相思子毒素A链突变体的构建及作为候选疫苗抗原

摘要

本发明公开了一种与相思子毒素疫苗相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，命名为mATA，是如下1)或2)中任一所述的蛋白质：1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，经过点突变获得的突变体mATA，是通过重组表达得到的相思子毒素A链突变体蛋白，经过检测，其具有低毒性、无血管渗漏、有良好免疫原性等特点，可以作为候选疫苗抗原。

说明书

技术领域

本发明涉及一种相思子毒素A链突变体的构建及作为候选疫苗抗原，尤其涉及一种与相思子毒素疫苗相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

随着生物技术的快速发展和生物毒素的开发利用，毒素在大规模杀伤性武器中的重要性已凸现出来，生物毒素及其生物恐怖的威胁与日俱增。相思子毒素是由A、B链组成，A链为效应链，具有RNA N-糖苷酶活性，B链为结合链，介导A链进入细胞内发挥毒性作用。不同产地的相思子含有在一级结构上稍有差异的相思子毒素，表现为其毒性大小有差异，文献报道的相思子毒素小鼠腹腔LD₅₀介于4-20μg/kg之间。生产原料相思籽来源广泛，容易获得，在许多公开的专业刊物和互联网上又可轻易得到如何提取制备相思子毒素的详细资料，所以，相思子毒素的恐怖威胁不容忽视。针对相思子毒素中毒，目前尚无预防疫苗、特异性抗毒素和解毒药。通过分析现有的研究进展和成果，美军的生防专家认为，疫苗研究是对抗其中毒的有效预防手段。因此，开展相思子毒素疫苗的研究，具有十分重要的军事和社会意义。

我国学者对相思子毒素生物战剂的侦检和医学防护等研究领域刚刚起步，针对相思子毒素的恐怖袭击尚无配套诊断试剂和有效免疫治疗及防护手段，因此迫切需要建立和发展具有自主知识产权的检测和防护用品。为了防止敌对势力和恐怖组织使用相思子毒素等生物战剂的袭击，应尽快建立和完善相思子毒素等生物战剂的侦检和医学防护系统，保证及时采取应急措施和对策，将生物恐怖袭击造成的破坏降低到最低限度。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与相思子毒素疫苗相关蛋白及其编码基因。

本发明提供的蛋白质，命名为mATA，是如下1)或2)中任一所述的蛋白质：

1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。

上述序列表中的序列2由251个氨基酸残基组成。所述一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

mATA的编码基因mATA也是本发明保护的范围，为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

上述序列表中的序列1由753个核苷酸组成，编码区为序列1自5’末端第1-753位核苷酸。

含有所述蛋白质的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明保护的范围。

所述重组载体为将所述编码基因插入载体pET-His的EcoRⅠ和NheⅠ识别位点间得到的重组载体。

所述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌得到的重组菌。

扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围，所述引物对的一条引物为序列3所示的DNA分子，另一条引物为序列4所示的DNA分子。

本发明的另一个目的是提供一种疫苗，它的活性成分为如下1)-3)中任一一种：1)所述的蛋白质；2)所述的重组载体；3)所述的重组菌。

所述蛋白质在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围；所述编码基因在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围；所述重组载体在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围；所述重组菌在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围。

所述疫苗为相思子毒素疫苗，具体为相思子毒素A链突变体疫苗。

本发明的实验证明，经过点突变获得的突变体mATA，是通过重组表达得到的相思子毒素A链突变体蛋白，通过A链突变体免疫原的免疫途径、剂量、次数、佐剂等多种不同免疫方案，分析相思子毒素A链突变体的免疫保护效果，结果为该突变体具有低毒性、无血管渗漏、有良好免疫原性等特点，可以作为候选疫苗抗原。

附图说明

图1为相思子毒素A链突变体纯化图

图2为相思子毒素A链突变体的SDS-PAGE电泳图

图3为BCA法测定蛋白浓度标准曲线

图4为相思子毒素A链突变体对人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用曲线

图5为相思子毒素A链突变体对骨髓瘤细胞Sp2/0的杀伤作用曲线

图6为mATA体内中和实验体重变化

图7为mATA体外中和实验体重变化

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、突变体mATA的获得

1、突变体mATA的获得

根据已有的相思子毒素的A链基因(rATA)序列(rATA核苷酸序列为序列5，rATA氨基酸序列为序列6)，采用Quickchange Lighting Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司，Catalog#210518)进行定点突变获得突变体mATA-E164AR167L(质粒)，经测序，mATA-E164AR167L含有的基因命名为mATA，其核苷酸序列为序列表中的序列1，编码区为序列表中序列1的自5’末端第1-753位核苷酸序列；mATA编码的蛋白mATA的氨基酸序列为序列表中的序列2所示的序列。应用Lasergene软件预测所构建的突变体的抗原性未发生明显变化。

