一种治疗短暂性脑缺血发作的毛冬青皂酮胶囊

摘要

本发明涉及一种治疗短暂性脑缺血发作的毛冬青皂酮胶囊。可有效解决治疗短暂性脑缺血发作的问题。本发明胶囊是由毛冬青总黄酮、总皂苷以重量比10∶5-7混合在一起，加入毛冬青总黄酮、总皂苷和辅料总重量和的10-50％的辅料，装入胶囊内制成，所述的辅料为微晶纤维素，或淀粉，或硬脂酸镁，或糊精的一种或两种的混合。本发明组方简单，配伍科学合理，功效显著，是毛冬青药用价值上的创新。

说明书

一、技术领域

本发明涉及医药，特别是一种治疗短暂性脑缺血发作的毛冬青皂酮胶囊。

二、背景技术

短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack，TIA)是指颈内动脉系统或椎基底动脉系统局部短暂性血液供应不足引起的一过性神经功能障碍综合征，脑缺血的局灶性、短暂性和反复发作性是其最主要的临床特征，多见于50岁以上的中老年人。TIA是缺血性中风的临床早期表现，TIA发作越频繁，发生中风的危险性就越大。TIA患者有10％～37％在3～5年内可发展为完全性脑卒中，从第1次TIA发作到发展为脑卒中，多数在TIA后第1年内，且在TIA后头2个月内发生脑卒中的危险性最高。TIA患者1年后脑卒中的发生率比同年龄而无TIA的对照高16倍。TIA被认为是脑梗死的超级预警信号，无论何种原因所致的TIA都应作为发生完全性脑卒中的重要危险因素，一旦出现即意味着脑梗死风险显著增加，及时治疗TIA是预防缺血性脑卒中的重要措施。

药物对脑血管疾病的干预治疗已成为社会和医学界关注的重要课题，虽然对治疗脑血管疾病药物的开发还在不断深入，但是现有的药物由于价格较贵且给药方式受限、不良反应及副作用多而不适宜正常状况下反复应用或因用药时间长、给药剂量大等使应用受到了限制，目前缺少一种专一用于防治TIA的药物，因而仍需进一步研发高效、低毒的防治脑缺血疾病的药物。

中药治疗脑血管疾病的历史悠久，且中药具有副作用小，成本低等优点；中医学具有整体观念的特点，而中药又具有多成分、作用于多靶点的特征，从而干预脑缺血损伤病理程多条路经。对于脑缺血疾病，中医多认为血瘀、火热内灼是缺血性脑卒中常见原因，因此长期主张使用以“活血化瘀”、“清热解毒”为主的治则来治疗本病。中医药利用“活血化瘀”方法治疗脑缺血取得了较好的效果，得到了较广泛的肯定。运用“活血化瘀”方药治疗TIA具有较广阔的研究前景，研发出疗效确切、起效快、剂量小的新剂型是中药治疗脑血管疾病的关键。

毛冬青是临床常用中药，其活血化瘀、清热解毒作用已在临床广泛应用，用于脑缺血疗效确切。目前国内已有的毛冬青制剂均为毛冬青的粗提取物，就是毛冬青注射液也是水提醇沉粗制剂，只控制了总黄酮类成分。现有毛冬青各类加工中均无专一用于防治TIA的制剂，且只考虑了毛冬青所含黄酮类成分而忽略了皂苷类成分，或考虑了皂苷类成分而忽略了黄酮类成分。本研究的重点将毛冬青所含的总黄酮、总皂苷两类主要活性部位配比研究，确定毛冬青组分适宜配比。为防治TIA心制剂研究打下基础。那么如何将毛冬青总黄酮、总皂苷制备成胶囊，供人们服用，用于治疗短暂性脑缺血发作呢？

三、发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的就在于提供一种治疗短暂性脑缺血发作的毛冬青皂酮胶囊。可有效解决治疗短暂性脑缺血发作的问题。

本发明解决的技术方案是，该胶囊是由毛冬青总黄酮、总皂苷以重量比10∶5-7混合在一起，加入毛冬青总黄酮、总皂苷和辅料总重量和的10-50％的辅料，装入胶囊内制成，所述的毛冬青总黄酮、总皂苷是取毛冬青药材加毛冬青重量的10倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，回收药液。药渣再加毛冬青重量的8倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，回收药液，合并第一次和第二次的药液；将两次的药液pH调到4-5后上大孔树脂；用质量浓度为35％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总黄酮，再用质量浓度为70％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总皂苷，所述的辅料为微晶纤维素，或淀粉，或硬脂酸镁，或糊精的一种或两种的混合。

