一种检测尿液中艾普拉唑的代谢产物的方法

摘要

本发明提供了一种检测人尿液中艾普拉唑的代谢产物的方法，该方法包括以下步骤：(1)向尿液中加入Na

说明书

技术领域

本发明属于药物检测分析领域，具体涉及一种检测尿液中艾普拉唑的代谢产物的方法。

背景技术

艾普拉唑(2-[(4-甲氧基-3-甲基)-2-吡啶基]甲硫酰基-5-(1H-吡咯-1-基)-1H-苯并咪唑，以前称为IY81149)是由一洋制药株式会社(韩国，首尔)研发的用于治疗消化性溃疡的新型质子泵抑制剂。很多早期的动物(例如小鼠、大鼠、犬和猪)体外研究显示艾普拉唑呈剂量依赖性显著抑制反流性食管炎和胃液分泌的发展，对动物的心血管系统、自主神经系统或平滑肌功能的影响很小，表明艾普拉唑是一种有效而且非常安全的抗溃疡药。临床研究显示，胃食管反流病患者服用20mg艾普拉唑比服用20mg奥美拉唑(另一种质子泵抑制剂)的抑制胃pH降低的时间有所延长，且该抑制时间的延长有统计学差异。

药物代谢试验在新药研发和新药的临床应用中是非常重要的，然而现有的关于艾普拉唑代谢方面的研究报道很少，因此以人尿液样品中艾普拉唑的代谢产物为研究对象，更进一步对艾普拉唑的药物代谢动力学进行研究是必要的。分离和鉴定代谢产物是一项具有挑战意义的工作，这是因为代谢物质的量很少。采用由连字符连接的系统是具有较高效率的分离技术，如HPLC与MS串联系统可以进行特定的、敏感的检测，是克服上述困难的很有成效的方法。但是，对代谢产物结构的确切阐明，只有MS数据是远远不够的。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测人尿液中艾普拉唑的代谢产物的方法，该方法采用高效液相-质谱联用(HPLC-MS/MS)和高效液相-核磁共振联用(HPLC-NMR)，并对照艾普拉唑及其代谢产物的标准品的MS/MS和NMR数据，从而鉴定了艾普拉唑经口服后在人尿液中的代谢产物的结构。

本发明的技术方案如下：

一种检测人尿液中艾普拉唑的代谢产物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)向尿液中加入Na₂CO₃溶液进行沉淀，取上清液加入含有0.05mol/l铵盐的二氯甲烷溶液进行萃取，有机相挥干溶剂得样品；

(2)采用以下条件对样品进行高效液相色谱-质谱联用分析：

a.高效液相色谱条件：C₁₈反相色谱柱，以0.05mol/l的醋酸铵水溶液和乙腈为混合流动相进行梯度洗脱，0～9分钟内0.05mol/l的醋酸铵水溶液与乙腈的体积比为3∶7，9～12分钟内0.05mol/l的醋酸铵水溶液与乙腈的体积比变为5∶5，12～18分钟内醋酸铵水溶液与乙腈的体积比为5∶5；流速为1.0ml/分钟；紫外检测波长为306nm；

b.质谱条件：电喷雾质谱仪；高效液相色谱柱的流出物以5μl/分钟速度进入质谱仪；100～400m/z正离子模式全扫描；毛细管电压为2500伏；锥孔电压40伏；氮气喷雾流速为500l/小时；碰撞能量为36电子伏；

(3)采用以下条件对样品进行高效液相色谱-核磁共振联用分析：

高效液相色谱条件与步骤(2)中的相同，除了将0.05mol/l的醋酸铵水溶液中的水替换为氘代水，乙腈替换为氘代乙腈以外，采用停流模式进行¹H核磁共振检测，核磁共振条件：500兆赫兹核磁共振仪，内标物为氘代乙腈，采样时间为1.5秒，累加次数为256。

优选地，所述高效液相色谱的样品浓度均为15.7mg/L。

优选地，所述高效液相色谱的进样量均为20μL。

在上述的方法中，所述步骤(1)中的Na₂CO₃溶液的浓度优选为1mol/L。

优选地，所述步骤(1)中的Na₂CO₃溶液与尿液的体积比可以为1∶15～1∶5，所述上清液与含有0.05mol/l铵盐的二氯甲烷溶液的体积比可以为1∶10～1∶1。更优选地，Na₂CO₃溶液与尿液的体积比为1∶10，所述上清液与含有0.05mol/l铵盐的二氯甲烷溶液的体积比为1∶5。