测序验证突变结果，具体如下：

将序列5的第491位的碱基A突变为序列1第491位的碱基C，序列5第500位的碱基G突变为序列1第500位的碱基T。

将序列6的第164位氨基酸谷氨酸(E)突变为序列2的第164位氨基酸丙氨酸(A)，序列6的第167位氨基酸精氨酸(R)突变为序列2的第167位氨基酸亮氨酸(L)。

设计引物：

1.ABRaA Upper：5’-GGAATTCGAAGATCGCCCGATCAAATTTTCCACCGAAGGTGCCAC-3’

                  (EcoR I)(序列3)

2.ABRaA Lower：5’-GGCTAGCATTCGGCGGATTGCAGACAAACAGCATCAGTGCCAGAACTGC-3’

                  (Nhe I)(序列4)

以上述获得的突变体质粒mATA-E164AR167L作为模板，用引物ABRaA Upper和ABRaA Lower进行扩增，获得的PCR产物连接至克隆载体pMD18-T(宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号D101B)得到pMD18T-mATA(也可人工合成序列1，连接到pMD18-T得到pMD18T-mATA。)，再用EcoRⅠ(NEB公司，R0101V)和NheⅠ(NEB公司，R0131V)双酶切pMD18T-mATA后回收小片段，与经过同样酶切的表达载体pET-His(孙嗣梅，王景林等.重组蓖麻毒素A链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析.中国生物工程杂志.2005，25(4)：47-51.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)的载体片段连接，得到的连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(北京全式金生物技术有限公司，产品目录号D30619)，经筛选后的阳性菌，提取质粒后测序，结果为该质粒为将序列表中序列1插入表达载体pET-His的EcoRⅠ和NheⅠ的识别位点间得到的质粒，将该质粒命名为pET-His-mATA，将其对应的阳性菌命名为BL21(DE3)pLysS/pET-His-mATA。

2.纯化mATA

将上述获得的BL21(DE3)pLysS/pET-His-mATA按1∶100的比例接种于5ml含Amp(100μg/ml)和Glu(0.5％)的LB培养基，37℃，200rpm培养至A₆₀₀＝0.6时，再按1∶100的比例转接至500ml同样的LB培养基(并设阴性对照)，同上条件振荡培养至A₆₀₀＝0.6时，诱导组加IPTG至终浓度1mM并补加Amp，然后继续振荡培养，诱导条件改为30℃，150rpm诱导5h后，10000rpm，4℃离心10min收集表达菌株的菌体，将全菌沉淀用PBS洗涤三次，再以裂解缓冲液(0.02M PB，500mM NaCl，50mM咪唑，pH7.4)重悬超声破碎后，10000rpm，4℃离心10min，收集上清液和沉淀，上清液直接加2×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液(H₂O、甘油、1.5mM pH6.8Tris、10％溴酚蓝、β-巯基乙醇)，而沉淀用8M的尿素溶解后加2×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液，最后均在100℃煮沸5min，并短暂离心。吸取20μl样品，进行SDS-PAGE电泳。

经15％SDS-PAGE电泳分析，相思子毒素A链突变体(mATA)在上清液有特异性的蛋白表达，蛋白相对分子量约为30kDa，与预期的蛋白大小相符。

将上述获得的上清液进行亲和层析，层析柱为Ni Sepharose High performance亲和层析柱(GE Healthcare，17-5248-01)，洗脱液为含500mM咪唑洗脱液(由PB、NaCl、咪唑和水组成，其中PB在洗脱液的终浓度为0.02M、NaCl在洗脱液的终浓度为500mM、咪唑在洗脱液的终浓度为500mM，PH为7.4)，洗脱流速为2ml/min，当咪唑浓度为300mM时，收集洗脱峰即为纯化的mATA，结果如图1所示。

将收集的纯化的mATA经SDS-PAGE电泳分析，结果如图2，其中M为低分子量蛋白marker，1-3均为经镍柱纯化后mATA，可以看出，蛋白相对分子量约为30kDa，洗脱蛋白的纯度高于98.5％。

