巴豆枝叶中提取的二萜类化合物及其用途

摘要

本发明公开了从巴豆枝叶中提取的二萜类化合物，包括：12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)和12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)。本发明还公开了上述二萜类化合物的用途为制备杀烟草花叶病毒和植物病原菌的生物农药。经试验证明，从巴豆枝叶中提取的二萜类化合物：12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)和12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)均能显著的抑制烟草花叶病毒侵染和增殖，能显著的抑制黄瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌等植物病原菌。

说明书

所属技术领域

本发明属于生物农药技术领域，涉及从巴豆枝叶中提取的二萜类化合物，本发明还涉及此二萜类化合物的用途。

背景技术

目前，我国农业正面对日趋激烈的国际竞争，在农产品贸易方面，严格苛刻的农药残留量标准正成为我国农产品出口的“绿色壁垒”；另一方面.随着人民生活水平的不断提高，食用“无公害”农副产品也成为国人所必需。生物农药与化学农药相比，具有对人畜和非靶标生物安全，环境兼容性好，不易产生抗性，易于保护生物多样性，来源广泛等优点。因此，高效生物农药的开发应用对人类健康、环境保护和农业的可持续发展都有极其重要的意义。

烟草花叶病毒是人类最早发现的植物病毒，其寄主范围非常广泛，能侵染烟草、番茄、水稻等300多种植物，引起植物枯萎等，是对农作物危害最大的病毒。

植物病原菌包括植物病原真菌和植物病原细菌，主要有黄瓜疫霉枯萎病菌、番茄白绢病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、甘蔗凤梨病菌、香蕉炭疽病菌、水稻纹枯病菌、水稻瘟病菌、玉米纹枯病菌等，其分布广泛，对农作物的危害极大。

当前对于农作物感染烟草花叶病毒和植物病原菌的防治，虽然有一些生物农药，但主要还是以化学农药为主，因此，市场急需高效低毒、无污染残留的生物农药。

巴豆是一味著名的中药，为大戟科植物巴豆Croton tiglium L.及同属数种植物的成熟种子，其枝、叶在民间常用作杀虫药。而巴豆属(Croton)植物在中国分布面广，资源丰富，因此，为了开发利用巴豆枝叶这一可再生资源，本发明特对巴豆枝叶进行深入研究，从中提取出二萜类化合物，制作生物农药，用于防治烟草花叶病毒和植物病原菌引起的农作物病害。经检索，尚未见此方面的文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供从巴豆枝叶中提取的二萜类化合物。

本发明的另一个目的是提供所述二萜类化合物的用途。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

二萜类化合物是从巴豆枝叶中提取的，包括：12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)和12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)。

其分子结构如下：

化合物I：12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)

化合物II：12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)

所述从巴豆枝叶中提取的二萜类化合物的制备方法：取巴豆枝叶，粉碎，加乙醇或石油醚等提取，回收相应溶媒，得稀浸膏，过大孔吸附树脂，先用1～40％乙醇洗脱，弃去，再用70～90％的乙醇洗脱，收集70～90％的乙醇洗脱液，回收乙醇后，经硅胶柱、凝胶柱等反复柱层析，即得此二萜类化合物。

所述从巴豆枝叶中提取的二萜类化合物用途为：用于制备杀烟草花叶病毒和植物病原菌的生物农药。所述杀烟草花叶病毒和植物病原菌的生物农药中含有有效剂量的上述二萜类化合物。

所述的生物农药剂型可以是乳油、乳剂、悬浮剂、可湿性粉剂等任何一种现有农药剂型。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：经试验证明，该二萜类化合物均能显著的抑制烟草花叶病毒侵染和增殖，能显著的抑制黄瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌等植物病原菌。不仅为市场提供了一种高效低毒、无污染残留的生物农药，同时，其作用物质基础非常清晰，易于为西方国家所接受，有利于出口创汇。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例1

取巴豆枝叶100kg，加90％的乙醇回流提取2次，每次1小时，第1次加800kg90％的乙醇，第2次加600kg90％的乙醇，滤过，合并提取液，提取液回收乙醇并浓缩至相对密度1.05的稀浸膏，将此稀浸膏过D101大孔吸附树脂，先用30％乙醇洗脱至无色，将此30％乙醇洗脱液弃去，再用90％的乙醇洗脱至无色，收集此90％乙醇洗脱液，回收乙醇，得浸膏。将此浸膏用硅胶拌样加于硅胶柱上，三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，以薄层色谱进行检识，合并，得A、B两个部分，A部分过Sephadex LH-20凝胶柱，甲醇洗脱，收集洗脱液，薄层色谱进行检识，合并，回收甲醇，再过RP-18反相硅胶柱，甲醇-水梯度洗脱，收集洗脱液，以薄层色谱进行检识，合并，回收甲醇，得化合物I(165g)；B部分过Sephadex LH-20凝胶柱，甲醇洗脱，收集洗脱液，薄层层析进行检识，合并，回收甲醇，得化合物II(420g)。