优选地，所述步骤1中的有机相在40℃下经氮气挥干溶剂得样品。

优选地，所述高效液相色谱的柱温均优选为30℃。

优选地，所述步骤(2)中的质谱条件的电离源温度为120℃，去溶剂化温度为450℃。

优选地，所述的C₁₈反相柱内径为4.6mm，柱长为200mm，填料粒度为5μm。

艾普拉唑是用于治疗消化性溃疡的新型质子泵抑制剂。本发明采用高效液相-质谱联用分析仪(HPLC-MS/MS)和停流高效液相-核磁共振(HPLC-NMR)试验阐明了人尿液中的艾普拉唑代谢产物的结构。其中，尿液样品以碳酸钠溶液沉淀，以添加醋酸铵的二氯甲烷液-液萃取方法萃取。浓缩样品以C18反相色谱柱，乙腈和0.05mol/l醋酸铵水溶液组成溶液的梯度分离，MS/MS直接耦合联机检测，并且以¹H-NMR(500MHz)分光镜进行停流检测。根据艾普拉唑及其代谢产物的已有标准品的MS/MS和NMR数据鉴定出4个硫化代谢产物，即艾普拉唑硫醚，M1，化学式为：

12-羟基艾普拉唑硫醚，M2，化学式为：

11，12-二羟基艾普拉唑硫醚，M3，化学式为：

艾普拉唑硫醚A，M4，化学式为

结果证明该方法可以广泛应用于快速检测和鉴定艾普拉唑的代谢产物。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是艾普拉唑人体内的代谢途径。

图2是代谢产物M1的MS/MS谱图，通过该谱图推测M1为艾普拉唑硫醚。

图3是代谢产物M2的MS/MS谱图。

图4是代谢产物M2的¹H NMR(500MHz)，通过图3和图4的谱图推测M2为12-羟基艾普拉唑硫醚。

图5是代谢产物M3的MS/MS谱图。

图6是代谢产物M3的¹H NMR(500MHz)，通过图5和图6的谱图推测M3为11，12-二羟基艾普拉唑硫醚。

图7是代谢产物M4的MS/MS谱图。

图8是代谢产物M4的¹H NMR(500MHz)，通过图7和图8的谱图推测M4为艾普拉唑硫醚A。

具体实施方式

以下将结合实施例进一步阐述本发明，而不用于限制本发明。下面实施例中未注明的具体试验条件的试验方法通常按照常规条件，或者按照厂商所建议的条件。

实施例1

1.药物与试剂

艾普拉唑(5mg肠溶片)、艾普拉唑硫醚(≥99.5％)由丽珠医药集团股份有限公司(中国，珠海)提供。HPLC级乙腈购自Dikma公司(中国，广州)。用于核磁共振(NMR)的氘化乙腈购自Sigma-Aldrich Chemie GmbH(Steinheim，德国)。试验中的所有水溶液都是由Milli-Q水系统(Millipore，Bedford，MA，USA)制备的纯水。其它分析纯级化学试剂均购自湖南师范大学化学试剂厂(中国，湖南长沙)。

2.受试者

6名健康志愿者参加本研究，均不吸烟、无显著医学疾病史。本研究由中南大学湘雅医学院伦理委员会(中国，湖南)批准。所有受试者都签署了知情同意书，并在入组前进行体格检查、血生化筛选(包括全血细胞计数、肝功能检查)、尿常规和心电图。排除标准：最近1个月服用过质子泵抑制剂或其它药物的；2周内饮酒或药物高敏体质者。所有志愿者均于12:00、18:00进食标准饮食，试验期间密切监护任何不良事件的发生。试验期间禁止饮用酒、茶、咖啡、可可和果汁。