采用同样的方法将空载体pET-His转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，得到重组菌BL21(DE3)pLysS/pET-His，诱导表达得到的蛋白作为对照蛋白，经SDS-PAGE电泳验证没有目的蛋白表达。

采用同样的方法将序列5所示的DNA分子导入载体pET-His中，再转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS得到重组菌BL21(DE3)pLysS/pET-His-rATA，诱导表达得到的蛋白为rATA(重组相思子毒素A链蛋白(未突变))。

实施例2、突变体mATA的生物活性检测

1.突变体蛋白的定量

采用BCA法蛋白定量试剂盒(购于北京百泰克生物技术有限公司，Lot#20120613)对实施例1得到的纯化的mATA进行定量，实验重复三次，结果取平均值。

具体步骤：

试剂盒组成：蛋白标准(5mg/mlBSA)、Solution A、Solution B。

(1)使用时将Solution A摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积Solution B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

(2)完全溶解蛋白标准品(5mg/mlBSA)，用PBS将其稀释至1.5mg/ml，1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml作为标准品。

(3)将上述各浓度的标准品及待测样品分别加到96孔板中。

(4)各孔加入200ulBCA工作液，轻轻用加样枪吹打混匀，37℃放置30-60分钟。

(5)冷却到室温后，用酶标仪测定A562。

(6)根据标准曲线计算出待测样品中的蛋白浓度。

结果如图3所示，纯化的mATA的浓度为1.46mg/ml(经Ni亲和层析柱纯化以后得到的目的蛋白)，500ml菌液所得蛋白量为23.5mg。

2、相思子毒素A链突变体(mATA)抗原性分析

将由实施例1获得的纯化的mATA进行Western印迹分析：将mATA经SDS-PAGE电泳后转移至醋酸纤维素薄膜上，以抗天然abrin兔多克隆抗体(制备方法见后述)为一抗，以辣根酶标记山羊抗兔lgG(美国Santa Cruz公司，ZB-2301)为二抗，以实施例1获得的对照蛋白为阴性对照。

结果显示在30KDa附近有特异显色带出现，说明所得到的重组突变体蛋白能被抗天然abrin兔多克隆抗体所识别，具有良好的抗原性。阴性对照没有发生特异性的抗原抗体反应。

将由实施例1获得的纯化后的mATA用包被液进行系列稀释，然后进行包被，100ul/孔，以抗天然abrin兔多克隆抗体为一抗，以辣根酶标记山羊抗兔lgG为二抗，进行ELISA检测。以天然abrin为阳性对照，实施例1获得的对照蛋白为阴性对照。实验重复三次，结果取平均值。

结果如下：与阳性对照(纯化的天然abrin)相比，2ug/ml以上浓度纯化的mATA包被孔均为强阳性，说明突变体蛋白mATA能与以抗天然abrin兔多克隆抗体发生特异性的抗原抗体反应，进一步验证了所获得突变体的正确性。阴性对照没有发生特异性的抗原抗体反应。

天然abrin，其genbank号为X76720，也可以通过如下方法获得：相思籽(云南相思子(Abrus precatorius L.)，购自中国科学院昆明植物研究所)匀浆、抽滤、浸提、饱和硫酸铵沉淀、粗提、亲和层析、凝胶过滤，得到纯化的天然abrin。(参考文献：聂聪等.相思子毒素抗原和抗体制备.中国国境卫生检疫杂志.2009.32(4)：281-284)。

抗天然abrin兔多克隆抗体制备方法：用含1％甲醛的磷酸盐缓冲液对天然abrin减毒处理制备类毒素，以类毒素为免疫抗原分4次免疫新西兰纯种大耳白兔，耳缘静脉采血，以天然abrin为抗原，用间接ELISA测定效价，效价达到1∶10⁶后心脏采血。兔血清经滤膜滤过，加醋酸缓冲液稀释，在酸性条件下，正辛酸沉淀非IgG蛋白，离心取上清液，在中性条件下置冰浴中饱和硫酸铵，以体积分数为45％饱和度沉淀IgG蛋白，收集沉淀蛋白，透析、离心、取上清液，经滤膜滤过，按说明书经HiTrapTM rProtein A FF亲和柱纯化抗体。

