嵌合体猪圆环病毒PCV2Gen-1Rep及其用途

摘要

本发明涉及包含编码2型猪圆环病毒(PCV2)的核酸分子的新颖猪圆环病毒的嵌合核酸分子(PCV2Gen-1Rep)，所述嵌合核酸分子含有编码1型猪圆环病毒(PCV1)的Rep蛋白的核酸序列，特别地，其中编码PCV1的Rep蛋白的核酸序列是开放读码框(ORF)基因，并且更特别地，其中所述ORFRep基因是ORF1。通过用PCV1的ORF1 Rep基因替换PCV2的ORF1Rep基因，构建了一种高度想要的嵌合核酸分子。本发明还包括含有独特的嵌合核酸分子的具有生物功能的质粒或病毒载体，经所述质粒或载体转染的合适宿主细胞，由所述合适的宿主细胞生产的感染性嵌合猪圆环病毒，利用新颖的嵌合体生产免疫原性多肽制品的方法，病毒疫苗保护猪免受PCV2造成的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)或病毒感染的病毒疫苗，保护猪免受PCV2造成的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)或病毒感染的方法，制备独特的PCV2Gen-1Rep嵌合体等等的方法。本发明还包括用于改进PCV2在细胞培养物中的复制和效价的新颖方法。

说明书

与相关美国申请的交叉引用

本申请按照35 U.S.C.§119(e)要求于2008年4月16日提交的美国临时申请No.61/124,383的权益。在先申请通过引用整体并入本文。

关于联邦赞助的研究或开发的声明

不适用。

关于“序列表”

本申请中提供的含有序列表文件的单张光盘上的资料通过引用并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及独特的嵌合体猪圆环病毒(porcine circovirus)(PCV2Gen-1Rep)，其中编码PCV1的Rep蛋白的核酸序列被插入至PCV2的基因组主链中，本发明还涉及其在为了保护猪免受PCV2造成的断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)或病毒感染的新的经杀灭或减毒的嵌合体疫苗中作为抗原的用途。

相关领域的说明

本说明书中提到的所有专利和公开文本通过引用整体并入本文。

1974年，1型猪圆环病毒(PCV1)作为PK-15细胞系ATCC CCL-33的持久性污染物被初次分离(I.Tischer et al.，“Characterization ofpapovavirus-and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines，”Zentralbl.Bakteriol.Hyg.Otg.A.226(2)：153-167(1974))。从其被鉴定以来，PCV1被确定为不在猪中引起任何疾病的遍在性猪病毒(G.M.Allanet al.，“Pathogenesis of porcine circovirus；experimental infections ofcolostrum deprived piglets and examination of pig foetal material，”Vet.Microbiol.44：49-64(1995)；G.C.Dulac and A.Afshar，“Porcine circovirusantigens in PK-15 cell line(ATCC CCL-33)and evidence of antibodies tocircovirus in Canadian pigs，”Can.J.Vet.Res.53：431-433(1989)；S.Edwardsand J.J.Sands，“Evidence of circovirus infection in British pigs，”Vet.Rec.134：680-681(1994)；I.Tischer et al.，“Studies on epidemiology andpathogenicity of porcine circovirus，”Arch.Virol.91：271-276(1986))。尽管PCV1在猪中不引起任何疾病，但是随后确定2型猪圆环病毒是致病的。1991年，被命名为2型猪圆环病毒(PCV2)的PCV变体毒株在加拿大被首次在猪中识别，并且其被发现为与断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)相关(G.M.Allan et al.，“Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigswith a wasting disease in the USA and Europe，”J.Vet.Diagn.Invest.10：3-10(1998)；I.Morozov et al.，“Detection of a novel strain of porcine circovirus inpigs with postweaning multisystemic wasting syndrome，”J.Clin.Microbiol.36：2535-2541(1998))。

PCV1和PCV2具有相似的基因组构造，其具有两个主要的开放读码框(ORF)：ORF1编码涉及病毒复制的病毒Rep蛋白，ORF2编码病毒壳体蛋白的。总体上，PCV1和PCV2在其整个基因组中共享68-76％的核苷酸序列同一性，而每种基因型内的隔离群(isolates)共享大于90％的同一性(A.K.Cheung，“The essential and nonessential transcription units for viralprotein synthesis and DNA replication of porcine circovirus type 2，”Virology313：452-9(2003))。PCV1和PCV2具有相似的基因组构造，其具有两个开放读码框(ORF)(A.K.Cheung，“Identification of the essential and non-essential transcription units for protein synthesis，DNA replication andinfectious virus production of porcine circovirus type 1，”Arch.Virol.149(5)：975-88(2004)；A.K.Cheung，“Transcriptional analysis of porcinecircovirus type 2，”Virology 305(1)：168-180(2003)；A.Mankertz et al.，“Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus，”J.Gen.Virol.79(Pt 2)：381-384(1998)；P.Nawagitgul et al.，“Open readingframe 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein，”J.Gen.Virol.81：2281-2287(2000))。在这两种病毒中，ORF1均负责病毒复制，并且可选择地被剪切为两种主要的功能蛋白，Rep和Rep’(A.K.Cheung，“Identification of the essential and non-essential transcription units for proteinsynthesis，DNA replication and infectious virus production of porcine circovirustype 1，”Arch.Virol.149(5)：975-88(2004)；A.K.Cheung，“Transcriptionalanalysis of porcine circovirus type 2，”Virology 305(1)：168-180(2003)；A.Mankertz and B.Hillenbrand，“Replication of porcine circovirus type 1 requirestwo proteins encoded by the viral rep gene，”Virology 279：429-38(2001)；A.Mankertz et al.，“Identification of a protein essential for replication of porcinecircovirus，”J.Gen.Virol.79(Pt 2)：381-384(1998)；A.Mankertz et al.，“Mapping and characterization of the origin of DNA replication of porcinecircovirus，”J.Virol.71：2562-6(1997))。ORF1在PCV1和PCV2之间高度保守，核苷酸序列同一性为约83％和氨基酸序列同一性为86％(I.Morozov et al.，“Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs withpostweaning multisystemic wasting syndrome，”J.Clin.Microbiol.36：2535-2541(1998))。ORF2在两种病毒中均编码免疫原性病毒壳体蛋白(P.Nawagitgul et al.，“Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes amajor capsid protein，”J.Gen.Virol.81：2281-2287(2000))，并且比Rep蛋白更加可变，在PCV1和PCV2之间具有约67％的核苷酸序列同一性和65％的氨基酸序列同一性(I.Morozov et al.，“Detection of a novel strain ofporcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome，”J.Clin.Microbiol.36：2535-2541(1998))。最近在PCV2中发现了第三个ORF——ORF3，但在PCV1中则没有，据报道ORF3涉及细胞凋亡(J.Liu et al.，“Characterization of a previously unidentified viral protein in porcinecircovirus type 2-infected cells and its role in virus-induced apoptosis，”J.Virol.79：8262-74(2005))。

