三萜皂苷化合物在制备治疗自身免疫学疾病的药物中的应用

摘要

本发明提供了一种三萜皂苷化合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，特别是在制备治疗移植排斥、支气管哮喘、HBV、肾病综合症、甲亢阴虚或系统性红斑狼疮的药物中的应用，其中，所述三萜皂苷化合物为由以下化学通式表示的三萜皂苷化合物：在以下化学通式中：R

说明书

技术领域

本发明涉及三萜皂苷化合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，特别是涉及在制备治疗移植排斥、支气管哮喘、HBV、肾病综合症、甲亢阴虚、系统性红斑狼疮的药物中的应用。

背景技术

中药是中医防治疾病、健康保健的物质基础和载体，蕴含了丰富的科学内涵和极高的实用价值。随着人类医疗保健事业的不断发展和中医药走向世界的态势日趋明显，对中医药资源的社会需求出现了前所未有的增长，供需矛盾日渐突出。合理开发和保护中药资源，实现中药资源的可持续利用已成为中国政府和中医药行业的基本共识。

从野生动植物中发现和寻找新结构、新化合物已成为一种趋势。这些都在不同程度上加大了中药资源的压力。加上长期以来对合理开发利用中药资源的认识缺陷，不少地区在不同程度上对中药资源进行了掠夺式的过度采收、采猎，致使到目前，很多中药资源濒临灭绝。因此，如何正确有效的利用中药用动植物资源，如何保证中药资源的可持续开发和利用等方面的问题亟待解决。

三萜皂苷类化合物是存在于多种药用植物中的一类具有三萜结构主体并在3位羟基和28位羧基上分别通过糖苷键和酯键连接有糖链的皂苷化合物。例如从地乌的根茎中分离得到多种具有齐墩果酸主体结构的三萜皂苷，并发现这些化合物具有一定的抗癌活性(张兰天等，中国中药杂志，第33卷第14期，2008年7月：1696-1699)。中国专利申请公开CN101528209A中公开了从多种植物中提取的齐墩果烷型三萜皂苷化合物在改善记忆和学习能力方面的用途。

目前三萜皂苷的来源主要从植物中获得，而中药资源短缺，原生态原料药材无法满足供应，期望能用化学合成方法作为解决中药资源短缺，保护中药药材资源的有效途径。而且，通过化学合成技术，合成其药用活性成分，应是解决植物资源匮乏的重要手段之一。且用化学合成技术合成具有不受资源限制、更适合相关药品工业化生产的优势。本申请的发明人曾经以齐墩果酸和单糖为原料成功合成了地乌皂苷W3(中国专利申请公开CN101100482A)。然而，天然存在的三萜皂苷类化合物通常连接有多条多糖链，且每条糖链通常有三个以上的糖。这样的结构使这类化合物的合成异常复杂，副产物多，最终收率较低，难以进行大规模产业化应用。

此外，三萜皂苷类化合物在其他疾病方面的应用还鲜有研究。

移植排斥、支气管哮喘、HBV、肾病综合症、甲亢阴虚、系统性红斑狼疮与自身免疫性疾病有关。目前利用西药和中药来治疗自身免疫性疾病，利用西药时，主要应用抗炎和调节免疫两类药品，常用药物有以下几种：

1)非甾体抗炎药-此类药物因可抑制前列腺素的合成而迅速产生抗炎、解热、镇痛作用，对解除疼痛有较好效果，但不能改变疾病的病程。常见的有布洛芬、芬必得(缓释布洛芬)、扶他林、阿司匹林、吲哚美辛等。在疗效方面，该类药品均只有70-80％有效。

2)糖皮质激素类药物-抗炎、抑制免疫炎症，应用糖皮质激素治疗风湿病只能缓解病情，停药后易复发，且长期服用副作用较大，所以必须采用综合治疗，一般不作为首选药物。常见药品有可的松、强的松、倍他米松等。

3)免疫调节药物(细胞毒药物)-此类药物通过不同途径产生免疫抑制作用。它们是系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和血管炎的二线药物，副作用虽较多且较严重，但改善这些疾病的预后有很大的作用。常用的有环磷酰胺、甲氨蝶呤。

中药方面，治疗风湿类疾病的产品比较复杂，各种不同种类、不同剂型均有涉及，功能疗效各异。可分为内服药和外用药两类，内服药可起到祛风湿、活气血、扶正气、调理脏腑阴阳的目的，外用药用于消肿止痛，控制病情。内服药又可分为单味药和复方制剂。单味药制剂一般含雷公藤、青藤碱等免疫抑制成分，与西药作用类似；复方制剂则功效相对较宽，在剂型上形式多样，包括片剂、胶囊、口服液、药酒等多种形式。中药除个别对性腺有抑制外，多数副作用极小，适合长期服用。但中药起效较慢，一般需4-8周才有比较明显的效果。外用药方面，目前主要以贴膏为主，另有少部分乳霜、喷雾等产品形式，因其功效可迅速缓解症状，因此，是大多数风湿患者的首选、必选药品。

风湿类疾病是一种常见的自身免疫性疾病，可累及多个器官和组织。临床发病率高。由于其发病机理不完全清楚，目前尚无特效治疗方法(卢君健，结缔组织病中西医诊治学，人民卫生出版社，1992：348)。临床多采用皮质类固醇激素及细胞毒药物等综合治疗，但这常造成机体的非特异性免疫抑制等不良后果。

申请人合成的蜈蚣三七有效成分制剂应用于治疗风湿类疾病。本制剂在治疗风湿类疾病时，是通过针对机体特定的免疫调节状态来调节免疫，避免非特异性免疫抑制及药物的毒性作用，具有疗效显著、毒副作用小的优点。

发明内容

本发明是为了至少部分解决上述问题而提出的。

本发明的一个目的在于提供一种三萜皂苷化合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，其中，所述三萜皂苷化合物为由以下化学通式I表示的三萜皂苷化合物：

化学通式I

在以上化学通式I中，R₁、R₂和R₃中的任意两个为甲基，且另一个为氢原子，R₄可为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖，或所述单糖或二糖的醛酸衍生物形成的糖苷基，R₅可为氢原子，或者可为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖，或所述单糖或二糖的醛酸衍生物形成的取代基。

