选在约2000×g下进行并收集含有糖脂级分的上清液(水相)，糖脂级分可以通过生物化学测定测量，例如通过电泳和银染、或通过在LPS存在下的细胞毒性抑制测定。

可以任选通过再添加水或含水缓冲液(以约等于移除的量的量)并再离心样品来将在d)中所获得的蓝细菌裂解物(其是通过离心所获得的沉淀)再抽提以获得糖脂级分。将第二上清液与第一上清液汇合并然后进行如下的进一步步骤：

e)通过添加诸如乙酸钠(5-20mM终浓度)的盐和等于约2体积的量的有机溶剂，优选丙酮进行沉淀，随后在与上述相同的条件下离心；

f)用经水稀释的乙醇如70％乙醇洗涤通过离心所获得的沉淀至少一次，优选两次，并在水溶液中重悬所述沉淀，所述水溶液优选为缓冲的水溶液，例如TRIS 50mM；

g)用核酸内切酶和核酸外切酶(例如DNA酶和RNA酶)酶促处理核酸污染物并随后用优选等于100μg/ml的量的蛋白酶如蛋白酶K处理蛋白污染物一段足够的时间(在37℃下至少1小时)。在酶促消化之后，再次离心样品，回收上清液并通过添加盐(例如，乙酸钠，大约10mM终浓度)和适当体积(优选2体积)的丙酮或其他有机溶剂而进一步沉淀。再次离心样品，并在水中或水溶液中重悬沉淀，并通过使用30千道尔顿截留的滤器(或其他合适的装置)进行分子筛分，从而导致通过滤器的每种成分被排除并使得保留的脂质级分连同水或缓冲的水溶液一起被回收。

如下测量如此获得的糖脂级分的活性：通过基于在产生诸如IL-6、IL-8 TNF-α和/或IL-1β的细胞因子的细胞(诸如THP1)中LPS(来自牙龈红棕色单胞菌或大肠杆菌)诱导的促炎活性的抑制的生物测试；和/或通过生物化学测定，例如电泳。

应理解本领域的技术人员可以对上述过程进行调整，在例如终浓度和/或体积和/或离心条件方面具有小改动，而不改变终产物的活性。

根据又一方面，本发明涉及用于纯化10)中所描述的糖脂级分的方法，该方法仅包括上述步骤g)。

移除痕量的有机溶剂如苯酚的步骤和去除大部分蛋白污染物的步骤对于应用于口腔是很重要的。

事实上，如上所述获得的糖脂提取物显示出小于2％的蛋白污染和小于5％的核酸污染，对于蛋白污染，根据通过用于蛋白测定的Bradford法进行的测量，并且对于核酸污染是根据通过用于核酸测定的260nm分光光度读数的测量。

根据优选的方面，本发明涉及用于在受龈疾病影响的患者中预防和治疗龈疾病的方法，所述龈疾病的范围以它们所有的不同阶段从较轻的形式，如龈炎到最严重的形式，如牙周炎(脓溢)，并且还包括慢性形式。该方法包括通过将糊剂或凝胶施用到感染部位或通过连续使用根据本发明的口腔卫生保护措施而用本发明的组合物之一治疗口腔。

此外，如上文所提到的，由于本发明组合物的抗促炎活性在细菌病原体根除之后将继续，所以我们认为本发明用于治疗和预防二者，因为在最严重形式的脓溢中齿龈或齿槽的炎症在牙齿部位水平上的后果主要在于牙周袋的形成，这继而会促进细菌定殖、感染复发和疾病的长期化。

此外，如由所呈现的实验数据而明显的，粗提取物不仅在与促炎性刺激物(在LPS来自牙龈红棕色单胞菌的具体情况下存在)一起施用时拮抗促炎性刺激物，而且在促炎性刺激物之前或之后施用(多达至少4小时之后)时也可以。对于治疗和/或预防，其意味着牙医的专业治疗，例如通过使用如下的本发明装置清除牙周袋，和维持较好的口腔卫生：具有本发明的任何组合物和装置的牙膏、凝胶、漱口剂、糖果或口香糖。

本发明还包括所述组合物在轻度龈炎情况下用于治疗齿龈发红的美容用途。

实验部分

实施例1.从Oscillatoria Planktothrix FP1培养物制备提取物.

通过对用于脂多糖(LPS)冷提取的方法适应当前需要的修改从蓝细菌Oscillatoria Planktothrix FP1(12)制备提取物，该方法目前仅用于革兰氏阴性菌的LPS提取，如Yi等人所描述的。详细地，将蓝细菌(CCAP 2第1459/45号，2008年7月9日，Scotland UK)1∶1稀释于水中，与3体积(其中体积单位是稀释于水中的蓝细菌的总体积)的Tri试剂(Sigma-Aldrich目录号T3934)和1体积的氯仿混合，并在室温下孵育10分钟。