3.服药管理

所有受试者连续服药3天，每天早8点口服艾普拉唑1次(5mg/片，3片)。服药前、服药后0～48小时收集尿液样品，样品萃取分析前贮藏于约-40℃。

4.样品准备

10ml尿液样品用1ml 1mol/L Na₂CO₃水溶液沉淀，取上清液加入2ml 0.05mol/l的醋酸铵水溶液，10ml二氯甲烷以液-液萃取方法萃取2次。含有代谢产物的有机相在40℃下氮气挥干，残渣以50μl下述HPLC初始流动相溶解(浓度为15.7mg/L)，样品溶液20μl进样进行HPLC分析。

5.待测样品的检验

5.1液质联用

高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)系统包含ThermoFinnigan液相色谱观察器和ESI界面的LCQ Deca XP工具(ThermoFinnigan，San Jose，CA，USA)。代谢产物分离采用反相色谱柱(Hypersil BDS C₁₈，4.6×200mm，5μm，伊利特，中国大连)和C₁₈ODS(4.0mm×3.0mm)保护柱(Phenomenex，Torrance，CA，USA)。流动相由0.05mol/l醋酸铵水溶液(A溶剂)和乙腈(B溶剂)组成，按照梯度洗脱模式进行洗脱：开始以30％(体积)的A维持9分钟，3分钟内提高到50％(体积)的A；50％(体积)的A维持6分钟。流速保持为1.0ml/分钟，柱温箱设定柱温为30℃。紫外检测波长为306nm。色谱柱流出物经柱后的分离器联机转换到质谱分析，质谱分析为电喷雾质谱系统(ESI/MS)。柱后分离器以5μl/分钟速率送入电喷射针。质谱仪操作参数如下：ESI/MS正离子模式；质量检测采用100-400m/z范围内的全扫描模式；毛细管电压和锥孔电压分别为2500V和40V；氮气喷雾流速500l/小时；电离源温度120℃，去溶剂化温度450℃；代谢产物碰撞诱导离解模式(CID)产生离子碎片；碰撞能量为36eV；数据获取为液相色谱质谱(LC-MS)全扫描和串联质谱MS模式。

5.2液相色谱和核磁共振联用

高效液相色谱与核磁共振谱联用(HPLC-NMR)系统由Prostar-230液相色谱和Varian Inova-500核磁共振(NMR)光谱仪(Varian Corporation，Palo Alto，CA，USA)组成。固相和洗脱梯度与HPLC-MS/MS相同，流动相由D₂O为溶剂的0.05mol/l醋酸铵溶液(A溶剂)和乙腈的氘代试剂-d₃(B溶剂)组成。采用停止流动的方式采集LC-NMR ¹H NMR谱。¹H NMR采集时间为1.5秒。化学位移以相对于内部乙腈的氘代试剂的ppm表达。

6.结果与讨论

由于HPLC-NMR需要大样本分析，采用过载试验。因此，色谱分离条件必须最优化。试验中，色谱条件包括流动相、流动相添加剂、梯度程序和柱温是从数个试验中得到的，其中代谢产物溶解良好并且保留时间得到了优化。最终结果表明，当梯度洗脱模式为上述A溶剂0.05mol/l醋酸铵水溶液和B溶剂乙腈的线性洗脱模式时，取得了最佳溶解状态和最短分析时间。

首先，艾普拉唑代谢产物可能的结构已经根据药品代谢规律和艾普拉唑的结构进行了推测。紫外检测波长306nm，口服艾普拉唑后的人尿液样品采用质谱全扫描，并与空白尿液样品进行比较，鉴定可能的代谢产物。根据高效液相色谱紫外检测(HPLC-UV)和高效液相色谱质谱(HPLC-MS)试验中收集的数据，可以推测出4种代谢产物(M1-M4)。在尿液样品中没有发现艾普拉唑。代谢产物的数据再采用HPLC-MS/MS和HPLC-NMR进行分析，并联合艾普拉唑及其代谢产物的已知的MS/MS数据和¹H NMR数据，4种代谢产物的结构阐明如下：

M1的保留时间为15.26分钟，质子化离子峰为[M⁺H]⁺ m/z 351，比艾普拉唑的质量数少16，推测可能为艾普拉唑去掉了一个氧原子。M1的MS/MS谱显示，二级碎片离子峰为m/z 318、168和184(见图2)。离子m/z 318[M⁺H-33]⁺提示代谢产物存在硫键，这是具有-CH₂-S-键取代的吡啶环的苯并咪唑的典型裂解过程。离子m/z 168(质量数比艾普拉唑少16)高度提示艾普拉唑中的亚砜基团被还原为硫醚基团。离子m/z 184，这与艾普拉唑的一样，提示苯并咪唑环和吡咯环没有变化。根据以上数据，化合物M1确定为艾普拉唑硫醚。此推论是依据M1与对照品艾普拉唑硫醚的HPLC保留时间、紫外光谱和MS/MS数据进行比较后确定的。