3、突变体蛋白的活性分析

通过MTS法测定突变体蛋白mATA对人肝癌细胞SMMC-7721(北京兴奥康生物科技有限公司，AK169711)和骨髓瘤细胞Sp2/0(上海信然生物技术有限公司，GS-183)的杀伤作用，具体如下：

(1)将人肝癌细胞SMMC-7721(或骨髓瘤细胞Sp2/0)计数，调节细胞数至10⁵/ml，制备10ml细胞悬液，加入96孔板，100μl/孔，即细胞数为10⁴/孔。空白孔不加细胞悬液。

(2)5％CO₂，37℃条件下培养24h。

(3)每孔加入100μl用含10％新生牛血清的1640培养基(赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，SH30809.01B)10倍系列稀释的由实施例1获得的纯化的mATA。阴性对照孔不加毒素。

(4)5％CO₂，37℃条件下培养72h。

(5)吸除培养液，PBS洗板三遍，加入100μl无血清培养基，20μl MTS(CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay，Sigma公司，G3580)，37℃条件下培养3h。

(6)微孔板式酶标仪上测定A490值。

(7)计算细胞存活率：

细胞存活率(％)＝(试验组A490/阴性对照组A490)×100％。

以实施例1获得的rATA和天然abrin作为对照。实验重复三次，结果取平均值。

结果如图4和图5所示，图4为相思子毒素A链突变体对人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用曲线，图5为相思子毒素A链突变体对骨髓瘤细胞Sp2/0的杀伤作用曲线。

相思子毒素A链突变体对人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用结果具体为：

mATA IC₅₀约为1.5×10^-7M，天然abrin IC₅₀约为1×10^-11M，rATA IC₅₀约为5×10^-11M。

相思子毒素A链突变体对骨髓瘤细胞Sp2/0的杀伤作用结果具体为：

mATA IC₅₀约为1.2×10^-7M，天然abrin IC₅₀约为1×10^-11M，rATA IC₅₀约为6×10^-11M。

可以看出，突变体蛋白(mATA)较之未突变前其IC₅₀明显升高，说明其毒性明显减弱，达到预期的突变目的。

4、突变体蛋白免疫原性分析

(1)免疫接种：实验动物采用BALB/c小鼠，雌性，5-6周龄，体重约18-20克(军事医学科学院实验动物中心，SCXK-(军)2007-004)，每组用20只小鼠。对免疫组小鼠进行初次免疫，即将PBS稀释的由实施例1得到的纯化的mATA(250μg/ml，每只小鼠100μl)与等量铝佐剂ImjectAlum(Thermo Scientific公司，77161)充分混合后，每只小鼠注射200μl(分别采用皮下和肌肉两种免疫方式)，一周后尾静脉取血，37℃孵育2h后，6000r/min离心15min留取血清备用。初免两周后，再进行两次加强免疫，间隔两周，每次免疫后一周均按前述方法取血留血清进行间接ELISA法检测效价。

免疫鼠血清效价采用间接ELISA法测定，具体方法如下：将定量后的纯化的mATA用包被液稀释至5ug/ml，4℃过夜包被酶联板；次日倒掉包被液，以洗涤液洗板3次，2min/次；然后加封闭液封闭1h；1h后再洗板3次，加入免疫鼠血清(一抗，用稀释液按照1∶10，1∶10²，1∶10³，1∶10⁴，1∶10⁵，1∶10⁶，1∶10⁷，1∶10⁸稀释)，作用1h；1h后先洗板，再加入辣根酶标记山羊抗小鼠lgG(美国santa Cruz公司，ZB-2305)(二抗，用稀释液按1∶5000稀释)，作用1h后；依次加入显色液A、B，显色5min后加终止液(2MH₂SO₄)，在酶联仪检测OD450。

以PBS溶液(0.01mol/L，pH7.2，每1L溶液含Na₂HPO₄·12H₂O 2.86g，NaH₂PO₄·2H₂O0.312g，NaCl 8.5g)进行注射作为对照。实验重复三次，结果取平均值。

mATA三免以后血清效价达到1∶10⁶。

PBS溶液对照组三免以后ELISA检测为阴性，无特异性抗体产生。

(2)免疫小鼠血清的体内中和作用：

改良寇氏法测定天然abrin小鼠LD₅₀。BALB/c小鼠，雌性，20g/只，分为5组，每组8只，其中一组注射PBS作为阴性对照，其余各组分别经腹腔注射0.1μg/ml，0.2μg/ml，0.4μg/ml，0.8μg/ml的天然abrin，观察7天，记录各组死亡率分别为0，0，0，87.5％，100％，应用公式log LD₅₀＝Xm-i(∑P-0.5)，计算出LD₅₀为7.7μg/kg。其中：Xm：最大剂量组剂量的对数  P：各组死亡率  i：组间剂量比的对数  n：每组动物数。