本发明组方简单，配伍科学合理，功效显著，是毛冬青药用价值上的创新。

四、具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细的说明。

实施例1

本发明在实施中，本发明胶囊是由毛冬青总黄酮、总皂苷以重量比10∶5混合在一起，加入毛冬青总黄酮、总皂苷和微晶纤维素总重量和的10％微晶纤维素，装入胶囊内制成，所述的毛冬青总黄酮、总皂苷是取毛冬青800g药材加10倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，回收药液。药渣再加8倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，合并第一次和第二次的药液；将两次的药液pH调到4-5后上大孔树脂；用质量浓度为35％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总黄酮，再用质量浓度为70％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总皂苷。

实施例2

本发明在实施例中，本发明胶囊是由毛冬青总黄酮、总皂苷以重量比10∶6混合在一起，加入毛冬青总黄酮、总皂苷和淀粉、硬脂酸镁总重量和的10-20％的淀粉、1％的硬脂酸镁，装入胶囊内制成，所述的毛冬青总黄酮、总皂苷是取毛冬青800g药材加10倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，回收药液。药渣再加8倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，合并第一次和第二次的药液；将两次的药液pH调到4-5后上大孔树脂；用质量浓度为35％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总黄酮，再用质量浓度为70％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总皂苷。

实施例3

本发明在实施例中，本发明胶囊是由毛冬青总黄酮、总皂苷以重量比10∶7混合在一起，加入毛冬青总黄酮、总皂苷和糊精总重量和的40％-50％的糊精，装入胶囊内制成，所述的毛冬青总黄酮、总皂苷是取毛冬青800g药材加10倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，回收药液。药渣再加8倍量的质量浓度为70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，合并第一次和第二次的药液；将两次的药液pH调到4-5后上大孔树脂；用质量浓度为35％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总黄酮，再用质量浓度为70％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总皂苷。

本发明根据具体使用情况可制成胶囊，还可制成颗粒或片剂。

本发明具有活血化瘀、清热解毒之功效，有效用于治疗短暂性脑缺血发作的病症问题，并经实验资料得到了充分的证明，有关实验资料如下：

实验1毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对小鼠TIA模型的影响

1.实验材料

1.1药物试剂

毛冬青总黄酮、总皂苷，有河南中医学院实验室提供，方法为，取毛冬青800g药材加10倍量70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，回收药液。药渣再加8倍量70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，合并第一次和第二次的药液；将两次的药液PH调到4-5后上大孔树脂；用35％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总黄酮，在用70％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总皂苷。养血清脑颗粒，由天津天士力制药股份有限公司生产；尼莫地平，山东新华制药股份有限公司生产；氯化钠注射液，由郑州永和制药有限公司生产；水合氯醛，由上海山浦化工有限公司生产；甲醛溶液，天津市科密欧化学试剂有限公司；过氧化叔丁醇(tert-butylhydroperoxide，t-BHP)，由国药集团化学试剂有限公司生产；考马斯亮兰检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；SOD(Superoxide dismutase)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；MDA(Malonicdialdehyde)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；NO(Nitric oxide)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；NOS(Nitric oxide synthetase)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产。

1.2实验仪器

UV-2000紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司生产；TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产；电子分析天平，奥豪斯(上海)公司生产；DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器厂生产；DY89-1型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技有限公司生产；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司生产。

1.3实验动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体重30～35g，河北省实验动物中心提供。

2.实验方法

2.1造模与给药

取体重为30～35g的昆明种小鼠260只，雌雄各半，随即均匀分为13组，即：空白对照组，模型组，尼莫地平组，养血清脑颗粒组，极限等比增减设计毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组(总黄酮∶总皂苷10∶0组，10∶2组，10∶3组，10∶4组，10∶5组，10∶6组，10∶8组，10∶10组，0∶10组)，每组20只。除空白组外，其余12组造小鼠TIA模型。造模型9组分别灌服毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比药物(给药剂量总量保持0.3g/kg不变，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按上述比例，临用前用生理盐水配成相同浓度30mg/ml但不同比例的药液，给药体积0.1ml/10g)、养血清脑颗粒组(阳性对照药，给药剂量为2g/kg，临用前用生理盐水配成0.2g/ml，给药体积0.1ml/10g)、尼莫地平组(阳性对照药，给药剂量为0.4g/kg，临用前用生理盐水配成0.002g/ml，给药体积0.1ml/10g)、模型组(灌服同体积生理盐水)。空白对照组灌服同体积生理盐水。