其中，优选R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，或R₁和R₂中的任意一个为甲基、另一个为氢原子，且R₃为甲基。

R₄优选为选自由L-鼠李糖、D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖和D-葡萄糖醛酸中的一种形成的糖苷基，最优选为L-鼠李糖或D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷形成的糖苷基；R₅优选为氢原子，或为选自由L-鼠李糖、D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖和D-葡萄糖醛酸中的一种形成的取代基，最优选为氢原子、L-鼠李糖基或D-木糖基；当R₅为由上述糖或其衍生物形成的取代基时，R₄和R₅可相同或不同。

优选R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为L-鼠李糖，R₅为氢原子。

优选R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为L-鼠李糖，R₅为L-鼠李糖。

优选R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷形成的糖苷基，R₅为氢原子。

优选R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷形成的糖苷基，R₅为L-鼠李糖。

本发明的第二目的在于提供一种治疗自身免疫性疾病的药物组合物，包含有效量的上述化学通式I的三萜皂苷化合物，为液体制剂、注射剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂、栓剂、膏剂、凝聚剂、膜剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释与控释剂、经皮给药系统、靶向制剂、粉剂、锭剂或扁囊剂。

所述治疗自身免疫性疾病的药物组合物的给药途径为口服、注射、直肠或胃肠外给药以及外用局部给药。

优选载体为淀粉，制成胶囊剂口服给药。

所述治疗自身免疫性疾病的药物组合物为治疗移植排斥、支气管哮喘、HBV、肾病综合症、甲亢阴虚或系统性红斑狼疮的药物组合物。

根据本发明，提供了具有明显的治疗自身免疫性疾病作用的药物。

具体实施方式

以下结合具体实施方式详细地说明本发明的各个方面。

化学通式I的三萜皂苷化合物

本发明提供由以下化学通式I表示的三萜皂苷化合物。

化学通式I

在以上化学通式I中，R₁、R₂和R₃中的任意两个为甲基，且另一个为氢原子。也就是说，以齐墩果酸结构(即：R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子)或熊果酸结构(即：R₁和R₂中的任意一个为甲基、另一个为氢原子，且R₃为甲基)为主体结构。

R₄(即3位羟基上的取代基)可为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖，或所述单糖或二糖的醛酸衍生物形成的糖苷基。R₄优选为选自由L-鼠李糖、D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖和D-葡萄糖醛酸中的一种形成的糖苷基，最优选为L-鼠李糖或D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷形成的糖苷基。

R₅(即28位羧基上的取代基)可为氢原子，或者可为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖，或所述单糖或二糖的醛酸衍生物形成的取代基。R₅优选为氢原子，或为选自由L-鼠李糖、D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖和D-葡萄糖醛酸中的一种形成的取代基，最优选为氢原子、L-鼠李糖基或D-木糖基。当R₅为由上述糖或其衍生物形成的取代基时，R₄和R₅可相同或不同。

本发明的三萜皂苷化合物可以为以下化学式I-1～I-4所示的化合物。

化学式I-1：齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖

化学式I-2：齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷

化学式I-3：齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷

化合物I-4：齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷

本发明人惊奇地发现，上述三萜皂苷化合物虽然结构简单得多，但具有与天然三萜皂苷化合物几乎相同的药用效果，即可以用于治疗痴呆症，特别是老年痴呆症，阿尔茨海默病等；还可用于癌症的治疗。进一步的研究显示，本发明的化学通式I所示的三萜皂苷化合物在治疗高血压，由病原微生物引起的疾病(如结核病、麻风病等)，以及自身免疫性疾病(如移植排斥、支气管哮喘、HBV、肾病综合症、甲亢阴虚、系统性红斑狼疮等)方面也具有令人满意的效果。与本发明化合物相关的医药用途将在下面详细说明。

此外，本发明的化学通式I所示的三萜皂苷化合物与植物中存在的天然三萜皂苷化合物相比具有简单得多的结构，从而使其合成制药的产业化应用成为可能。以下将更具体地说明本发明三萜皂苷化合物的合成方法。

化学通式I的三萜皂苷化合物的合成方法

以上化学通式I所示的三萜皂苷化合物采用汇聚式半合成方法来制备。本文所称的“半合成方法”是指以可商购的齐墩果酸或熊果酸，以及所需的五或六元糖为起始原料进行的合成。本文所称的“汇聚式方法”是指分别对齐墩果酸或熊果酸，以及所要连接的糖进行非反应位点的活性基团保护，并对要进行反应的位点进行活性基团取代，然后进行糖苷化或酯化反应，反应完成后去保护以得到终产物。

以上化学通式I所示的三萜皂苷化合物的合成方法具体包括以下步骤：

步骤1：对所述五或六元糖或其衍生物的羟基进行保护；使三氯乙腈或硫醇与经羟基保护的糖或其衍生物的半缩醛羟基进行反应，得到至少一种化合物A备用；

步骤2：使三苯基氯甲烷与齐墩果酸或熊果酸进行反应，得到化合物B备用；

步骤3：使至少一种化合物A与化合物B进行反应，并用醇钠脱保护，得到R₅为氢原子的化学通式I的化合物；或者

使至少一种化合物A与化合物B进行反应，并用乙酸脱保护后，再与步骤1中制备的至少一种化合物A进行反应，然后用甲醇钠脱保护，其中，所述至少一种化合物A可以相同或不同。

下面分别详细说明各个步骤。

步骤1：制备化合物A(糖或其衍生物的羟基保护及其半缩醛羟基的活化取代)

所述糖或其衍生物是准备要连接到上述化学通式I的3位羟基或28位羧基上以便形成R₄和/或R₅取代基。糖或其衍生物的种类如上所述，这里不再赘述。优选羟基保护基团为苄基和/或乙酰基。具体地，可采用苯甲酰氯(BzCl)或乙酸酐(Ac₂O)与糖或其衍生物进行反应，但不限于此。

对于L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-核糖或D-葡萄糖醛酸，优选采用苄基进行羟基保护，其优点在于产物的收率高，易于形成晶体。