之前，美国专利No.7,279,166 B2，美国专利No.7,276,353 B2，M.Fenaux et al.，“A chimeric porcine circovirus(PCV)with the immunogeniccapsid gene of the pathogenic PCV type 2(PCV2)cloned into the genomicbackbone of the nonpathogenic PCV1 induces protective immunity againstPCV2 infection in pigs，”J.Virol.78：6297-303(2004)和M.Fenaux et al.，“Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones ofpathogenic porcine circovirus type 2(PCV2)and nonpathogenic PCV1 inweanling pigs，”J.Virol.77：11232-243(2003)描述了被命名为PCV1-2的嵌合体病毒的构建，其中PCV2的ORF被克隆进PCV1基因组的主链中。这些公开文本强调了来自PCV2的ORF2壳体基因(包括其基因间序列)代替PCV1的ORF2的交换，还公开了包含编码PCV2的核酸分子的PCV2-1的感染性交互(reciprocal)嵌合核酸分子，所述嵌合核酸分子具有来自PCV1的非致病性免疫原性ORF2基因，其代替致病性PCV2核酸分子的ORF2基因。尽管PCV1-2嵌合体提供了一种天然无毒的性状，但是仅作为实验模型制备的PCV2-1的交互嵌合体核酸分子保持有毒，除了与PCV1-2比较病毒特性的研究目的之外，不具有超过亲本PCV2的任何商业优点。上述专利或文献均未公开或提示利用致病性PCV2的基因组主链制造任何其他交互嵌合体病毒，并且，确实均未暗示在指定和明确的ORF2免疫原性壳体基因之外交换替代性的开放读码框。

另外，在PK-15细胞中，PCV1-2嵌合体病毒的复制效价与PCV2相似(M.Fenaux et al.，“Immunogenicity and pathogenicity of chimericinfectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2(PCV2)andnonpathogenic PCV1 in weanling pigs，”J.Virol.77：11232-243(2003))。另一方面，PCV1已适应于在PK-15细胞中生长得更好，并且适应PK-15细胞培养物的PCV1病毒比PCV2生长得更好，在PK-15细胞中复制至比PCV2至少高出约1-log的效价(M.Fenaux et al.，“Two amino acidmutations in the capsid protein of type 2 porcine circovirus(PCV2)enhancedPCV2 replication in vitro and attenuated the virus in vivo，”J.Virol.78：13440-6(2004)；M.Fenaux et al.，“Immunogenicity and pathogenicity of chimericinfectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2(PCV2)andnonpathogenic PCV1 in weanling pigs，”J.Virol.77：11232-243(2003))。PCV1在PK-15细胞中这种增强的复制能力可能归因于下述事实：PCV1最初作为持久的细胞培养物污染物从PK-15细胞中分离，因此适应于在PK-15细胞中生长。然而，致病性PCV2毒株不具有与PCV1相同的复制能力，这造成了与PCV2疫苗生产相关的主要问题(由于病原体在PK-15细胞中相对低的效价)。因此，满足基于PCV2的疫苗的有效生长水平是工业疫苗生产者真正的挑战和困境，所述基于PCV2的疫苗例如为灭活的全PCV2、天然无毒的嵌合体PCV1-2(基于PCV1起源的基因组主链)、重组的PCV2壳体蛋白等等。