造模方法：小鼠尾静脉注射0.11mol/L过氧化叔丁醇(7.5ml/kg)10min后，置于0.45L的广口瓶中，密封，使小鼠缺氧15min后取出，进行行为学评分。

行为学评分标准根据伍氏标准修改：①卒中指数：毛发脏乱1；四肢颤抖1；运动下降或迟钝或过强1；耳触觉减退1；上睑下垂1；后肢外展呈“八”字3；②神经系统症状：自发性探究1；刺激时走动或爬行1；刺激时不能动2；③步态：正常0；肌张力高1；爬行2；无步态3；④进食：有0；无1；⑤饮水：有0；无1；⑥对痛刺激的反应：移动/走动0；头/躯干运动过强或反应1；肢体回缩或无反应2。

小鼠连续灌胃给药3天后进行第1次TIA诱发。连续给药3天为1周期，每周期进行一次TIA诱发及行为学评分，共3个周期，结果见表6。于第3次诱发TIA及评分后第2天给药1h后，立即在冰盘中分离脑，把脑从矢状线分开成对称的脑，一半迅速放入倒有10％福尔马林溶液的瓶子中浸泡固定，做海马区组织病理切片；另一半放在滤纸上洗干净上面的血迹，然后用分析天平称量其重量，根据此重量计算应加入的冰冷的生理盐水的量，以脑组织(g)∶生理盐水(ml)＝1∶9的比例在低温下用玻璃匀浆机进行匀浆。4℃，3000r/min离心10min。取上清液于-20℃以下低温保存。制成10％的脑匀浆按测试盒说明操作，分别测定MDA、NO含量及NOS、SOD酶活力，结果见表7、表8、表9、表10和表11。

2.2试剂盒测定方法

表1考马斯亮兰蛋白测定操作顺序表

混匀，静置10分钟，于595nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管OD值蛋白含量(g/L)＝(测定管OD值-空白管OD值)×标准管浓度÷(标准管OD值-空白管OD值)

表2脑匀浆中MDA的测定操作顺序表

漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后4000转/分，离心10min，取上清液，520nm，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值

组织中MDA含量(nmol/mgprot)＝(测定管吸光度-测定空白管吸光度)×标准品浓度÷(标准管吸光度-标准空白管吸光度)÷蛋白含量(mgprot/ml)

表3脑匀浆中NO测定顺序表

组织中NO含量(μmol/gprot)＝(测定管吸光度-测定空白管吸光度)×标准品浓度÷(标准管吸光度-标准空白管吸光度)÷蛋白含量(mgprot/ml)

表4脑匀浆中NOS测定顺序表

tNOS活力(U/ml)＝(TNOS测定管TNOS空白管)÷呈色物纳摩尔消光系数×(反应液总体积÷取液量)÷(比色光径×反应时间)÷样品蛋白含量(mggrot/L)

iNOS活力(U/ml)＝(iNOS测定管iNOS空白管)÷呈色物纳摩尔消光系数×反应液总体积÷取液量×[1÷(比色光径×反应时间)]÷样品蛋白含量(mggrot/L)

表5脑匀浆中T-SOD测定顺序表

混匀，室温放置10min，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。

SOD活力(U/ml)＝(对照管吸光度测定管吸光度)÷对照管吸光度÷50％×反应体系的稀释倍数×样品测试前的稀释倍数

2.3统计学处理方法

数据分析用SPSS 13.0for windows医用统计包进行数据资料的统计学处理，计量资料组间比较用方差分析，用平均数±标准差表示，等级资料采用Ridit检验。

2.4实验结果

表6毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对小鼠TIA模型行为学评分的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组、尼莫地平组、养血清脑颗粒组均可使小鼠行为学评分显著降低(P＜0.01)；表明毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对过氧化物诱导的小鼠TIA模型的行为学评分有明显的降低作用，且以10∶4组，10∶5组，10∶6组尤其显著。

表7毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对小鼠TIA模型脑组织MDA的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比，模型组小鼠脑组织的丙二醛含量显著的升高(P＜0.01)，表明造模成功；与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组、尼莫地平组、养血清脑颗粒组丙二醛含量显著的降低(P＜0.01)；且以10∶3组，10∶4组，10∶6组最低。

表8毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对小鼠TIA模型脑组织NO水平的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比较，模型组小鼠脑组织中的NO含量显著升高(P＜0.01)；与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组能显著降低NO水平(P＜0.01)。表明毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对TIA模型小鼠脑内的NO含量的变化有改善作用，且以10∶2组，10∶6组最显著。