对于D-葡萄糖或D-木糖，优选用乙酰基进行羟基保护，其优点在于产物的收率高，易于形成晶体。

接着，使三氯乙腈(Cl₃CCN)或硫醇(R’SH，R’为C₁-C₆的烷基)与经羟基保护的糖或其衍生物的半缩醛羟基进行反应，得到产物A，即三氯乙酰亚胺酯类化合物或硫醚类化合物。硫醇可以是例如乙硫醇(EtSH)、丙硫醇、异丙硫醇等。

优选，对于L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-核糖或D-葡萄糖醛酸，采用苄基进行羟基保护后用三氯乙腈与半缩醛羟基进行反应，便于合成反应时容易脱去该位置的保护，使后续反应能顺利进行。

优选，对于D-葡萄糖或D-木糖，用乙酰基进行羟基保护后用硫醇与半缩醛羟基进行反应，便于后续合成反应能顺利脱去保护而进行反应。

本步骤中可制备多种糖及其衍生物的化合物A，以便分别连接到主体化合物的3位和28位；或者在3位和28位中的至少一个位置上形成二糖。

步骤2：制备化合物B(齐墩果酸或熊果酸的羧基保护)

使三苯基氯甲烷与齐墩果酸或熊果酸进行反应，在28位羧基上形成三苯甲酯，从而得到化合物B。

步骤3：制备化学通式I的化合物

1、制备R₅为氢原子的化合物(3位羟基的取代)

使化合物A与化合物B进行反应，用醇钠脱保护，得到R₅为氢原子的化学通式I的化合物。

此时，由于化合物A的羟基以及化合物B的羧基已经被非活性基团保护，因而只有化合物A的半缩醛羟基与化合物B的三位羟基进行反应，生成糖苷键。该反应在低温(约零度)、氮气保护的条件下得到偶联产物，实现了糖(或其衍生物)与羟基偶联的可行性。

如果需要在3位羟基处连接一个二糖，则在使化合物A与化合物B反应完成后不进行脱保护，将产物分离纯化后继续与另外的化合物A进行反应。反应完成后再用醇钠脱保护，从而得到3位羟基处连接一个二糖的化学通式I的化合物。

在制备化合物I-4时，上述反应以2位羟基的木糖硫苷与齐墩果酸偶联选择性得到β构型的产物，再连接另一个糖到木糖的2位，实现了1，2连接的二糖选择性的以β构型的方式与主体化合物3位羟基连接。从而，在反应中，使构象不稳定的α构型趋于更稳定的三个平伏键，一个直立键的β构型木糖合成物。

此外，脱保护采用醇钠，例如甲醇钠、乙醇钠等。因脱保护时反应条件温和，从而确保了中间产物酯基产物的稳定性。

2、制备R₅为糖或其衍生物形成的取代基的化合物

使化合物A与化合物B进行反应，用乙酸脱保护，得到化合物C；再使化合物C与步骤1制得的化合物A(可与上步反应中的化合物A相同，也可不同)进一步反应，并用醇钠脱保护，得到R₅为糖或其衍生物的化学通式I的化合物。

化合物A与B进行反应后用乙酸可脱去主体结构28位羧基上的三苯甲基，而不会使糖羟基上的保护基脱去。这样可使产物，化合物C的28位羧基继续与其他化合物A进行反应。

如果在主体结构的3位和28位的任何一个位点要连接一个二糖，则可依据与前述相同的方式，用相同或不同的化合物A进行连续反应，之后再脱保护。相信本领域的普通技术人员在此前描述的教导下并结合下面的具体实施例，能够理解和实施连接二糖的制备方法，此处就不再赘述。

以下以齐墩果酸作为主体结构，根据合成实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明不被以下合成实施例所限定。本领域的普通技术人员应理解，在本发明的化学通式I的三萜皂苷化合物中，是以主体结构中3位羟基和28位羧基为反应位点，因此，下述合成实施例中的齐墩果酸均可被熊果酸所替代。

实施例1齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖的合成

以天然产物α-L-吡喃鼠李糖(化合物1，购自科博思生物科技有限公司)和齐墩果酸(化合物5，购自西安冠宇生物技术有限公司)作为起始原料。按照以下图示的反应路线进行合成。

具体来说将化合物1(α-L-吡喃鼠李糖)20g在冰浴下搅拌，取苯甲酰氯(BzCl)75ml溶于作为溶剂I的吡啶(Pyr)150ml中，缓慢滴入上述溶液中，室温下搅拌过夜，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化分离，得到化合物2(33.8g)。将化合物2溶于四氢呋喃(THF)和甲醇(四氢呋喃/甲醇＝1/3)的混合溶剂中，通入氨气，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)纯化分离，得到化合物3(17.6g)。

在氮气保护下将化合物3溶于作为溶剂II的二氯甲烷(DCM)(用氢化钙干燥过的二氯甲烷)100ml中，加入三氯乙腈26ml和1，8二氮杂双环[5，4，0]十一碳烯-7(DBU)2.6ml，室温搅拌过夜，然后减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)纯化分离，得到化合物4(14.6g)。

将化合物5(齐墩果酸，10g)加入四氢呋喃(油浴86℃去水的四氢呋喃55ml)中，加入1，8二氮杂双环[5，4，0]十一碳烯-7(DBU)5ml和三苯基氯甲烷(CCNCl₃)7.4g，在100℃搅拌回流，反应过夜，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物6(7.5g)。

氮气保护下将化合物4(2.3g)和化合物6(3g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷60ml中，冰盐浴下加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)100μl，搅拌反应1.5～2.0小时后，用薄层色谱检测反应完全后，加入三乙胺中和反应体系，加入二氯甲烷500ml稀释、用饱和的碳酸氢钠洗涤、分液漏斗分离二氯甲烷部分并用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化分离，得到化合物7(1.6g)。

将化合物7溶于甲醇钠的甲醇溶液中，室温下搅拌，反应5～10小时，薄层色谱检测反应完全后，以酸性离子交换树脂中和反应体系至中性，滤去树脂，减压浓缩，用淋洗液为去离子水的Bio-gel P₂凝胶色谱柱(美国Bio-Rad公司)纯化得到化合物8，即为目标化合物，齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖(0.82g，白色固体，产率为73％)。