先前检查PCV2的基因间序列时，在PCV2中鉴定了干扰素-α-刺激的应答元件(ISRE)-样序列(GAAANNGAAA)，其可应答IFN-α而活化基因转录，与本领域公知的ISRE-元件的活性相似(J.E.Darnell，Jr.，et al.，“Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and otherextracellular signaling proteins，”Science 264：1415-21(1994))。已经显示与卡波斯肉瘤相关的疱疹病毒表达与病毒编码的ISRE-样序列相互作用的病毒基因，所述ISRE-样序列负责额外的病毒基因活化(J.Zhang，“Kaposi′ssarcoma-associated herpesvirus/human herpesvirus 8 replication  andtranscription activator regulates viral and cellular genes via interferon-stimulatedresponse elements，”J.Virol.79：5640-52(2005))。Meerts等最近展示了用PCV2接种后，用IFN-α处理的猪肾细胞(PK-15)和猪单核细胞(3D4/31)具有提高数量的被感染的细胞，分别多至529％和308％(P.Meerts et al.，“Enhancement of porcine circovirus 2 replication in porcine celllines by IFN-gamma before and after treatment and by IFN-alpha aftertreatment，”J.Interferon Cytokine Res 25(11)：684-93(November 2005))。有趣的是，在用PCV2接种之前用IFN-α处理的PK-15细胞具有降低的被感染的细胞的量(69％)(同上)。除了IFN-α以外，还在PK-15和3D4/31两种细胞中评价了IFN-γ对PCV2感染的影响。发现在PK-15细胞中在PCV2感染后用IFN-γ处理得到数量提高691％的被感染细胞，在3D4/31细胞中在PCV2接种之前添加IFN-γ将PCV2抗原-阳性细胞的数量提高了706％，这归因于病毒提高的细胞内化(同上)。在PCV2序列的启动子区中存在应答IFN-γ活化的转录因子也是可能的，但是这均为推测，尚未证实。许多病毒通过大量转录通路不仅响应而且操纵IFN表达，从而避开(circumvent)细胞IFN应答(S.Goodbourn，“Interferons：cell signalling，immune modulation，antiviral response and virus countermeasures，”J.Gen.Virol.81：2341-64(2000))。总而言之，细胞培养物中IFN-α和IFN-γ对PCV2的影响和ISRE-样序列在调节IFN-α和IFN-γ应答中的作用仍然有待研究。然而，如之前的研究所示，添加干扰素来刺激PCV2的生长具有不一致的结果。尽管能够向猪给予干扰素，但是应当考虑基于干扰素的最终PCV2制品中的剂量水平，因为干扰素能够引起不良反应和副作用，尤其对肝有害。通过利用能够被安全施用给猪的天然组分来改进PCV2的复制特性将是更期望的。

因此存在由于PCV2疫苗制造期间抗原生产量不足造成的明确被本领域公认的问题，本发明通过开发一种新的猪圆环病毒嵌合体解决了所述问题，所述新的猪圆环病毒嵌合体显著地改进病毒的低效价和复制能力，从而制造比先前所能获得的更大批的嵌合体疫苗。

因此本发明的一个重要目的是提供PCV1和PCV2的独特组合，所述组合保留致病性PCV2的抗原能力来引发足够的免疫应答，但是创新性地获得PCV1优良的效价生长特性。

本发明还有一个重要的目的是制造基于PCV2的经改进的嵌合体疫苗制品，用于保护猪免受PCV2造成的病毒感染或断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，其中所述改进包括比亲本PCV2更好的复制。

本发明的其他目标和目的将随着说明书的继续而出现。

通过提供如本文所述在PCV2的基因组主链中含有PCV1 Rep基因的新颖嵌合PCV2病毒，实现了前述目的。

发明概述

本发明涉及独特的嵌合体猪圆环病毒，其中编码1型猪圆环病毒(PCV1)的Rep蛋白的核酸序列被并入2型猪圆环病毒(PCV2)的基因组主链中。本发明的一个高度期望的实施方案涉及PCV2Gen-1Rep嵌合体的构建，其中PCV1的开放读码框1(ORF1)Rep基因代替了PCV2基因组结构中PCV2的ORF1 Rep基因。本发明还包括含有本文所述新的嵌合核酸分子的生物功能性质粒、病毒载体等等，经包含嵌合体DNA的质粒或载体转染的合适的宿主细胞，和制备嵌合构建体的方法。另外本发明还包括，包含例如嵌合DNA、含有嵌合DNA的质粒、嵌合病毒等等的减毒或灭活疫苗，和保护猪免受PCV2造成的病毒感染或断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的新颖方法，所述方法包括对需要这类保护的猪施用免疫有效量的所述减毒或灭活疫苗。惊人和有利的是，本发明的嵌合猪圆环病毒提供了超过亲本病毒PCV2的显著改进的复制和效价，因此，本发明的又一个实施方案涉及改进细胞培养物中PCV2复制和效价的方法。

附图概述

将参照附图在下文中进一步描述本发明的背景及其与现有技术的不同，其中：

图1展示：被转染进PK-15细胞中时，嵌合SDM-C6DNA克隆(PCV1的Rep基因被克隆进PCV2基因组的主链中)是感染性的。图A和a展示了经连环化(concatomerized)SDM-C6嵌合基因组转染的PK-15细胞；图B和b展示了经线性化的单拷贝SDM-C6嵌合基因组转染的PK-15细胞；图C和c展示了作为阴性对照的MEM和转染试剂。左图提供了经PCV2ORF2单克隆抗体染色的IFA结果；而右图提供了被IFA结果覆盖的PK-15细胞单层。

图2通过单步生长曲线展示了PCV1(◆)、PCV2(■)和嵌合体SDM-C6(△)病毒在PK-15细胞中生长特性的表征。以0.1的感染乘数(multiplicityof infection)用每种病毒一式两份接种6-12孔平板上的PK-15细胞。每12个小时收获被感染细胞的两个一式两份的孔，并通过IFA测定病毒效价。

发明详述

根据本发明提供了猪圆环病毒的独特的感染性嵌合核酸分子(PCV2Gen-1Rep)，由所述嵌合体核酸分子生产的活的嵌合病毒，和保护猪免受2型猪圆环病毒(PCV2)造成的断奶后多系统衰竭综合征或病毒感染的兽用疫苗。本发明特别涉及下述猪圆环病毒嵌合体核酸分子(PCV2Gen-1Rep)的构建和体外表征，所述嵌合核酸分子中编码PCV2的核酸分子含有编码1型猪圆环病毒(PCV1)的复制(Rep)蛋白的核酸序列。为了插入PCV2核酸分子的目的，编码Rep蛋白的核酸序列可以是编码对非致病性猪圆环病毒毒株的病毒复制而言必需的一种或多种复制蛋白的一种或多种功能性核苷酸序列。使用编码PCV1的Rep蛋白的完整开放读码框(ORF)基因，以及优选地，使用PCV1的ORF1 Rep基因以并入PCV2的基因组主链中是期望的。对最适的嵌合体特性而言，用PCV1的ORF1Rep基因代替PCV2的开放读码框是甚至更优选的，尤其是代替PCV2基因组主链中PCV2的ORF1 Rep基因。