表9毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比对小鼠TIA模型脑组织NOS水平的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比较，模型组小鼠脑组织中的tNOS、iNOS水平显著升高(P＜0.01)；与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组、尼莫地平组、养血清脑颗粒组能显著降低tNOS、iNOS水平(P＜0.01)，表明毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对小鼠TIA模型脑组织NOS含量变化有明显的改善作用，且以10∶4，10∶6最显著。

表10毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对小鼠TIA模型脑组织SOD活性的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比较，模型组小鼠脑组织中的SOD含量显著降低(P＜0.01)；与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组能显著升高SOD水平(P＜0.01)；尼莫地平组、养血清脑颗粒组可显著升高SOD水平(P＜0.01)。表明毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对小鼠TIA模型脑组织中SOD含量变化有改善作用。且以10∶3组，10∶4组，10∶6组最显著。

空白组神经细胞核大，核内染色质蓬松，核仁清晰，海马区内的毛细血管和内皮细胞均正常；模型组神经细胞核萎缩，核内染色质固缩，核仁不清，海马区内的毛细血管明显扩张，内皮细胞模糊；毛冬青总黄酮与总皂苷10∶3组，10∶2U，10∶3组动物大脑海马区的部分神经细胞出现固缩现象；10∶4组，10∶5组，10∶6组神经细胞核恢复正常，核内染色质蓬松，核仁清晰，海马区内的毛细血管、内皮细胞基本恢复正常；10∶8组，10∶10组，0∶10组神经细胞核体积明显缩小，核内染色质固缩，核仁清晰，海马区内的毛细血管和内皮细胞恢复正常；尼莫地平组、养血清脑颗粒组神经细胞核体积基本恢复，核内染色质蓬松，核仁清晰，海马区内的毛细血管，内皮细胞基本恢复正常。

表11毛冬青总黄酮对小鼠TIA模型的影响海马区病理变化的影响

“-”动物脑神经细胞均正常，核内染色质蓬松，核仁清晰，毛细血管和内皮细胞均正常；“+”动物脑神经细胞部分缩小，核内染色质蓬松，核仁清晰，毛细血管和内皮细胞均正常；“++”动物脑神经细胞大部分萎缩，核内染色质固缩，核仁模糊，毛细血管扩张，内皮细胞模糊；“+++”动物脑神经细胞萎缩，核内染色质固缩，核仁模糊，毛细血管扩张，内皮细胞模糊。

经Ridit检验，空白组与模型组有显著的统计意义(P＜0.01)，说明造模小鼠出现脑神经细胞的损伤。与模型组比较，毛冬青与总皂苷不同配比组及养血清脑颗粒组、尼莫地平组均可显著性减轻海马区病理变化(P＜0.01)。

2毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对大鼠TIA模型的影响

1.实验材料

1.1药物试剂

毛冬青总黄酮、总皂苷，有河南中医学院实验室提供，方法为，取毛冬青800g药材加10倍量70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，回收药液。药渣再加8倍量70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，合并第一次和第二次的药液；将两次的药液PH调到4-5后上大孔树脂；用35％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总黄酮，在用70％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总皂苷。养血清脑颗粒，由天津天士力制药股份有限公司；尼莫地平，山东新华制药股份有限公司生产；氯化钠注射液，由郑州永和制药有限公司生产；水合氯醛，由上海山浦化工有限公司生产；甲醛溶液，由莱阳市双双有限公司生产；过氧化叔丁醇(t-BHP)，由国药集团化学试剂有限公司生产；考马斯亮兰，由南京建成生物工程研究所生产；LD(Lactic acid)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；LDH(Lactate dehydrogenase)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；ATP(Adenosine-triphosphate)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；LPA(Lysophosphatidicacid)检测试剂盒，由R&D生产。

1.2实验仪器

UV-2000紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司生产；TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产；电子分析天平，奥豪斯(上海)公司生产；DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器厂生产；DY89-1型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技有限公司生产；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司生产；酶免仪，680Microplate Reader，Bio-Rad Laboratories。