各化合物的理化性质及波谱数据如下：

化合物I：12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)。白色固体，溶于氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇，分子式：C₃₀H₄₂O₈。EI-MS：m/z＝530[M]⁺，¹HNMR(500MHz，CDCL₃)δH：7.55(1H，s，H-1)，2.57(1H，d，J＝19.0Hz，H-5)，2.46(1H，d，J＝19.0Hz，H-5)，5.66(1H，m，H-7)，3.26(1H，m，H-8)，3.23(1H，m，H-10)，2.15(1H，s，H-11)，5.41(1H，d，J＝10.2Hz，H-12)，1.01(1H，d，J＝5.3Hz，H-14)，1.26(3H，s，H-16)，1.18(3H，s，H-17)，0.84(3H，d，J＝6.3Hz，H-18)，1.72(3H，m，H-19)，4.01(1H，d，J＝12.9Hz，H-20)，3.94(1H，d，J＝12.9Hz，H-20)，6.81(1H，dq，J＝7.0，1.1Hz，H-3’)，1.81(3H，s，H-4’)，1.78(3H，d J＝7.0Hz，H-5’)，2.38(1H，m，H-2″)，1.44(1H，m，H-3″)，1.70(1H，m，H-3″)，0.96(3H，t，J＝7.4Hz，H-4″)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz，H-5″)。¹³CNMR(100MHz，CDCL₃)δ_C：161.2(d，C-1)，132.7(s，C-2)，209.4(s，C-3)，73.6(s，C-4)，38.5(t，C-5)，140.4(s，C-6)，129.3(d，C-7)，38.8(d，C-8)，78.4(s，C-9)，56.1(d，C-10)，43.4(d，C-11)，76.6(d，C-12)，65.5(s，C-13)，36.6(d，C-14)，26.1(s，C-15)，17.2(q，C-16)，23.9(q，C-17)，14.4(q，C-18)，10.2(q，C-19)，68.1(t，C-20)，167.8(s，C-1’)，128.5(s，C-2’)，137.6(d，C-3’)，12.3(q，C-4’)，14.5(q，C-5’)，179.3(s，C-1″)，34.1(d，C-2″)，26.2(t，C-3″)，16.7(q，C-4″)，18.2(q，C-5″)。

结构为：

化合物II：12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)。白色固体，溶于氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇，分子式：C₂₇H₃₈O₈。EI-MS：m/z＝490[M]⁺，¹HNMR(500MHz，CDCL₃)δH：7.50(1H，s，H-1)，2.57(1H，d，J＝19.0Hz，H-5)，2.42(1H，d，J＝19.0Hz，H-5)，5.63(1H，m，H-7)，3.22(1H，m，H-8)，3.16(1H，m，H-10)，2.12(1H，m，H-11)，5.32(1H，d，J＝10.2Hz，H-12)，0.99(1H，d，J＝5.07Hz，H-14)，1.19(3H，s，H-16)，1.16(3H，s，H-17)，0.81(3H，d，J＝6.1Hz，H-18)，1.69(3H，s，H-19)，3.98(1H，d，J＝12.3Hz，H-20)，3.87(1H，d，J＝12.3Hz，H-20)，2.02(3H，s，H-2’)，2.31(1H，m，H-2″)，1.39(1H，m，H-3″)，1.75(1H，m，H-3″)，0.88(3H，t，J＝7.4Hz，H-4″)，1.10(3H，d，J＝7.0Hz，H-5″)。¹³CNMR(100MHz，CDCL₃)6_C：160.9(d，C-1)，132.8(s，C-2)，209.5(s，C-3)，73.5(s，C-4)，38.2(t，C-5)，140.8(s，C-6)，128.9(d，C-7)，36.9(d，C-8)，78.2(s，C-9)，55.8(d，C-10)，42.9(d，C-11)，77.0(d，C-12)，65.2(s，C-13)，38.3(d，C-14)，26.0(s，C-15)，16.9(q，C-16)，23.8(q，C-17)，14.4(q，C-18)，10.1(q，C-19)，68.0(t，C-20)，170.7(s，C-1’)，21.1(q，C-2’)，179.1(s，C-1″)，34.3(d，C-2″)，26.1(t，C-3″)，16.4(q，C-4″)，18.6(q，C-5″)。

结构为：

实施例2

取所述的12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)200g，加入200ml无水乙醇溶解后，加入吐温-80和甘油各50ml及无菌水1000ml，混合均匀，采用现有乳剂的制备工艺制备，即制得含12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)的乳剂的农药。

实施例3

取所述的12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)200g，加入200ml无水乙醇溶解后，加入吐温-80和甘油各50ml及无菌水1000ml，混合均匀，采用现有乳剂的制备工艺制备，即制得含12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)的乳剂的农药。

实施例4

取所述的12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)200g，加入500ml无水乙醇、50ml吐温-80，混合均匀，采用现有乳油的制备工艺制备，即制得含12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)的乳油的农药。

实施例5

取所述的12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)200g，加入500ml无水乙醇、50ml吐温-80，混合均匀，采用现有乳油的制备工艺制备，即制得含12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)的乳油的农药。