本发明的另一实施方案涉及制备本文所述的嵌合体核酸分子PCV2Gen-1Rep的新方法，所述方法包括以下步骤：

(a)从编码PCV1的核酸分子中移出编码Rep蛋白的核酸序列；

(b)将编码PCV1的Rep蛋白的核酸序列并入编码PCV2的核酸分子中；和

(c)回收所述嵌合核酸分子。

所述方法可以被便利地修饰，以构建本发明的嵌合体病毒的变异，其中步骤(a)可涉及移出包含编码PCV1的Rep蛋白的开放读码框(ORF)基因的核酸序列，或更特定地，移出包含PCV1的ORF1 Rep基因的核酸序列。作为本发明的备选实施方案，步骤(b)可还包含移出PCV2的ORF1基因，然后将包含PCV1的ORF1 Rep基因的核酸序列并入编码PCV2的所述核酸分子的ORF1基因的位置中。

本发明的新颖的嵌合体猪圆环病毒优先被设计为提供超过亲本病毒PCV2的显著改进的复制能力和增强的效价。在下文实施例中构建了代表性的嵌合体，其被命名为“SDM-C6”。SDM-C6嵌合体病毒样品被转染进PK-15细胞中时是体外感染性的，这表明PCV1和PCV2之间的Rep基因是可交换的。

通过单步生长曲线表征SDM-C6嵌合体病毒经改进的生长性状，所述生长曲线将嵌合病毒的生长特征与野生型PCV1和PCV2病毒进行比较。结果表明：在细胞培养物中与其亲本病毒PCV2相比，嵌合体病毒以高出约1-log的效价并且更高效地复制。尽管嵌合体病毒复制至与非致病性PCV1相似的效价，但是所述研究还展示，本发明的嵌合体PCV2Gen-1Rep在转染(即感染或接种)PK-15细胞后出乎意料地比其亲本PCV1或PCV2两种病毒都更迅速地复制。

因为以工业规模将PCV2培养至足以进行疫苗生产地更高效价在之前是有问题的(其中甚至1-log的效价提高都被认为是显著的)，所以本发明在兽医领域造成可观的进步，这对于PCV2疫苗的开发具有重要的意义。尽管1-log的差异对其他病毒而言可能不是显著的，但是对PCV2而言，1-log的效价提高在PCV2疫苗的生产中造成巨大差异，也就是说，更高的效价会降低每份剂量的疫苗体积，从而提高最终制品的效能和整个制造过程的效率。有利地，本发明的新PCV2Gen-1Rep嵌合体的使用提供了比过去所能实现的显著更好的PCV2疫苗生产。另外，由于PCV2Gen-1Rep嵌合体独特地基于PCV2起源的基因组主链，所以由于嵌合体构建体中对在接种的猪中引发免疫应答而言重要PCV2的免疫原性ORF2壳体基因的存在，成为用于保护猪免受PCV2造成的PMWS或病毒感染的疫苗中极佳的抗原物质。

区分本发明的SDM-C6嵌合体病毒与美国专利Nos.7,279,166B2和美国专利No.7,276,353 B2中先前所述的PCV1-2嵌合体病毒的主要差异之一是核酸序列：本发明的PCV2Gen-1Rep嵌合病毒(SDM-C6)的基因组序列是致病性PCV2起源的，而先前的PCV1-2嵌合体病毒是非致病性PCV1起源的。文献中已经报道，两种病毒(PCV1和PCV2)的Cap和Rep基因之间的基因间序列可在调节PCV复制中起重要作用(A.K.Cheung，“Detection of rampant nucleotide reversion at the origin of DNA replication ofporcine circovirus type 1，”Virology 333：22-30(2005)；A.K.Cheung，“Identification of an octanucleotide motif sequence essential for viral protein，DNA，and progeny virus biosynthesis at the origin of DNA replication ofporcine circovirus type 2，”Virology 324：28-36(2004)；A.Mankertz et al.，“New reporter gene-based replication assay reveals exchangeability ofreplication factors of porcine circovirus types 1 and 2，”J.Virol.77：9885-93(2003))。因为为了构建嵌合SDM-C6病毒而改变PCV2毒株依赖于添加来自PCV1的Rep基因代替PCV2的DNA序列中的Rep基因，所以可以推测，PCV1的Rep基因可能对增强的复制能力做出贡献。然而，这类推测可能是纯粹的假设，直至真正地制造出构建体并在生长研究中测试，尤其因为非致病性PCV1和致病性PCV2在其整个基因组中仅共享68-76％的核苷酸序列同源性的事实。PCV1的Rep基因可能不翻译成PCV2基因组的功能性密码子，或者在编码PCV2的不同的核苷酸序列中提供更好的复制能力。因此，本发明目前观察到嵌合SDM-C6病毒复制至与PCV1相似的效价是令人惊讶的结果。作为另一出乎意料的性状，SDM-C6病毒还比PCV1和PCV2两种亲本毒株都复制得更快，表明本发明的PCV2Gen-1Rep嵌合病毒增强的复制能力的机制仍然有待确定。