1.3实验动物

Wistar大鼠，雄性，体重280～310g，河北省实验动物中心提供，合格证号：1007003

2.实验方法与结果

2.1造模与给药

取体重280～310g的wistar雄性大鼠260只，随机均匀分为13组，即：空白对照组，模型组，尼莫地平组，养血清脑颗粒组，毛冬青总黄酮与总皂苷10∶0组10∶0组，10∶2组，10∶3组，10∶4组，10∶5组，10∶6组，10∶8组，10∶10组，0∶10组，每组20只。除空白组外，其余12组造大鼠TIA模型，造模型9组分别灌服毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比药物(给药剂量总量保持0.2g/kg不变，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按上述比例，临用前用生理盐水配成相同浓度20mg/ml但不同比例的药液，给药体积1ml/100g)、养血清脑颗粒组(阳性对照药，给药剂量为1g/kg，临用前用生理盐水配成0.1g/ml，给药体积1ml/100g)、尼莫地平组(阳性对照药，给药剂量为0.02g/kg，临用前用生理盐水配成0.002g/ml，给药体积1ml/100g)、模型组(灌服同体积生理盐水)。空白对照组灌服同体积生理盐水。

造模方法：大鼠第1次诱发时，尾静脉注射0.11mol/L过氧化叔丁醇5.2ml/kg，10min后，置于1L的广口瓶中，密封，使大鼠缺氧10min后取出，进行行为学评分。大鼠第2次诱发时，尾静脉尾静脉注射0.154mol/L过氧化叔丁醇5.2ml/kg，10min后，置于1L的广口瓶中，密封，使大鼠缺氧10min后取出，进行行为学评分。

行为学评分标准：正常0；少动或轻度激惹1；激惹性亢进(跳或窜)2；四肢颤抖或僵直3；腹部贴地，不能站立，四肢瘫痪，全身细小震颤4^[2]。

大鼠连续灌胃给药3天后进行第一次TIA诱发。连续给药3天为1周期，每周期进行一次TIA诱发及行为学评分，共2个周期，结果见表16。于第2次诱发TIA及评分后第二天给药1h后，立即眼眶取血(用肝素抗凝管抗凝)，离心，取血浆，-20℃低温保存，测定血浆中的溶血磷脂酸(LPA)含量。在冰盘中分离脑，把脑从矢状线分开成对称的脑，一半迅速放入倒有10％福尔马林溶液的瓶子中浸泡固定，做海马区组织病理切片；另一半放在滤纸上洗干净上面的血迹，然后用分析天平称量其重量，根据此重量计算应加入的冰冷的生理盐水的量，以脑组织(g)∶生理盐水(ml)＝1∶9的比例在低温下用玻璃匀浆机进行匀浆。4℃，3000r/min离心10min。取上清液于-20℃以下低温保存。制成10％的脑匀浆按测试盒说明操作，分别测定脑组织LD、LDH水平、ATP酶活力，结果见表17、表18、表19、表20和表21。

2.1试剂盒测定方法

表12LPA测定试剂盒组成

  1  酶标包被板  12孔×8条  7 显色剂A液 6mL  2  标准品  0.3mL×6管  8 显色剂B液 6mL  3  20倍浓缩洗涤液  25mL  9 终止液 6mL  4  样本稀释液  6mL  10 说明书 1份  5  特殊稀释液  6mL  11 封板膜 2张  6  酶标试剂  6mL  12 密封袋 1个

LPA试剂盒测定方法：①准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。②配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。③加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍)；空白对照孔不加。④温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。⑤洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。⑥加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。⑦温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。⑧洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。⑨显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，用手轻轻震荡混匀30s，37℃避光显色15min。⑩终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。

计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。

表13LD测定操作顺序表

混匀，530nm，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度

组织中乳酸含量＝(测定管吸光度-空白管吸光度)×标准浓度(3mmol/L)÷(标准管吸光度-空白管吸光度)÷样本中的蛋含量(gprot/L)

表14脑匀浆中LDH的测定操作顺序表

混匀，室温放置3min，440nm，蒸馏水调零，1cm光径，测各管吸光度值

组织中LDH活力(U/gprot)＝(测定管OD值-空白管OD值)×标准浓度(2mmol/L)÷样品蛋白含量(gprot/ml)

表15脑匀浆中ATP酶测定操作顺序表

混匀，37℃水浴30分钟，冷却至室温，在660nm，1cm光径蒸馏水调零比色

注：A管为对照管；B管为Na⁺K⁺-ATP酶管；C管为Mg⁺⁺-ATP酶管；D管为Ca⁺⁺-ATP酶管；

组织中ATP活力(μmolPi/mgprot/hour)＝(测定管OD值-对照管OD值)÷标准管OD值×标准管浓度(0.5μmol/ml)×反应体系中样品稀释倍数(2.5)×6÷样本蛋白含量(mgprot/ml)