用Bruker ARX-400在CDCl₃中测得¹H和¹³C核磁共振谱，化学位移以Me₄Si为内标，以ppm为单位表示。Mass在JEOL JMS-700质谱仪上检测。

[α]_D²⁵+7.8°(c 1，H₂O)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ0.72(s，6H，2CH₃)，0.87(s，9H，3CH₃)，1.09(s，3H，CH₃)，1.10(s，3H，CH₃)，2.74(dd，1H，J 3.9，10.8Hz，H-18of oleanolic acid)，3.01(dd，1H，J 3.5，9.7Hz，H-3of oleanolicacid)，3.17(m，1H)，3.40(m，1H)，3.49(m，1H)，3.62(br s，1H)，4.52(d，1H)，4.58(s，1H)，4.70(m，2H)，5.16(br s，1H，H-12ofoleanolic acid)，12.05(s，1H).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ178.7，143.9，121.6，103.0，87.6，72.2，70.8，70.8，68.6，54.7，47.1，45.8，45.5，41.4，40.9，38.8，38.6，37.9，36.4，33.4，32.9，32.4，32.2，30.5，28.0，27.3，25.7，25.0，23.5，23.0，22.7，17.9，17.8，16.9，16.5，15.2.Anal.Calcd for C₃₆H₅₈O₇：C，71.72；H，9.70；Found：C，71.90；H，9.82.

反应中所述的溶剂I为吡啶或者三乙胺；溶剂II为二氯甲烷、乙腈、甲苯或者它们的混合物。

实施例2齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷的合成

以实施例1中得到的化合物7和化合物4作为起始原料。按照以下图示的反应路线进行合成。

将实施例1中得到的化合物8(8g)，加入80％乙酸20ml，在70℃下搅拌2小时后，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物9(6.4g)。

氮气保护下将化合物9(4g)和化合物4(2.3g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷100ml中，室温搅拌下加入N-碘代丁二酰亚胺1.1g，降温至-40℃～-50℃，加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯100μl，-35℃～-45℃下搅拌1.5～2.0小时后，用薄层色谱检测反应完全后，加入三乙胺中和反应体系，然后加入二氯甲烷500ml稀释、用饱和的碳酸氢钠洗涤、分液漏斗分离二氯甲烷部分，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物10(5.1g)。

将化合物10(2g)溶于甲醇钠的甲醇溶液中，室温下搅拌，室温反应5～10小时，薄层色谱检测反应完全，以酸性离子交换树脂中和反应体系至中性，滤去树脂，减压浓缩，用淋洗液为去离子水的Bio-gel P₂凝胶色谱柱(美国Bio-Rad公司)纯化得到化合物11，即为目标化合物，齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(1.6g，白色固体，产率为72％)。

用Bruker ARX-400在CDCl₃中测得¹H和¹³C核磁共振谱，化学位移以Me₄Si为内标，以ppm为单位表示。Mass在JEOL JMS-700质谱仪上检测。

[α]_D²⁵+11°(c 1.5，H₂O)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ0.79-1.91(m，49H)，2.90(dd，1H，J 4.1，12.8Hz，H-18 of oleanolic acid)，3.09(dd，1H，J 4.2，11.3Hz，H-3of oleanolic acid)，3.35(t，1H，J 6.9，12.0Hz)，3.43(t，1H，J 9.5Hz)，3.61-3.72(m，4H)，3.75(br s，1H)，3.82(br s，1H)，4.72(d，1H，J 2.1Hz，H-1)，5.31(br s，1H，H-12of oleanolic acid)，5.92(d，1H，J 2.3Hz，H-1).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ175.3，143.6，122.7，103.1，93.6，87.8，72.4，71.8，71.4，71.1，71.0，70.9，69.9，68.8，55.2，47.3，46.9，45.7，41.6，41.5，38.4，36.7，33.5，33.1，32.8，32.5，30.8，28.3，27.35，25.98，26.0，25.3，23.7，23.4，22.8，18.2，18.1，17.3，16.8，15.5.Anal.Calcd for C₄₂H₆₈O₁₁：C，67.35；H，9.15；Found：C，67.60；H，9.08。

实施例3齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷的合成

以天然产物β-D-吡喃木糖(化合物1，购自郑州天健生物技术有限公司)，β-D-葡萄糖(化合物9，购自北京格莱蒙特国际贸易有限公司)和齐墩果酸(化合物12，购自西安冠宇生物技术有限公司)作为起始原料。按照以下图示的反应路线进行合成。

具体来说将化合物1(β-D-吡喃木糖)20g溶于作为溶剂I的吡啶200ml中，加入乙酸酐81.6ml，室温下搅拌反应2～4小时，薄层色谱检测反应完全后，浓缩，柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化分离，得到化合物2(38克)。将化合物2(38g)在氮气保护下溶于作为溶剂II的二氯甲烷200ml中，并加入溴化氢100ml，室温下搅拌反应1～2小时，薄层色谱检测表明反应完全后，减压浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)，得到化合物3(20克)。

将化合物3(20g)在氮气保护下加入2，6-二甲基吡啶(2，6-lutidine)10ml，乙硫醇(EtSH)8.8ml和硝基甲烷74.1ml，室温下搅拌反应过夜，薄层色谱检测表明反应完全，减压浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)，得到化合物4(15.4g)。

将化合物4(15.4g)溶于作为溶剂III的甲醇中，室温下搅拌，加入甲醇钠的甲醇溶液，使pH值在9到11之间，室温反应2～4小时，薄层色谱检测反应完全后，浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)，得到油状化合物5(10.2g)，将化合物5(10.2g)溶于作为溶剂I的吡啶150ml中，冰水浴下搅拌，取苯甲酰氯12.1ml溶于作为溶剂I的吡啶12ml中，缓慢滴入上述溶液中，室温下搅拌3～6小时，薄层色谱检测表明反应完全后，减压浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)，得到化合物6(15.5g)。

在氮气保护下将化合物6(15.5g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷100ml中，加入氯化锌(1M/L)5ml，冰水浴下搅拌3～6小时后减压浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)，得到化合物7(15g)。