20只ELISA抗体效价达1∶10⁶的免疫后小鼠，分成四组，每组5只，PBS免疫小鼠为对照组。

1-4组分别注入1LD₅₀，4LD₅₀，8LD₅₀，10LD₅₀的纯化的天然abrin(纯化的天然abrin对小鼠的腹腔注射LD₅₀为7.7μg/kg，小鼠的体重按22g/只计算)，注射体积用PBS(0.01mol/L，pH7.2)稀释为0.5ml/只，注射后观察10天，每天记录小鼠体重变化和死亡情况。

攻毒后一周尾静脉取血，采用上述的间接ELISA法测定抗体效价变化，结果如下：攻毒后一周，测定抗体效价，1-4组血清效价比攻毒前升高，均由1∶10⁶达到1∶10⁷。

攻毒后10天，记录小鼠体重，具体结果如下表1和图6所示：

表1  mATA体内中和实验体重变化

攻毒后10天，小鼠存活情况见表2：

表2  免疫鼠抗mATA体内中和作用后小鼠存活情况

从上述可以看出，攻毒以后，动物产生了二次免疫应答，血清效价比攻毒前升高，小鼠体重轻微减轻，10天内逐渐恢复正常，未见小鼠死亡。对照组体重减轻大于20％，且在免疫后2天内全部死亡。

(3)免疫小鼠血清的体外中和作用：

收集ELISA抗体效价达1∶10⁶的免疫鼠血清(-20℃保存)。将纯化的天然abrin配制成110μg/ml原液备用(纯化的天然abrin对小鼠的腹腔注射LD₅₀＝7.7μg/kg，小鼠体重按20g/只计算)，用下述方案实施体外中和试验。

a)第一组：7μl原液+1243μl PBS溶液+1250μl免疫鼠血清混合，37℃温育30min，然后500μl/只，腹腔注射。abrin的用量为0.154μg/只，相当于1倍LD₅₀。

b)第二组：28μl原液+1222μl PBS溶液+1250μl免疫鼠血清混合，37℃温育30min，然后500μl/只，腹腔注射。abrin的用量为0.616μg/只，相当于4倍LD₅₀。

c)第三组：56μl原液+1194μl PBS溶液+1250μl免疫鼠血清混合，37℃温育30min，然后500μl/只，腹腔注射。abrin的用量为1.232μg/只，相当于8倍LD₅₀。

d)第四组：70μl原液+1180μl PBS溶液+1250μl免疫鼠血清混合，37℃温育30min，然后500μl/只，腹腔注射。abrin的用量为1.54μg/只，相当于10倍LD₅₀。

e)第五组：对照组，70μl原液+1180μl PBS溶液+1250μl正常鼠血清混合，37℃温育30min，然后500μl/只，腹腔注射。abrin的用量为1.54μg/只，相当于10倍LD₅₀。

注射后观察10天，记录小鼠体重变化和死亡情况。

结果：

攻毒后10天，记录小鼠体重，具体结果如下表3和图7所示：

表3  mATA体外中和实验体重变化

攻毒后10天后存活情况见表4。

表4  免疫鼠抗mATA体外中和作用后小鼠存活情况

可以看出，小鼠体重未受影响，且按正常生长规律增高，所有小鼠正常存活；对照组体重减轻大于20％，且在免疫后2天内全部死亡。

表明，mATA免疫鼠血清可有效中和10LD₅₀剂量的天然相思子毒素(天然abrin)，说明所获得的突变体mATA可以作为一种良好的免疫原。

结论：本发明采用定点突变、基因克隆拼接和重组表达等分子生物学技术，遴选出降低毒性、保留或提高免疫原性的相思子毒素A链突变体mATA。通过重组表达相思子毒素A链突变体蛋白，建立重组蛋白的表达和快速纯化方法，然后通过A链突变体免疫原的免疫途径、剂量、次数、佐剂等多种不同免疫方案，分析相思子毒素A链突变体的免疫保护效果，最终确定相思子毒素A链突变体mATA可以作为一种合适、有效的候选疫苗抗原。