2.3统计学处理方法

数据分析用SPSS 13.0for windows医用统计包进行数据资料的统计学处理，计量资料组间比较用方差分析，用平均数±标准差表示，等级资料采用Ridit检验。

2.4实验结果

表16毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比对大鼠TIA模型行为学评分的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比较，模型组大鼠行为学评分显著升高(P＜0.01)；与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组、尼莫地平组、养血清脑颗粒组能显著降低TIA模型大鼠行为学评分(P＜0.01)，表明毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对大鼠TIA模型的行为学有明显的改善作用，且以10∶4组，10∶5组，10∶6组最显著。

表17毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对大鼠TIA模型血浆LPA含量的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比较，模型组大鼠血浆LPA含量显著升高(P＜0.01)；与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组能显著降低血浆LPA水平(P＜0.01)；尼莫地平组、养血清脑颗粒组可显著降低血浆LPA水平(P＜0.01)。表明毛冬青总黄酮对TIA模型大鼠的血浆LPA具有较好的清除作用，且以10∶6组最明显。

表18毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比对大鼠TIA模型脑组织LD、LDH水平的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比较，模型组脑组织LD含量显著升高(P＜0.01)，LDH含量显著降低(P＜0.01)，说明造TIA模型成功；与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组能显著降低LD水平(P＜0.01)、升高LDH水平(P＜0.01)；尼莫地平组、养血清脑颗粒组可显著降低LD水平(P＜0.01)、升高LDH水平(P＜0.01)；表明毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对TIA模型大鼠脑组织LD水平、LDH水平有明显的调节作用，且以10∶6最显著。

表19毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比对大鼠TIA模型脑组织Na⁺-K⁺-ATP酶活性的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比较，模型组大鼠脑组织中的Na⁺-K⁺-ATP酶水平显著降低(P＜0.01)，说明造大鼠TIA模型成功；与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组、尼莫地平组、养血清脑颗粒组能显著升高Na⁺-K⁺-ATP酶水平(P＜0.01)。表明毛冬青总黄酮总皂苷不同配比组对大鼠TIA模型脑组织中Na⁺-K⁺-ATP酶水平有较好的改善作用，其以10∶5最显著。

表20毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比对大鼠TIA模型脑组织Ca⁺⁺-ATP酶、Mg⁺⁺-ATP酶活性的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比较，模型组大鼠脑组织中的Ca⁺⁺-ATP酶、Mg⁺⁺-ATP酶水平显著降低(P＜0.01)；与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组、尼莫地平组、养血清脑颗粒组能显著升高Ca⁺⁺-ATP酶、Mg⁺⁺-ATP酶水平(P＜0.01)；表明毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组对大鼠TIA模型脑组织中Ca⁺⁺-ATP酶、Mg⁺⁺-ATP酶水平的变化有改善作用，且以10∶6组最显著。

空白组神经细胞核大，核内染色质蓬松，核仁清晰，海马区内的毛细血管和内皮细胞均正常；模型组神经细胞核水肿体积增大呈球形，核内染色质淡然而透明，核仁清晰，海马区内的毛细血管增粗和内皮细胞也发生水肿和淡然；毛冬青总黄酮与总皂苷10∶0组，10∶2组，10∶3组，10∶4组，10∶5组动物大脑皮层大面积的的神经细胞和胶质细胞出现水肿，细胞核模糊不清，胶质细胞出现水肿或消失现象。10∶6组，10∶8组，10∶10组神经细胞明显恢复核大，核内染色质蓬松，核仁清晰，海马区内的毛细血管和内皮细胞基本恢复正常；尼莫地平组、养血清脑颗粒组缩小，核内染色质溶解而透明，核仁清晰，海马区内的毛细血管有所扩张，内皮细胞恢复正常。

表21毛冬青总黄酮对大鼠TIA模型的影响海马区病理变化的影响

根据实验各组的海马区神经细胞不同的病理改变，将其分为四级：“-”海马区神经细胞正常，海马区内的毛细血管和内皮细胞均正常；“+”神经细胞核水肿体积增大、核内染色质淡然而透明，核仁清晰，毛细血管减少和内皮细胞水肿；“++”神经细胞体积增大，核内染色质溶解而透明，核仁消失，毛细血管增粗；“+++”神经细胞核水肿体积增大呈球形，核内染色质淡然而透明，核仁消失，毛细血管增粗和内皮细胞也发生水肿和淡然。