迄今为止，之前从未报道过如本文所述将PCV1的Rep基因并入致病性PCV2的基因组主链中，并获得具有超过两种亲本毒株的经改进的复制特性的感染性病原体。考虑到新PCV2Gen-1Rep嵌合病毒增强的复制能力，本发明的又一个实施方案因此涉及改进PCV2在细胞培养物中的复制和效价的新颖方法，所述方法包括以下步骤：

(a)构建PCV2Gen-1Rep嵌合病毒，其中PCV2的ORF1 Rep基因被PCV1的ORF1 Rep基因代替；

(b)用所述PCV2Gen-1Rep嵌合体接种合适的细胞系；

(c)在标准条件下合适的病毒生长培养基中，将所述PCV2Gen-1Rep嵌合体培养足以诱导细胞生产的时间量；和

(d)收获所述嵌合体病毒。

在前述方法中，合适的细胞系的例子可以是不含猪抗原的猪肾细胞系(PK-15细胞)、猪睾丸(ST)细胞系和能够培养猪圆环病毒或者特定地适应于培养猪圆环病毒的类似细胞系。

本发明范围内还包括含有本文所述新嵌合核酸分子的生物功能性质粒、病毒载体等等，经这些质粒或载体转染的合适的宿主细胞，和由所述宿主细胞生产的活的嵌合体猪圆环病毒。本发明还包括用于生产免疫原性多肽制品的方法，其中所述方法包括：在合适的营养条件下培养以允许所述多肽制品表达的方式用本文所述的猪圆环病毒嵌合核酸分子(PCV2Gen-1Rep)转染的原核或真核宿主细胞，并分离想要的所述嵌合分子表达的多肽制品。

嵌合病毒和DNA分子的经适当减毒或失活(即灭活)的疫苗，以及使用它们的方法，也包括在本发明的范围内。经接种的猪被保护免受PCV2造成的PMWS和严重病毒感染。所述新颖的方法通过对猪施用免疫有效量的根据本发明的疫苗来保护需要保护的猪免受病毒感染或PMWS，所述疫苗例如为包含免疫有效量的以下的疫苗：编码PCV2Gen-1Rep的嵌合DNA序列、经克隆的嵌合病毒、含有嵌合DNA分子的质粒或病毒载体、重组的PCV2Gen-1Rep DNA序列等等。可以同时给予猪其他抗原如PRRSV、PPV、其他感染性猪试剂和免疫刺激剂，以提供针对病毒感染的广谱保护。

疫苗包含例如PCV2Gen-1Rep的嵌合核酸分子、在合适的质粒或载体例如pSK载体中克隆的嵌合基因组、经杀灭的(灭活)或减毒的嵌合体病毒等等，它们与无毒的生理可接受的载剂和任选的一种或多种标准佐剂组合。优选地，所述疫苗使用经杀灭的嵌合病毒作为抗原。

可以与本发明的疫苗组合施用的佐剂是提高猪对疫苗免疫应答的物质。佐剂可与疫苗同时和在相同的位点施用，或者不同时施用，例如作为加强剂(booster)施用。佐剂也可以按照与施用疫苗不同的方式或在不同的位点被有利地施用给猪。兽医领域常规技术人员已知的合适佐剂包括但不限于氢氧化铝(明矾)、免疫刺激复合物(ISCOMS)、非离子嵌段聚合物或共聚物、细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-7、IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、皂苷、单磷酸类脂A(MLA)、胞壁酰二肽(MDP)等等。其他合适的佐剂包括例如硫酸钾铝、从Escherichia coli分离的耐热或不耐热的肠毒素、霍乱毒素或其B亚基、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、弗氏不完全或完全佐剂等等。基于毒素的佐剂例如白喉毒素、破伤风毒素和百日咳毒素可以在使用前例如通过用甲醛处理来灭活。

疫苗可还含有额外的抗原来促进本发明的嵌合体病毒或DNA的免疫活性，例如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、其他感染性猪试剂和免疫刺激剂。

本发明的新疫苗不限于任何具体类型或制备方法。被克隆的病毒疫苗包括但不限于，感染性DNA疫苗(即施用质粒、载体或其他常规载剂将DNA直接注射进猪中)，减毒疫苗，灭活(经杀灭的)疫苗，经遗传改造的疫苗等等。这些疫苗通过本领域已知的标准方法制备。

因为本发明疫苗中的抗原物质基于致病性PCV2毒株，所以必须首先通过合适的本领域公认的方法使活性剂减毒或灭活。例如，为了制备灭活的病毒疫苗，通过本领域已知或本文所述的方法完成病毒从感染性DNA克隆的繁殖。然后通过本领域常规技术人员普遍已知的流程优化系列病毒灭活。

可以通过用灭活剂如福尔马林或疏水溶剂、酸等等处理来自被克隆的DNA的嵌合病毒，通过用紫外光或X-射线辐照，通过加热等等来制备灭活的病毒疫苗。灭活以本领域所了解的方式进行。例如在化学灭活中，通常在足够高(或低，取决于灭活剂)的温度或pH下，用足够用量或浓度的灭活剂将合适的病毒样品或含有病毒的血清样品处理足够长的时间，使病毒灭活。热灭活典型地在足以使病毒失活的温度下进行足够长的时间。辐照灭活通常使用光波长或其他能量来源进行足以使病毒灭活的时间长度。通常，术语“灭活的”、“死亡的”或“经杀灭的”在病毒疫苗的语境中可互换使用，表示疫苗含有已被灭活的病毒。如果病毒不能够感染对感染而言易感的细胞，则所述病毒被认为是灭活的。