将化合物7(15g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷与作为溶剂IV的甲醇的混合液中(1∶1，150ml)，冰水浴下加入乙酰氯20ml，1小时后撤冰浴，室温下搅拌3～6小时，薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝6/1)，得到化合物8(12g)。

将化合物9(β-D-葡萄糖)25g加入无水乙酸钠(22.5g)和乙酸酐(100ml)并在150℃油浴锅中搅拌，回流，反应半小时后，用薄层色谱检测反应完全后，萃取浓缩，重结晶得到化合物10(35g)，取10g溶于50ml二氯甲烷，在冰水浴下加入乙硫醇2.85ml，三氟化硼乙醚9.7ml，搅拌反应1小时，用薄层色谱检测反应完全后，萃取浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)纯化分离，得到化合物11(7g)。

将化合物12(齐墩果酸，10g)加入四氢呋喃(油浴86℃去水的四氢呋喃55ml)中，加入1，8二氮杂双环[5，4，0]十一碳烯-7(DBU)5ml和三苯基氯甲烷7.4g，在100℃搅拌回流，反应过夜，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物13(7.5g)。

氮气保护下将化合物8(4g)和化合物13(5.8g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷100ml，室温搅拌下加入N-碘代丁二酰亚胺(NIS)2.2g，降温至-40℃～-50℃，加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯200μl，-35℃～-45℃下搅拌1.5～2.0小时后，用薄层色谱检测反应完全后，加入三乙胺中和反应体系，然后加入二氯甲烷500ml稀释、用饱和的碳酸氢钠洗涤、分液漏斗分离二氯甲烷部分，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物14(7.1g)。

氮气保护下将化合物14(4.4g)和化合物11(2g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷50ml，室温搅拌下加入N-碘代丁二酰亚胺1.1g，降温至-40℃～-50℃，加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯100μl，-35℃～-45℃下搅拌1.5～2.0小时后，用薄层色谱检测反应完全后，加入三乙胺中和反应体系，然后加入二氯甲烷500ml稀释、用饱和的碳酸氢钠洗涤、分液漏斗分离二氯甲烷部分，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物15(3.6g)。

将化合物15(3.6g)溶于甲醇钠的甲醇溶液中，室温下搅拌，室温反应5～10小时，薄层色谱检测反应完全，以酸性离子交换树脂中和反应体系至中性，滤去树脂，减压浓缩，用淋洗液为去离子水的Bio-gel P₂凝胶色谱柱(美国Bio-Rad公司)纯化得到化合物16，即为目标化合物，齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷(1.2g，白色固体，产率为72％)。

用Bruker ARX-400在CDCl₃中测得¹H和¹³C核磁共振谱，化学位移以Me₄Si为内标，以ppm为单位表示。Mass在JEOL JMS-700质谱仪上检测。

[α]_D²⁵+7.2°(c 1，H₂O)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ0.35，0.82，0.88，0.90，0.91，1.11，1.29(7s，7×3H，7CH₃)，2.83(dd，1H，J 4.1，13.0Hz，H-18ofoleanolic acid)，3.25(dd，1H，J 4.4，11.6Hz，H-3of oleanolic acid)，3.66-4.87(m，28H)，4.82(d，1H，J 7.3Hz，H-1of Xyl)，4.98(d，1H，J 7.8Hz，H-1ofGlc)，5.20-5.25(m，12H)，5.29(t，1H，J 3.2，H-12of oleanolic acid).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ176.4，144.0，122.8，104.8，101.8，95.6，88.4，79.5，78.6，78.0，77.1，76.4，75.3，74.0，72.7，72.3，70.7，69.7，69.1，66.9，56.0，48.0，46.9，46.1，42.0，41.6，39.8，36.9，33.9，33.0，32.4，30.7，27.9，28.2，26.0，23.7，23.6，23.3，17.4，17.0，15.6.Anal.Calcd for C₄₁H₆₆O₁₂：C，65.57；H，8.86；Found：C，65.57；H，8.86。

反应中所述的溶剂I为吡啶或者三乙胺；溶剂II为二氯甲烷、乙腈、甲苯或者它们的混合物；溶剂III为甲醇或者乙醇。

实施例4齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷的合成

以实施例3中得到的化合物15和化合物8作为起始原料。按照以下图示的反应路线进行合成。

将实施例3中得到的化合物15(4g)，加入80％乙酸20ml，在70℃下搅拌2小时后，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物17(3.1g)。

氮气保护下将化合物17(2g)和化合物8(0.9g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷50ml，室温搅拌下加入N-碘代丁二酰亚胺0.7g，降温至-40℃～-50℃，加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯76μl，-35℃～-45℃下搅拌1.5～2.0小时后，用薄层色谱检测反应完全后，加入三乙胺中和反应体系，然后加入二氯甲烷500ml稀释、用饱和的碳酸氢钠洗涤、分液漏斗分离二氯甲烷部分，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物18(1.9g)。

将化合物18(1.9g)溶于甲醇钠的甲醇溶液中，室温下搅拌，室温反应5～10小时，薄层色谱检测反应完全，以酸性离子交换树脂中和反应体系至中性，滤去树脂，减压浓缩，用淋洗液为去离子水的Bio-gel P₂凝胶色谱柱(美国Bio-Rad公司)纯化得到化合物19，即为目标化合物，齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(0.9g，白色固体，产率为72％)。

用Bruker ARX-400在CDCl₃中测得¹H和¹³C核磁共振谱，化学位移以Me₄Si为内标，以ppm为单位表示。Mass在JEOL JMS-700质谱仪上检测。