经Ridit检验，空白组与模型组有显著的统计学意义(P＜0.01)，说明造TIA模型成功。与模型组比较，毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组、尼莫地平组和养血清脑颗粒组均有显著的统计学意义(P＜0.01)。实验三毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5组、10∶6组、10∶7组对小鼠TIA模型的影响

1.实验材料

1.1药物试剂

毛冬青总黄酮、总皂苷，有河南中医学院实验室提供，方法为，取毛冬青800g药材加10倍量70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，回收药液。药渣再加8倍量70％的乙醇，浸泡30min，提取1h，合并第一次和第二次的药液；将两次的药液PH调到4-5后上大孔树脂；用35％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总黄酮，在用70％的乙醇冲树脂柱得毛冬青总皂苷。养血清脑颗粒，由天津天士力制药股份有限公司生产；尼莫地平，山东新华制药股份有限公司生产；氯化钠注射液，由郑州永和制药有限公司生产；水合氯醛，由上海山浦化工有限公司生产；甲醛溶液，天津市科密欧化学试剂有限公司；过氧化叔丁醇(tert-butylhydroperoxide，t-BHP)，由国药集团化学试剂有限公司生产；考马斯亮兰检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；SOD(Superoxide dismutase)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；MDA(Malonicdialdehyde)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；LD(Lactic acid)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产；LDH(Lactate dehydrogenase)检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产。

1.2实验仪器

UV-2000紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司生产；TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产；电子分析天平，奥豪斯(上海)公司生产；DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器厂生产；DY89-1型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技有限公司生产；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司生产。

1.3实验动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体重30～40g，河北省实验动物中心提供。

2.实验方法与结果

2.1造模与给药

取体重为30～40g的昆明种小鼠208只，雌雄各半，随即均匀分为13组，即：空白对照组，模型组，尼莫地平组，养血清脑颗粒组，极限等比增减设计毛冬青总黄酮与总皂苷不同配比组(总黄酮∶总皂苷10∶5组，10∶6组，10∶7组)，每组16只。除空白组外，其余12组造小鼠TIA模型。造模型9组分别灌服毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5大、中、小剂量(大剂量药剂量0.3g/kg，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按10∶5，临用前用生理盐水配成浓度30mg/ml的药液，给药体积0.1ml/10g；中剂量给药剂量0.15g/kg，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按10∶5，临用前用生理盐水配成浓度15mg/ml的药液，给药体积0.1ml/10g；小剂量给药剂量0.075g/kg，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按10∶5，临用前用生理盐水配成浓度7.5mg/ml的药液，给药体积0.1ml/10g)、毛冬青总黄酮与总皂苷10∶6大、中、小剂量(大剂量药剂量0.3g/kg，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按10∶6，临用前用生理盐水配成浓度30mg/ml的药液，给药体积0.1ml/10g；中剂量给药剂量0.15g/kg，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按10∶6，临用前用生理盐水配成浓度15mg/ml的药液，给药体积0.1ml/10g；小剂量给药剂量0.075g/kg，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按10∶6，临用前用生理盐水配成浓度7.5mg/ml的药液，给药体积0.1ml/10g)、毛冬青总黄酮与总皂苷10∶7大、中、小剂量(大剂量药剂量0.3g/kg，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按10∶7，临用前用生理盐水配成浓度30mg/ml的药液，给药体积0.1ml/10g；中剂量给药剂量0.15g/kg，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按10∶7，临用前用生理盐水配成浓度15mg/ml的药液，给药体积0.1ml/10g；小剂量给药剂量0.075g/kg，毛冬青总黄酮与总皂苷之间按10∶7，临用前用生理盐水配成浓度7.5mg/ml的药液，给药体积0.1ml/10g)、养血清脑颗粒组(阳性对照药，给药剂量为2g/kg，临用前用生理盐水配成0.2g/ml，给药体积0.1ml/10g)、尼莫地平组(阳性对照药，给药剂量为0.4g/kg，临用前用生理盐水配成0.002g/ml，给药体积0.1ml/10g)、模型组(灌服同体积生理盐水)。空白对照组灌服同体积生理盐水。

造模方法：小鼠尾静脉注射0.11mol/L过氧化叔丁醇(7.5ml/kg)10min后，置于0.45L的广口瓶中，密封，使小鼠缺氧15min后取出，进行行为学评分。

行为学评分标准根据伍氏标准修改：①卒中指数：毛发脏乱1；四肢颤抖1；运动下降或迟钝或过强1；耳触觉减退1；上睑下垂1；后肢外展呈“八”字3；②神经系统症状：自发性探究1；刺激时走动或爬行1；刺激时不能动2；③步态：正常0；肌张力高1；爬行2；无步态3；④进食：有0；无1；⑤饮水：有0；无1；⑥对痛刺激的反应：移动/走动0；头/躯干运动过强或反应1；肢体回缩或无反应2。