M2的保留时间为8.47分钟，质子化离子峰为[M⁺H]⁺ m/z367，与艾普拉唑质量数相同。但是，M2比艾普拉唑亲水性更高、表现在HPLC分析时保留时间更短。MS/MS谱出现离子m/z 334[M⁺H-33]⁺提示，M2存在一个硫醚键而不是一个亚砜基团，提示其被羟基化而增加了另一个氧原子。M2的MS/MS谱也表现有其它2种离子，m/z 168和m/z 200(见图3)。产生的离子m/z 168与M1产生的离子的质量数相同，提示吡啶环没有发生羟基化。产生的离子m/z 200，比M1产生的离子质量数多16，提示在苯并咪唑环或者吡咯环上发生了羟基化。M2的¹H NMR(见图4)显示出ABX系统中3个芳香族氢原子分别在δH 7.61(1H，s，H-4)、δH 7.41(1H，d，J＝8Hz，H-6)和δH 7.30(1H，d，J＝8Hz，H-7)产生共振信号，提示苯并咪唑环上没有发生羟基化。但是在吡咯环上，仅有3个芳香族氢原子信号显示出δH 6.13(1H，d，J＝2Hz，H-13)和δH 7.29(2H，br s，H-11和H-14)，因此可推断出H-12是羟基化物。M2推论为12-羟基艾普拉唑硫醚。

M3质谱是在保留时间为4.04分钟时检测到的，离子峰[M⁺H]⁺m/z383。MS/MS谱出现离子峰m/z 334[M⁺H-33]⁺也提示存在硫键。质子化分子m/z 383比M1质量数增加32，这可能是艾普拉唑硫醚的2个羟基化反应。M3产生的离子峰m/z168特征也表明吡啶环没有变化。根据¹H-NMR，由于仅有2个芳香族氢离子出现在δH 6.27(1H，d，J＝2Hz，H-13)和δH 7.56(1H，d，J＝2Hz，H-14)，故2个羟基基团位于吡咯环的C-11和C-12。因此，M3推论为11，12-二羟基艾普拉唑硫醚。

M4的保留时间为6.39分钟，质子化离子峰[M⁺H]⁺ m/z 343。典型的离子峰m/z 310([M+H-33]⁺)和m/z 168提示存在硫醚结合一个没有变化的吡啶环。¹H NMR谱显示，3个芳香族氢离子在苯并咪唑环，即δH 7.69(1H，s，H-4)、δH 7.45(1H，d，J＝8Hz，H-6)和δH 7.18(1H，d，J＝8Hz，H-7)；2个芳香族氢离子在吡啶环，即δH 8.16(1H，d，J＝6Hz，H-20)和δH 6.91(1H，d，J＝6Hz，H-19)，吡咯环的氢原子消失，提示吡咯环发生了开环反应。¹H-NMR谱的高位区显示出一个-NH-CH₂-CH₂-CH₃基团信号。因此，根据MS/MS谱的碎片离子特征和¹H NMR谱信号，M4的结构为艾普拉唑硫醚A。

艾普拉唑人体内可能的代谢途径见图1，可以看到艾普拉唑的亚砜基团在所有的代谢产物中被还原为相应的硫醚，随后的生物转化发生在吡咯环的羟基化和还原反应。

通过HPLC-MS/MS和停流HPLC-1H NMR方法从口服艾普拉唑后的人的尿液中的鉴定出4种代谢产物，说明该方法能够快速检测艾普拉唑的代谢产物而且无需分离各个代谢产物，是很令人期待的十分有效的直接从混合物中鉴定代谢化合物的检测方法。本研究中阐述的4个代谢产物都是艾普拉唑硫醚衍生物，尿液样品中没有检测到艾普拉唑，这些重要的代谢数据将成为研究艾普拉唑代谢的有用资源。