[α]_D²⁵+6°(c 1.2，H₂O)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ0.38，0.89，0.91，0.93，0.98，1.13，1.26，1.31(8s，8×3H，8CH₃)，2.89(dd，1H，J 3.8.，11.2Hz，H-18 of oleanolic acid)，3.34(dd，1H，J 4.7，11.7Hz，H-3of oleanolic acid)，3.57-4.89(m，32H)，4.88(d，1H，J 7.5Hz，H-1of Xyl)，5.11(d，1H，J 7.8Hz，H-1ofGlc)，5.26-5.29(m，14H)，5.32(t，1H，J 3.2，H-12of oleanolic acid)，6.53(br s1H，H-1of Rha).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ177.8，172.3，170.8，162.5，158.3，151.6，149.3，145.2，143.1，139.6，133.8，128.7，125.3，122，9，114.3，111.2，108.3，102.1，98.6，92.3，86.7，79.4，73.5，69.3，62.1，58.8，52.2，48.3，43.2，40.5，38.6，35.4，33.8，31.6，29.7，26.5，25.7，23.6，22.4，21.3，20.1，19.8，18.7，16.4，15.8，15.2，14.5.Anal.Calcd for C₄₇H₇₆O₁₆：C，62.93；H，8.54；Found：C，63.11；H，8.66。

化学通式I的三萜皂苷化合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途

本发明的化学通式I的三萜皂苷化合物具有明显的治疗自身免疫性疾病的作用。还可以将有效量的本发明的化学通式I的三萜皂苷化合物与药学领域常规的药物载体混合制成液体制剂、注射剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂、栓剂、膏剂、凝聚剂、膜剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释与控释剂、经皮给药系统、靶向制剂、粉剂、锭剂、扁囊剂等，所述药物载体例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等；另外还可以在药物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。可以通过口服、注射、直肠或胃肠外给药以及外用局部给药的方式施用于需要这种治疗的患者。在本申请中优选载体为淀粉，剂型为胶囊，口服给药。

实施例5三萜皂苷对心肌组织移植反应的影响

1受试药物

三萜皂苷(实施例1中得到的齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)，三萜皂苷2(实施例3中得到的齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)90％。

2方法

取体重20±2g的雄性昆明种小鼠(约10±2周龄)作为受体鼠，用新生24h内的新生鼠作为供心鼠。受体鼠经0.4％戊巴比妥钠(0.4mg/kg体重)腹腔注射后，用0.1％新洁尔灭酊涂于耳廓局部消毒。于耳廓背侧中线下1/3处作一3～4mm的横切口，勿损伤耳廓静脉，持眼科剪刀向耳尖方向钝性分离皮下组织，使成3～4mm深的囊腔；新生供心鼠，经皮肤消毒后，剖胸摘取心脏；作半心移植时，用刀片将供心纵向剖成基本等大的两半，分别在Hank’s液中蘸洗二次。移植心肌组织的离体时间不超过2min。持眼科镊将移植心轻柔地填入受体鼠耳后移植床内，切口缝合一针，用手指轻按局部，使移植物与受体鼠之周围贴紧。自术后第6天起，间目测录移植心肌组织的心电图(ECG)。在接近排异终点阶段，每日测录心电图。凡术后第8天尚不能测出ECG的，以后亦不会有心电活动，故将在术后第8天不能测出ECG者，定为移植手术失败。在手术成功例中，将ECG上心电活动消失日期定为排异反应的终点。

移植心肌组织ECG的测定是将正负电极分别置于植床之前后或左右两侧，接地极取于受体鼠左后肢，记录时，取心电图机上的II导联，纸速为25mm/s，定标电压1mv＝2mm。

受试药物在心肌组织移植存活时给予，三萜皂苷(齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)分为三个剂量组，剂量分别为400、200、100mg/kg；(齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)150mg/kg；醋酸泼尼松片组，25mg/kg；空白组，蒸馏水20ml/kg。灌胃给予，于移植当天至死亡。比较给药组与空白组的存活时间。此处成活时间是指移植后第6天出现心电图，以后随着排异反应的发生，而逐渐消失的动物的存活时间。

3结果

结果表明，三萜皂苷(齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)高中剂量组，(齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)均可明显延长移植心脏的存活时间，与空白组相比较具有高度显著性差异(P＜0.05，P＜0.001)。提示该药具有抑制IV型变态反应的作用。结果如表1所示。

表1三萜皂苷(齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)对心肌组织移植反应的影响

与空白组相比较(t检验)，*P＞0.05，**P＜0.05，****P＜0.001。

实施例6三萜皂苷治疗支气管哮喘的实验研究

1受试药物

三萜皂苷1(实施例1中得到的齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)，三萜皂苷2(实施例3中得到的齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)90％。

2方法

2.1分组与造模

取豚鼠(华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。合格证号：医动字第19-023号)48只，雌雄各半，在相同条件下雌雄分笼适应性喂养1周，常规喂养标准颗粒饲料。随机分4组，每组12只，雌雄各半。分别设为模型对照组、阳性对照组和三萜皂苷1组、三萜皂苷2组。

造模方法：每只豚鼠分别腹腔注射10％卵白蛋白生理盐水溶液1ml，豚鼠处于致敏状态，16天后，将豚鼠置于干燥器中，再以1％卵白蛋白生理盐水溶液雾化吸入6min诱喘。可出现咳嗽、呼吸加快加深，腹肌收缩，烦躁不安等症状。

2.2用药

模型对照组用生理盐水雾化吸入；阳性对照组用布地奈德气雾剂雾化吸入，雾化浓度为0.2g/L；三萜皂苷1组2mg/ml、三萜皂苷2组1mg/ml，雾化吸入给药，每次喷3mg，在豚鼠致敏后第二日开始给药，雾化给药时间均为1min，连续给药16日。末次给药1h后，以1％卵白蛋白雾化吸入6min，观察豚鼠发生呼吸困难的潜伏期(精确到秒)及跌倒死亡数，6min以上未发生哮喘的动物潜伏期按6min计算。

3结果

由表2可知，布地奈德气雾剂对豚鼠支气管哮喘有治疗作用，能够延长豚鼠的引喘潜伏期(P＜0.05，保护了10/12的动物未发生抽搐、死亡。吸入三萜皂苷喷雾剂在浓度为2、1mg/ml时分别保护了8/11、7/10的动物未发生致死性的哮喘反应，引喘潜伏期也被延长(P＜0.01或P＜0.05)。

表2三萜皂苷对豚鼠支气管哮喘的治疗结果

注：与模型对照组比较，P＜0.05；P＜0.01。

实施例7三萜皂苷在体外细胞培养中抗HBV作用的研究

1受试药物

三萜皂苷1(实施例1中得到的齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)，三萜皂苷2(实施例3中得到的齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)90％。