小鼠连续灌胃给药3天后进行第1次TIA诱发。连续给药3天为1周期，每周期进行一次TIA诱发及行为学评分，共3个周期，结果见表22。于第3次诱发TIA及评分后第2天给药1h后，立即在冰盘中分离脑，把脑从矢状线分开成对称的脑，一半迅速放入倒有10％福尔马林溶液的瓶子中浸泡固定，做海马区组织病理切片；另一半放在滤纸上洗干净上面的血迹，然后用分析天平称量其重量，根据此重量计算应加入的冰冷的生理盐水的量，以脑组织(g)∶生理盐水(ml)＝1∶9的比例在低温下用玻璃匀浆机进行匀浆。4℃，3000r/min离心10min。取上清液于-20℃以下低温保存。制成10％的脑匀浆按测试盒说明操作，分别测定MDA、LD含量及LDH、SOD酶活力，结果见表23、表24、表25。

试剂盒测定方法：MDA、LD含量及LDH、SOD酶活力试剂盒测定方法同上。

统计学处理方法：数据分析用SPSS 13.0for windows医用统计包进行数据资料的统计学处理，计量资料组间比较用方差分析，用平均数±标准差表示，等级资料采用Ridit检验。

2.2实验结果

表22毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5大、中、小剂量组，10∶6大、中、小剂量组，10∶7大、中、小剂量组组对小鼠TIA模型行为学评分的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5大、中剂量组，10∶6大、中剂量组，10∶7大、中剂量组，尼莫地平组、养血清脑颗粒组均可使小鼠行为学评分显著降低(P＜0.01)；10∶5和10∶7小剂量组可使小鼠行为学评分明显降低(P＜0.05)。表明毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5大、中、小剂量组，10∶6大、中剂量组，10∶7大、中、小剂量对过氧化物诱导的小鼠TIA模型的行为学评分有明显的降低作用。

表23毛冬青毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5大、中、小剂量组，10∶6大、中、小剂量组，10∶7大、中、小剂量组组对小鼠TIA模型脑组织SOD活性的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比较，模型组小鼠脑组织中的SOD含量显著降低(P＜0.01)；与模型组比，毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5大、中剂量组，10∶6大、中、小剂量组，10∶7大、中剂量组能显著升高SOD水平(P＜0.01)；尼莫地平组、养血清脑颗粒组可显著升高SOD水平(P＜0.01)；10∶5小剂量组可明显升高SOD水平(P＜0.05)。表明毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5大、中剂、小量组，10∶6大、中、小剂量组，10∶7大、中剂量对小鼠TIA模型脑组织中SOD含量变化有改善作用。

表24毛冬青毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5大、中、小剂量组，10∶6大、中、小剂量组，10∶7大、中、小剂量组组对小鼠TIA模型脑组织MDA含量的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.0

由上表可看出，与空白组比，模型组小鼠脑组织的丙二醛含量显著的升高(P＜0.01)，表明造模成功；与模型组比，10∶5大、中、剂量组，10∶6大、中、剂量组，10∶7大、中、剂量、尼莫地平组、养血清脑颗粒组丙二醛含量显著降低(P＜0.01)；10∶5小剂量组，丙二醛含量明显降低(P＜0.05)。

表25毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5大、中、小剂量组，10∶6大、中、小剂量组，10∶7大、中、小剂量组对小鼠TIA模型脑组织LD、LDH水平的影响

*：表示与模型组相比P＜0.05；**：表示与模型组相比P＜0.01

由上表可看出，与空白组比较，模型组脑组织LD含量显著升高(P＜0.01)，LDH含量显著降低(P＜0.01)，说明造TIA模型成功；与模型组比，10∶5大、中、剂量组，10∶6大、中、小剂量组，10∶7大、中、小剂量、尼莫地平组、养血清脑颗粒组能显著降低LD水平(P＜0.01)、升高LDH水平(P＜0.01)；10∶5小剂量组可明显降低LD水平(P＜0.05)、升高LDH水平(P＜0.05)；表明毛冬青总黄酮与总皂苷10∶5大、中、小剂量组，10∶6大、中、小剂量组，10∶7大、中、小剂量配比组对TIA模型大鼠脑组织LD水平、LDH水平有明显的调节作用，且以10∶6最显著。