实施例6

取所述的12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)200g，加入500g白炭黑、50ml吐温-80，混合均匀，采用现有可湿性粉剂的制备工艺制备，即制得含12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)的可湿性粉剂的农药。

实施例7

取所述的12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)200g，加入500g硅藻土、50ml吐温-80，混合均匀，采用现有可湿性粉剂的制备工艺制备，即制得含12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)的可湿性粉剂的农药。

实施例8

取所述的12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)100g，加入5g润湿分散剂(十二烷基苯磺酸钙)、890g去离子水，混合均匀，再加入1g增稠剂(黄原胶)、3g防冻剂(甘油)，采用现有悬浮剂的制备工艺制备，即制得含12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)的悬浮剂的农药。

实施例9

取所述的12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)100g，加入5g润湿分散剂(十二烷基苯磺酸钙)、890g去离子水，混合均匀，再加入1g增稠剂(黄原胶)、3g防冻剂(甘油)，采用现有悬浮剂的制备工艺制备，即制得含12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)的悬浮剂的农药。

为考察本发明----巴豆枝叶中的二萜类化合物的有效性，发明人分别以上述实施例1所述的二萜类化合物为试验药物，进行了试验考察，试验方法和结果等分别如下：

一、抗烟草花叶病毒试验

1、试验材料：

烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)普通株系由四川农业大学提供；供试TMV局部枯斑寄主为心叶烟(Nicotiana glutinosa)，TMV系统侵染寄主为普通烟(Nicotiana tabacum)K₃₂₆品系，均在防虫温室内培育；ELISA检测所用TMV抗血清由提纯的TMV免疫家兔获得(效价为1∶10240)。

试验样品：二萜类化合物------12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)和12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)由实施例1制得，使用前分别用少量二甲基亚砜溶解后配成一定浓度溶液。

2、试验方法：

2.1抑制侵染作用测定(采用局部枯斑法)

选择健康、生长旺盛的6～8叶期心叶烟，左半叶接种试验样品与病毒等体积混和液(病毒接种终浓度为10μg/mL)，右半叶接种蒸馏水(含少量二甲基亚砜)与病毒等体积混和液作对照，接种后用水冲洗。每处理接种4～5个叶片，重复3次，3天后统计枯斑数目，计算抑制率。

抑制率(％)＝[(对照枯斑数一处理枯斑数)/对照枯斑数]×100％

2.2抑制增殖作用测定(采用叶碟法)

在健康的普通烟K₃₂₆叶片上接种病毒一定时间后，用打孔器从叶肉部分(避开大叶脉)打取直径为12mm的圆片，分别漂浮于供试样品溶液和蒸馏水(含少量二甲基亚砜)中作为处理和阳性对照，同时设置健康叶圆片漂浮于蒸馏水(含少量二甲基亚砜)中作为阴性对照。48小时后叶圆片以1∶20的碳酸盐缓冲液包被，间接ELISA法测定A₄₀₅值，计算抑制率。

抑制率(％)＝[(阳性对照病毒浓度一处理病毒浓度)/阳性对照病毒浓度]×100％

不同质量浓度试验样品抑制病毒增殖作用测定：在普通烟K₃₂₆上接种病毒24小时后，分别以1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL5个质量浓度试验样品处理，以叶碟法进行生物测定。

接种病毒不同时间后试验样品抑制病毒增殖作用测定：在普通烟K₃₂₆上接种病毒12、24、36、48小时后，分别用2种试验样品处理。以叶碟法进行生物测定。试验样品质量浓度均设为0.5mg/mL。

3、试验结果：

见表1、表2。

表1  不同质量浓度对TMV浸染的抑制作用

表2  不同质量浓度对TMV增殖的抑制作用

结果表明：二萜类化合物[12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)和12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)]均具有显著的抑制烟草花叶病毒侵染和增殖的作用。

二、抗植物病原菌试验

1、试验材料：

黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)均由四川农业大学提供。

试验样品：二萜类化合物12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)和12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)由实施例1制得，使用前分别用少量二甲基亚砜溶解后配成一定浓度溶液。

2、试验方法：

将供试品分别配成质量浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL的样品，加入到定量灭菌后冷却至50℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，充分摇匀，并以等体积的对应溶剂加入到马铃薯葡萄糖琼脂培养基中做对照，然后倒人直径为9cm的培养皿内制成平板，备用。培养基凝固后，在每个培养基中央用接菌针接入已制备好的供试病原菌菌饼(直径为5mm)，菌丝面向下，每处理设3个重复，置26℃恒温箱培养4天后，用十字交叉法测量菌落的2个直径，取其平均值代表菌落的直径，求出抑菌率。

菌落净生长直径(mm)＝测量直径-5

抑菌率(％)＝(对照菌落直径一处理菌落直径)/对照菌落直径×100

3、试验结果：

见表3、表4。

表3  12-O-Tiglovlphorbol-13-(2-methylbutyrate)的抑制率(％)

表4  12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)的抑制率(％)

结果表明：二萜类化合物[12-O-Tigloylphorbol-13-(2-methylbutyrate)和12-O-Acetylphorbol-13-(2-methylbutyrate)]均具有显著抑制黄瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌的作用。