2方法

2.12.2.15细胞培养液及试剂配制

将MEM培养液100ml，含胎牛血清10％、3％的谷氨酰胺1％、380mg/ml的G418(氨基糖苷类抗生素)、100mg/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素、50mg/ml的卡那酶素，用5％的碳酸氢钠调pH至7.0。试验用培养液不加G418细胞消化液，加0.25％胰酶，用Hanks液配制。

2.22.2.15细胞培养

在长满2.2.15细胞(2.2.15细胞：乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(HepG2)的2.2.15细胞系)的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化3min，加培养液吹打，1∶3传代，10d长满，加入细胞计数板计数，配制成每毫升10万个细胞，接种细胞培养板，96孔板每孔0.2ml，24孔板每孔1ml，37℃下5％CO₂培养24h，细胞长成单层后进行实验。

2.3测试方法

2.2.15细胞种96孔培养板，36小时后按以上稀释度分别加入样品及阳性对照药，同时设细胞对照孔，加药后96小时分别更换含不同稀释浓度样品的培养液，于加药后第8d分别收集细胞上清及2.2.15细胞，采用RIA法检测细胞上清中HBsAg与HBeAg的分泌量；用点杂交的方法检测细胞中HBV-DNA复制程度，分别计算HBsAg、HBeAg、HBVDNA的IC50与SI。测试结果如表3所示。

3结果

3.1三萜皂苷对2.2.15细胞的HbsAg、HBeAg分泌有抑制作用；对2.2.15细胞的HBV-DNA有抑制作用。

3.2拉米夫定对2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg分泌无抑制作用，对2.2.15细胞的HBV-DNA有抑制作用。

表3三萜皂苷在体外细胞培养中抗HBV作用试验结果

注：(1)表中“-”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。

(2)TC50：对细胞半数有毒浓度；IC50：对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，该指数越高表示药物抑制能力越强，SI＝TC50/IC50。

实施例8三萜皂苷对大鼠阿霉素肾病综合症模型影响的实验研究

1受试药物

三萜皂苷1(实施例1中得到的齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)，三萜皂苷2(实施例3中得到的齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)90％。

2方法

取雄性SD大鼠(湖北省实验动物研究中心提供。许可证号：SCXK(鄂)2003-0005)75只。将实验动物随机分为5组，即空白组、模型组、阳性药保肾康片组、三萜皂苷1(齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)组、三萜皂苷2(齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)组。每组15只大鼠。除空白组外，各组大鼠在灭菌条件下尾静脉注射盐酸阿霉素(ADR)7.5mg·kg^-1，24小时后对三萜皂苷实验组分别灌胃给药，三萜皂苷1组200mg·kg^-1，三萜皂苷2组150mg·kg^-1，阳性对照组灌胃给予保肾康片200mg·kg^-1，空白组及模型组灌胃给予等体积蒸馏水。各组每天灌胃，连续3周，于造模前及造模后第1、2和3周末次给药后各取5只大鼠置大鼠代谢笼中收集大鼠24小时尿液，检测尿蛋白、血红蛋白，末次给药24小时后将5只大鼠先称体重，眼眶采血后，分离血清，按血肌酐(Cre-S)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(Trig)检测试剂盒说明书测定肌酐、尿素氮及甘油三酯。

3结果

3.1三萜皂苷对ADR诱导肾病综合症大鼠一般状况、体重及脏器指数的影响

结果表明，与正常对照组比较，模型组动物于注射ADR后出现毛发疏松、无光泽、精神萎靡，体重明显下降。三萜皂苷治疗后可明显改善动物的一般状况。

3.2三萜皂苷对ADR诱导肾病综合症大鼠血液生化指标的影响

由表4可知，阿霉素诱导肾病综合症组大鼠血肌酐(Cre-S)、尿素氮(BUN)及甘油三酯(Trig)水平显著升高，与正常对照组相比具有明显的统计学差异。三萜皂苷治疗3周后，Cre-S、BUN及Trig水平同模型组相比均有明显下降。

表4三萜皂苷对ADR诱导的大鼠血清生化指标的影响

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3三萜皂苷对ADR诱导肾病综合症大鼠尿液量及尿液生化指标的影响

由表5可知，经阿霉素诱导后的大鼠尿液量与正常对照组相比出现显著减少，尿蛋白及微量游离血红蛋白水平则显著升高。保肾康片及三萜皂苷治疗3周后，在大鼠尿液量、尿蛋白及微量游离血红蛋白水平方面均出现显著改善。

表5三萜皂苷对ADR诱导的大鼠尿液量及尿液生化指标的影响

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

实施例9三萜皂苷对甲状腺素诱导的甲亢阴虚型动物的药效学研究

1受试药物

三萜皂苷1(实施例1中得到的齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)，三萜皂苷2(实施例3中得到的齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)90％。

2方法

2.1方法：取SD雌性大鼠(湖北省实验动物研究中心提供。许可证号：SCXK(鄂)2003-0005)50只，按空腹体重计算给药量，随机分为5组，每组10只，即：生理盐水组、甲亢模型组、甲亢灵组、三萜皂苷1组、三萜皂苷2组。除生理盐水组外，其余各组灌胃(ig)给药1次/d、10mg·kg^-1甲状腺素混悬液，连续30d进行甲亢阴虚型模型的制备，于造模第31d灌胃给药1次/d，甲亢灵组给予0.6g·kg^-1甲亢灵片混悬液，三萜皂苷1组给予200mg·kg-1，三萜皂苷2组给予150mg·kg^-1，模型对照组及生理盐水组给予等容量的生理盐水。

2.2处死动物及指标检测：于给药治疗第31d用放射免疫法测定血清含量T₃、T₄、FT₃、FT₄，用免疫放射法测定血清TSH含量，比较各组间差异。

3结果

三萜皂苷对甲亢阴虚型大鼠血清三碘甲状腺原氨酸(T₃)、甲状腺素(T₄)，游离三碘甲状腺原氨酸(FT₃)、游离甲状腺素(FT₄)、血清促甲状腺素(TSH)的影响结果如表6所示。与生理盐水组比较，甲亢模型组血清T₃、T₄、FT₃、FT₄值显著升高(P＜0.05)，血清TSH值显著降低(P＜0.05)，说明甲亢阴虚型大鼠模型的建立是成功的。与甲亢模型组比较，治疗30d后，各组的血清T₃、T₄、FT₃、FT₄值显著降低(P＜0.05)，血清TSH值显著升高(P＜0.05)。