为了从致病克隆制备减毒疫苗，首先通过本领域已知的方法使经组织培养物适应的、活的致病性PCV2Gen-1Rep减毒(使其非致病或无害)，典型地通过细胞培养物的连续传代进行。致病性克隆的减毒也可以通过基因缺失或生产病毒的基因的突变进行。

还可指出病毒基因组中负责毒力的核苷酸序列，并通过例如定点诱变将病毒改造为无毒。定点诱变能够添加、缺失或改变一个或多个核苷酸(见例如Zoller et al.，DNA 3：479-488，1984)。合成含有期望的突变的寡核苷酸，并与单链病毒DNA的一部分退火。使用由这一步骤得到的杂种分子转化细菌。然后使用经分离的含有适当突变的双链DNA，通过与全长DNA的限制性片段连接来生产全长DNA，随后将其转染进合适的细胞培养物中。可以通过本领域常规技术人员已知的任何标准技术来将基因组连接进用于转移的合适载体中。可以使用任何常规方法来将载体转染进用于生产病毒后代的宿主细胞中，例如磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、原生质体融合和其他公知的技术(例如Sambrook et al.，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)。所克隆的病毒随后显示期望的突变。或者可以合成含有适当的突变的两种寡核苷酸。可以将这两种寡核苷酸退火形成双链DNA，双链DNA可以被插入病毒DNA中，用于生产全长DNA。

可以用含有得自病毒或从病毒基因组中拷贝的核酸分子的转移载体转化昆虫细胞系(如HI-FIVE)，所述核酸分子编码一种或多种所述病毒的免疫显性蛋白质。转移载体包括例如含有免疫原性多核苷酸的质粒和线性化的杆状病毒DNA。或者可以使用活载体如痘病毒或腺病毒作为疫苗，与本发明的嵌合体组合。

对需要针对病毒感染或PMWS进行保护的猪施用免疫有效量的本发明的疫苗。可以通过常规测试容易地测定或轻易地滴定接种猪的免疫有效量或致免疫量(immunogenic amount)。有效量是下述用量，其中获得的对疫苗的免疫应答足以保护暴露于引起PMWS的病毒的猪。优选地，所述猪被保护至下述程度，其中所述病毒性疾病的一个到全部的不良生理症状或效果被显著减少、缓解或完全预防。

可以以单一剂量或重复剂量施用疫苗。剂量可在例如从约1微克到约1,000微克含有感染性嵌合体DNA基因组(取决于疫苗的免疫活性组分的浓度)的质粒DNA的范围内，优选地为100到200微克嵌合PCV2Gen-1Rep DNA克隆的范围内。用于以猪重量、抗原浓度和其他典型因素为基础测定或滴定活性抗原剂的合适剂量，以寻找最小有效剂量的方法是本领域已知的。

期望地，将疫苗施用给尚未暴露于PCV病毒的猪。含有抗原物质的疫苗可便利地被鼻内、经皮(即应用在皮肤表面上或皮肤表面处进行全身性吸收)、肠胃外等等施用。肠胃外施用途径包括但不限于肌内、静脉内、腹膜内、真皮内(即注射或以其它方式置于皮肤下)、皮下途径等等。因为肌内和真皮内接种途径已在使用病毒感染性DNA克隆的其它研究中取得成功(E.E.Sparger et al.，“Infection of cats by injection with DNA of felineimmunodeficiency virus molecular clone，”Virology 238：157-160(1997)；L.Willems et al.，“In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep，”Virology 189：775-777(1992))，所以这些途径是最为优选的，除此之外是实用性的鼻内使用途径。尽管较不便利，但是还考虑通过淋巴内接种途径给予猪疫苗。

作为液体施用时，本发明的疫苗可以被制备成水性溶液、糖浆、酏剂、酊剂等等形式。这类配制物是本领域已知的，并且典型地通过将抗原和其它典型添加剂溶于适当的载剂或溶剂体系中来制备。合适的载剂或溶剂包括但不限于，水、盐水、乙醇、乙二醇、甘油等。典型的添加剂是例如合乎标准的染料、香料、甜味剂和抗微生物剂防腐剂如柳硫汞(乙基贡基柳硫酸钠)。可以例如通过添加部分水解的明胶、山梨糖醇或细胞培养基来稳定化这类溶液，或者可以通过常规方法，使用本领域已知的试剂如磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、其混合物等等来缓冲。

液体配制物也可包括含有与其它标准辅助配制物(co-formulants)组合的悬浮剂或乳化剂的悬浮液和乳液。这些类型的液体配制物可以通过常规方法制备。悬浮液例如可以使用胶体磨来制备。乳液例如可以使用匀化器来制备。

被设计为注射进体液系统中的肠胃外配制物需要有适当的等渗性和被缓冲至猪体液相应水平的pH。等渗性可以根据需要用氯化钠和其它盐适当地调节。合适的溶剂如乙醇或丙二醇可以被用于提高配制物中成分的溶解度和液体配制物的稳定性。可以在本发明疫苗中使用的其它添加剂包括但不限于，葡萄糖、常规抗氧化剂和常规螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)。肠胃外剂型必须在使用前灭菌。

以下实施例阐述了本发明的某些方面。然而，应当理解这些实施例仅用于阐述，而不意味着完全决定本发明的条件和范围。应当理解给出典型的反应条件(例如温度、反应时间等)时，也可以使用高于或低于特定范围的条件，尽管通常便利性稍差。实施例在室温(约23℃到约28℃)和大气压下进行。除非另有说明，本文提出的所有部分和百分比以重量为基础，所有温度以摄氏度表示。