在孵育结束时，以2000×g进行离心15分钟并收集含有活性级分的上清液(水相)，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后银染，进行评定。这之后，通过再添加水(以等于移除的量的量)从蓝细菌进一步提取，并再次离心样品。用乙酸钠(10mM终浓度)、2体积丙酮沉淀如此收集的上清液并离心。在离心结束时，移除上清液并用70％乙醇进一步洗涤沉淀两次。随后移除洗涤步骤的上清液并将沉淀溶解于50mm TRIS溶液中用于RNA酶和DNA酶消化，然后在37℃下过夜孵育期间用蛋白酶K(100μg/ml)消化。第二天，将样品以2000×g离心15分钟，回收上清液并用乙酸钠(10mM终浓度)和2体积丙酮沉淀。将如此获得的沉淀重悬于水中并使其通过30KD截留的滤器，从而消除具有较低分子量的所有组分。

将存留物再稀释于合适体积的水中以便获得用于后续生物测试的至少1mg/ml浓度的糖脂级分。如此获得的提取物显示出小于2％的蛋白污染和小于5％的核酸污染。

实施例2.牙龈红棕色单胞菌LPS诱导的促炎性细胞因子产生的抑制.

使用如前述实施例中所述制备的来自Oscillatoria Planktothrix FP1的糖脂级分来在人单核细胞系(THP1)中体外研究对促炎性细胞因子产生的作用。使单核细胞达到0.5×10⁶个细胞/ml的浓度，将其接种于24孔板(1ml/孔)中并在不存在或存在各种浓度(1-20μg/ml)的蓝细菌提取物的条件下用1μg/ml浓度的来自牙龈红棕色单胞菌的LPS孵育。还在仅存在浓度为10μg/ml的蓝细菌提取物的条件下进行培养。将培养物在37℃下具有5％CO2的加湿的培养箱中孵育18-20小时。孵育后，收集上清液并通过使用夹心的Diaclone ELISA试剂盒(人TNF-αELISA试剂盒目录号950.090.096、人IL-6 ELISA试剂盒目录号950.030.096、人IL-8 ELISA试剂盒目录号850.050.096、人IL1-β ELISA试剂盒目录号850.006.096)定量促炎性细胞因子(5)。

结果显示蓝细菌提取物不能够在THP-1细胞中诱导促炎性细胞因子产生。

在存在刺激单核细胞系中细胞因子产生的1μg/ml超纯的来自牙龈红棕色单胞菌的LPS(Invivogen LPS-PG)的条件下，同时添加到细菌LPS的提取物以剂量/反应依赖性方式显著地抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素8(IL-8)的产生。

将牙龈红棕色单胞菌LPS诱导的炎性细胞因子的产生作为100％，浓度为1μg/ml的粗提物被证明能够将TNF-α的产生抑制90％±10，将IL-6的产生抑制92％±5，将IL-8的产生抑制75±10％，将IL-1β的产生抑制62±8％(百分比代表三次重复的数据的平均值)。

证明在20μg/ml的浓度下，提取物能够强烈的抑制所测试的促炎性细胞因子的产生，区间在95％至100％之间(图1)。证明在20μg/ml的浓度下，提取物即使在牙龈红棕色单胞菌的LPS之后几小时添加时也能够施加其抑制作用(图1，1-4部分，多达4小时之后)。

实施例3.在复合的混合物中蓝细菌提取物的毒性、稳定性和溶解性的评定.

毒性

在包括1至100μg/ml之间的浓度下，在不同的细胞系(THP1、RAW264.7、SKMEL-28、HEY4、SHSY-5Y)中和在自外周血获得的单核细胞(PBMC，外周血单核细胞)中均测试了Oscillatoria Planktothrix FP1提取物，并且证明其即使在最高浓度(100μg/ml)下使用时也是无毒的。

溶液中的稳定性

将如实施例1中所述制备的Oscillatoria Planktothrix FP1提取物与葡萄糖酸氯己定在室温下在水中混合30分钟；随后，纯化以去除氯己定，再次测试其对单核细胞培养物的作用。结果显示如通过抑制来自牙龈红棕色单胞菌的LPS诱导的TNF-α产生的能力所测量的，糖脂提取物保留其活性。通过与在不存在氯己定的条件下所观察到的那些抑制相类比，在存在浓度为1、2、4μg/ml的提取物的情况下抑制分别为95％、96％和99％。在孵育时间结束时检查相同培养物中的细胞成活力，证明细胞成活力在所有培养物中均为100％。

固体基质中的稳定性

将Oscillatoria Planktothrix FP1提取物包埋在羟乙基纤维素基质中，并且在一个月后测试生物活性。同样在这种情况下，结果显示糖脂提取物保留其生物活性，在1、2、4μg/ml的浓度下的抑制程度分别等于90％、93％和96％，且不影响细胞成活力。

热稳定性

将如实施例1中所述制备并且溶解在水中的Oscillatoria Planktothrix FP1提取物升至100℃持续5分钟，并随后测试生物活性。即使在这种情况下，结果显示糖脂提取物保留对牙龈红棕色单胞菌LPS诱导的TNF-α产生的抑制活性而不影响细胞成活力。

溶解性

将在实施例1中制备的Oscillatoria Planktothrix FP1提取物以最多比实施例2中所描述的实验中测试的最佳浓度高100倍的不同浓度溶解于水中。

表1呈现了在水和二甲基亚砜(DMSO)中的溶解性的数据。

表1：糖脂提取物的溶解性

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