表6各组大鼠血清T₃、T₄、FT₃、FT₄、TSH值的比较(nmol/L，n＝10)

注：与甲亢模型组比较*P＜0.05。

实施例10三萜皂苷对系统性红斑狼疮(SLE)样小鼠作用的实验研究

1受试药物

三萜皂苷1(实施例1中得到的齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)，三萜皂苷2(实施例3中得到的齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)90％。

2方法

2.1SLE样症状昆明种小鼠模型的制备：密度梯度离心法无菌分离BALB/c小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞，⁶⁰Co照射(剂量6戈瑞(Gy))，诱导85％左右细胞发生凋亡(吖啶橙染色法观察凋亡率)。照射后淋巴细胞继续在37℃、5％CO₂环境下孵育4h。将获得的凋亡细胞成分分别于0、7、14天皮下途径免疫小鼠，每只小鼠10⁷个淋巴细胞。第一次免疫用完全弗氏佐剂(CFA)，第二次、第三次重复免疫采用不完全弗氏佐剂(IFA)(参照林晨、同种异体淋巴细胞诱导的SLE样小鼠模型[J].上海免疫学杂志、1980，9(2)：73-76；高春芳、青蒿琥酯对系统性红斑狼疮样小鼠模型的影响[J].中华皮肤科杂志、1995，28(1)：17-19)。

2.2动物分组与给药：以同龄同性别未经照射未输入淋巴细胞悬液的一代(F 1代)杂交小鼠作为正常对照。将F1代小鼠随机分为4组，正常对照组、三萜皂苷1组200mg/kg、三萜皂苷2组150mg/kg、模型对照组。灌胃给药，每日1次。正常对照组和模型对照组给予等体积生理盐水。

2.3标本收集：

(1)血清制备：采用毛细吸管经后眼眶静脉丛取血约0.2ml/次，第1次于输注前取血。输注后每2周取血1次，共7次。离心分离血清，保存于-30℃低温冰箱，统一测定。

(2)尿液收集：取尿前小鼠禁食12h，只给饮水，然后收集尿液约0.5ml，当即检测。第1次于输注前收集尿液。输注后每2周收集1次，共7次。

(3)组织检查：输注后至第14周结束时，放血处死小鼠，取出脾脏和肾脏做脾指数测定和肾脏组织学检测。

2.4标本检测

2.4.1参照文献方法(林晨、同种异体淋巴细胞诱导的SLE样小鼠模型[J].上海免疫学杂志、1980，9(2)：73-76)，使用ELISA法检测抗dsDNA抗体及抗组蛋白抗体。

2.4.2尿蛋白测定：用尿蛋白试纸比色法测定新鲜尿液的蛋白质含量，分-(＜1mg％)、±(1mg％～10mg％)、+(10mg％～30mg％)、++(30mg％～100mg％)、+++(100mg％～300mg％)、++++(＞300mg％)共6个等级。

2.4.3脾指数测定：小鼠处死前称其重量(g)。放血处死小鼠取出脾脏，以滤纸吸干表面血污，测其重量(mg)。脾指数＝脾重(mg)数×10/体重(g)数。

2.4.4病理检测：

常规苏木素伊红(HE)染色：取出肾组织后，以10％的中性福尔马林溶液固定，按常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、做HE染色、固封、镜检。

免疫荧光检查：取新鲜小鼠肾组织，冰冻切片，厚约3μm，室温干燥1h，纯丙酮固定20min，用0.01M pH7.2的PBS洗涤3次，略干燥，滴加1∶40稀释的免抗小鼠IgG-异硫氰酸荧光素(FITC)于切片上，37℃孵育1h，冲洗，风干，于万能显微镜下观察IgG沉积及分布情况。

2.4.5统计学处理：自身抗体水平以均数±标准差()表示，多组间用单因素方差分析，以P＜0.05作为差异显著的标准。尿蛋白水平依-、±、+、++、+++、++++分别记为0、5、10、20、30、40分，多组间差异统计用Ridit分析。

3结果

3.1自身抗体(抗dsDNA抗体、抗组蛋白抗体)的变化：模型组与正常组相比较，抗dsDNA抗体，诱导后第4周末至第14周末明显高于正常组，差异显著(P＜0.05)，且于第10周末达到峰值(P＜0.01)；抗组蛋白抗体，诱导后第2周末至第14周末模型组高于正常组，差异显著(P＜0.05)，且于第8周末达到峰值(P＜0.01)。模型组与各用药组相比较，诱导后第6周末至第14周末，各用药组的自身抗体水平较模型组低，差异显著(P＜0.05)。各用药组14周自身抗体平均水平无显著性差异(P＞0.05)。结果如表7、表8所示。

表7药物对诱导后第8周末抗组蛋白抗体变化的影响

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表8药物对自身抗体平均水平的影响

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2尿蛋白水平变化：诱导后第6周末模型组较正常组和各用药组高(P＜0.05)，持续到第14周末，于第14周末达到峰值(P＜0.01)。各用药组之间无显著性差异(P＞0.05)，结果如表9所示。脾指数如表10所示。

表9药物对尿蛋白总体变化的影响

表10药物对脾指数变化的影响

注：与模型组比较，**P＜0.01。

3.3组织学检查：模型组可见部分肾小球萎缩或增生，大小不均匀，间质细胞增生，毛细血管壁有增厚的迹象，间质血管充血及少量淋巴细胞浸润。正常组未见明显改变。用药各组肾小球轻度增生，数量较少，间有萎缩。免疫荧光检查可见，IgG荧光抗体沉积于肾小球基底膜及间质毛细血管内皮区域，呈颗粒状。各用药组仅见部分肾小球有大量荧光抗体沉积，强度较弱，正常组未发现阳性结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。