可以从下文的非限制性实施例获得本发明的其它理解。

实施例1

嵌合体PCV2Gen-1Rep的构建

在下文的所有体外实验中使用无PCV的PK-15细胞。这些细胞之前通过终点稀释(end-point dilution)获得(M.Fenaux et al.，“Cloned genomicDNA of type 2 porcine circovirus is infectious when injected directly into theliver and lymph nodes of pigs：characterization of clinical disease，virusdistribution，and pathologic lesions，”J.Virol.76：541-51(2002))。先前描述了对PCV2和PCV1单拷贝和二聚体化的串联重复感染性DNA克隆的构建(同上)。

为了构建用PCV1的ORF1 Rep基因代替PCV2基因组主链中PCV2的ORF1 Rep基因(包括其基因间序列)的嵌合体PCV2Gen-1Rep，使用引物PCV1REPF(5’CAACTGGCCAAGCAAGAAAAG 3’(对应于SEQID NO：1))和PCV1REPR(5’AACCATTACGATGTGATCAAAAAGACTCAGTAATTTATTTTATATGGGAAAAGGG 3’(对应于SEQ ID NO：2))，通过PCR扩增pBluescript IISK+载体中PCV1感染性DNA克隆的单拷贝基因组，产生两端具有设计的限制性酶位点BalI和BclI的PCV1Rep基因片段。PCR反应由45μl的Platinum PCR SuperMix High Fidelity(Invitrogen，Carlsbad，CA)，20pM的引物PCV1REPR，20pM的引物PCV1REPF，和1μl的单拷贝PCV1感染性DNA克隆组成。热循环仪反应由94℃下2分钟的初始变性，94℃下30秒变性、55℃下30秒退火和68℃下30秒延伸的35个循环，和之后68℃下7分钟的最终孵育组成。通过1％琼脂糖凝胶分离PCV1Rep片段，并使用Geneclean II Kit(Qbiogene，Irvine，CA)纯化。然后分别用BalI和BclI消化PCV1Rep片段，在1％琼脂糖凝胶上对得到的被消化的片段跑胶，并使用Geneclean II Kit纯化。

使用引物PCV2GENF(5’CTTTTTGATCACTTCGTAATGGTTTTTA3’(对应于SEQ ID NO：3))和PCV2GENR(5’GCTTACCATGTTGCTGCTGAGGT 3’(对应于SEQ ID NO：4))，通过PCR从pBluescript载体中的单拷贝PCV2感染性DNA克隆扩增减去Rep基因的PCV2基因组主链片段。在所述片段的两端引入BfrBI和BclI限制性酶位点。PCR反应由20pM的引物PCV2GENF，20pM的引物PCV2GENR，40mM dNTP(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，200mMMgCl₂，10μl 10X PCR缓冲液，72μl dH₂O，5单位AmpliTaq(AppliedBiosystems，Foster City，CA)和1μl的单拷贝PCV2感染性DNA克隆组成。热循环仪反应由94℃下10分钟的初始变性，94℃下1分钟变性、50℃下1分钟退火和75℃下45秒延伸的38个循环，和之后72℃下7分钟的最终延伸组成。通过1％琼脂糖凝胶分离PCV2基因组主链片段(不含Rep基因)——PCV2Gen片段，并使用Geneclean II Kit纯化。然后分别用BfrBI和BclI消化PCV2Gen片段，在1％琼脂糖凝胶上跑胶，并使用Geneclean II Kit纯化。

为了产生嵌合PCV感染性DNA克隆，使用Stratagene DNA连接试剂盒(LaJolla，CA)进行PCV1Rep和PCV2Gen片段的过夜连接。根据制造商的流程使用连接混合物转化TOP10细胞(Invitrogen)。选择白色菌落，过夜培养，并使用Sigma’s GenElute Plasmid Miniprep Kit(St.Louis，MO)提取质粒。用限制性酶KpnI消化质粒，并在1％琼脂糖凝胶上跑胶，鉴定具有约为1.7kb(PCV2Gen-1Rep)和2.9kb(pBluescript II SK+载体)的2条条带的实际质粒。

实施例2

嵌合体PCV2Gen-1Rep DNA克隆的存活力测试

通过转染PK-15细胞进行嵌合体PCV2Gen-1Rep DNA克隆的存活力测试。使用限制性酶KpnI，从pBluescript II SK+质粒载体切下嵌合体PCV2Gen-1Rep基因组。将嵌合体PCV2Gen-1Rep基因组在1％琼脂糖凝胶上跑胶，使用GeneClean II纯化，随后用T4DNA连环化，基本使用先前所述的常规技术(M.Fenaux et al.，2002)。使用Lipofectamine和PlusReagent，根据制造商的方案(Invitrogen)，用连环化的PCV2Gen-1Rep基因组DNA转染以约70％汇合生长于Lab-Tek培养箱载玻片上的PK-15细胞。转染后三天，如先前所述(同上)使用PCV2 ORF2-特异性多克隆抗体进行间接的免疫荧光测定法(IFA)，测定感染性(infectivity)。为了进一步评价PCV2Gen-1Rep嵌合体基因组的感染性，如先前所述(同上)每瓶用约12μg连环化的嵌合体基因组转染以70％汇合生长于T-25烧瓶中的PK-15细胞。转染后3天收获病毒原种(stock)，并如先前所述(同上)用PCV2 ORF2-特异性多克隆抗体通过IFA滴定。

实施例3

DNA测序，以验证嵌合体基因组

使用引物Rep830F(5′GGTGTCTTCTTCTGCGGTAACG 3′(对应于SEQ ID NO：5))和Rep830R(5′GTTCTACCCTCTTCCAAACCTTCC 3′(对应于SEQ ID NO：6))扩增PCV2Gen片段3’和PCV1Rep片段5’之间的接合区域。使用引物Rep10F(5′GGAAGACTGCTGGAGAACAATCC 3′(对应于SEQ ID NO：7))和Rep10R(5′CGTTACTTCACACCCAAACCTG 3′(对应于SEQ ID NO：8))扩增PCV1Rep片段5’和PCV2Gen片段3’之间的接合区域。对扩增得到的PCR产物的两条链进行测序。

实施例4

定点诱变

被转染进PK-15细胞中时，初始的嵌合体PCV2Gen-1Rep DNA克隆不是感染性的。分析嵌合体基因组的序列后，鉴定了PCV1 ORF1 Rep基因的ATG起始密码子之后的6核苷酸(GTAAGC)插入。为了修正这一错误和通过PCR和克隆步骤引入的不想要的插入，使用引物MVTF(5’CTCAGCAGCAACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG 3’(对应于SEQ IDNO：9))和MVTR(5’CCGCTTTTCTTGCTTGGCATGTTGC TGCTGAG3’(对应于SEQ ID NO：10))，使用QuikChange II Site-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene)缺失所述6核苷酸插入。根据制造商的方案(Invitrogen)，用经诱变的产物转化TOP10细胞。选择白色菌落并过夜培养。在含有氨苄西林的LB琼脂平板上对克隆SDM-C6划线，并在37℃下培养过夜。选择四个菌落并培养过夜。提取它们的质粒并使用引物Rep830F和Rep830R测序，以确保从嵌合体基因组中去除了引入的6个核苷酸。

发现所述6核苷酸(GTAAGC)的插入使得嵌合体克隆没有感染性，并通过定点诱变去除了不想要的插入。发现新的嵌合体克隆SDM-C6在随后转染进PK-15细胞中后是感染性的。

实施例5

用于体外的病毒原种的制备

嵌合体病毒的表征

通过根据先前所述的常规技术(M.Fenaux et al.，2002，见上文)转染PK-15细胞，分别从PCV1和PCV2感染性DNA克隆制备PCV1和PCV2病毒原种。使用PCV2 ORF2-特异性抗体(同上)，通过IFA测定每种病毒原种的感染效价。

使用限制性酶KpnI从pBluescript II SK+质粒上切下在PCV2基因组主链中含有PCV1 Rep基因的DM-C6嵌合体基因组，并使用GeneClean II试剂盒纯化。用T4DNA连接酶将约40μg的SDM-C6嵌合体基因组连环化，并如先前所述(同上)，使用Lipofectamine和Plus Reagent用于转染具有约70％汇合的4瓶(每瓶10μg)PK-15细胞。转染后三天，通过将经转染的细胞冻融三次收获SDM-C6嵌合体病毒，并使用磷酸缓冲的盐水(10X，pH 7.4)(Invitrogen)中稀释度为1∶1000的PCV2 ORF2单克隆抗体(Rural Technologies Inc.，Brookings，SD)，通过IFA测定嵌合体SDM-C6病毒原种的感染效价。SDM-C6病毒原种具有0.5x10^5.5 TCID₅₀/ml的极佳病毒感染效价。通过IFA测定时，用连环化和线性化的SDM-C6基因组转染的PK-15细胞均为强阳性(图1)，证明在PCV2基因组主链中克隆了PCV1 Rep基因的SDM-C6嵌合体基因组在体外是感染性的。

实施例6

单步骤生长曲线

为了表征嵌合体病毒的生长特征并与野生型PCV1和PCv2病毒比较，进行单步生长曲线。在六个12孔平板的八个孔中培养PK-15细胞。在约70％的汇合下，用2mL MEM洗涤每个孔。以0.1的感染乘数(MOI)，各自用PCV1、PCV2和SDM-C6接种一式两份的平板中的八个孔。孵育1小时后去除接种物。随后将细胞单层洗涤三次，每次使用2mL PBS，来去除任何过量的病毒接种物。向每个孔中添加两毫升含2％FBS和1X抗生素-抗真菌剂的MEM，并将平板在37℃下用5％CO₂连续孵育。在接种后0、12、24、36、48、60、72、84和96小时(hpi)时，通过刮入上清液中，收获每个一式两份平板的一个孔中的细胞。将收获的细胞冻融3次，并储存于-80℃下直至滴定。使用连续稀释的接种物，在8孔Lab-Tek II培养箱载玻片(Nalge Nunc International，Rochester，NY)中测定每个hpi下的感染效价，之后使用Spearman-Karber方法(M.Fenaux et al.，2002，见上文)用PCV2 ORF2单克隆抗体进行IFA。

数据显示SDM-C6嵌合体病毒与在96hpi时生长至2.20x10^4.0TCID₅₀/mL效价的PCV1病毒(图2)生长得同样好，而PCV2在96hpi时仅生长至2.20x10^3.0 TCID₅₀/mL。在12hpi时，嵌合体SDM-C6病毒生长至6.95x10^2.0 TCID₅₀/mL的效价，而PCV1和PCV2病毒均具有不可检出的效价，得出结论时嵌合体病毒比亲本病毒复制得更快。PCV1在24hpi时具有8.70x10^2.0 TCID₅₀/mL的可检出的病毒效价，而PCV2直至48hpi时才具有可检出的效价(7.91x10^1.0 TCID₅₀/mL)。因此，观察到嵌合体SDM-C6病毒和PCV1病毒生长至类似的效价，比亲本PCV2病毒的效价高出约1-log。

在前文中为了阐述而非限制的目的提供了本发明的具体实施方案的具体说明。还应当理解，基于本公开对本领域技术人员而言显而易见的所有其它修饰、分支和等同物旨在包括在本发明要求保护的范围内。