食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒

摘要

本发明涉及食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒。具体地，本发明公开了一种检测脊髓灰质炎病毒的方法，在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对和脊髓灰质炎病毒特异性探针。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明可灵敏、简便地检测和鉴定脊髓灰质炎病毒。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体的说，本发明涉及贝类、蔬果和水等食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

近年来，由于食用受病毒污染食品而引起的疾病爆发在全世界范围内多见报道，其中源于肠道病毒而引发的疾病占到了67％以上。

作为一种典型的致病性肠道病毒，脊髓灰质炎病毒野生株虽然已在全世界基本消灭，但由于脊髓灰质炎病毒疫苗的广泛使用，其突变株在近几年引发了多起病毒爆发事件。据世界卫生组织统计，2008年疫苗衍生脊髓灰质炎病毒感染病例升至80例，野生型病毒感染病例近1800例。为了加强脊髓灰质炎病毒的监控，防止“病从口入”至关重要。

脊髓灰质炎病毒可在污水及食品中存活，而贝类是主要的病毒携带体。因此，对贝类食品中脊髓灰质炎病毒的检测和监测至关重要。

脊髓灰质炎病毒(poliovirus，PV)是一种属于小RNA病毒科的肠道病毒，可引起小儿麻痹症。近几年很多国家在贝类及水体等食品中发现了脊髓灰质炎病毒野生型或疫苗突变株的存在。为了防止脊髓灰质炎病毒通过粪-口途径传播，加强即食性食品中脊髓灰质炎病毒的监控至关重要。由于脊髓灰质炎病毒主要在人类排泄物和污水中存活，即食性水果和蔬菜等在施肥和灌溉中可能受含脊髓灰质炎病毒粪便和水的污染。

然而，目前在食品中脊髓灰质炎检测存在诸多难点。与人类排泄物相比，食品中病毒含量低得多，干扰因子和抑制因子更加复杂，对检测方法带来了巨大挑战，因此需要针对性和灵敏度更高的检测方法。近十多年来，各国研究者建立的如巢式RT-PCR、普通RT-PCR、ELISA等技术多应用于粪便或污水等样品的检验，而对食品基质中脊髓灰质炎病毒检测的报道较少。目前国内外还没有食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的报道。

目前我国对进出口食品只进行常规的细菌检测，还没有相应方法对进出口食品脊髓灰质炎病毒进行检测。也就是说，进出口食品脊髓灰质炎病毒检测仍处于空白状态，这严重地制约着我国食品进出口贸易的发展，威胁着人民的身体健康。然而，目前尚没有快速简便地检测和鉴定脊髓灰质炎病毒的检测技术。

综上所述，鉴于目前尚没有特异性好、灵敏度高的食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法。因此，本领域迫切需要开发特异性好、灵敏度高的食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、准确、简便的贝类、蔬果和水等食品中脊髓灰质炎病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。

本发明的另一目的在于提供贝类、蔬果和水等食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供贝类、蔬果和水等食品中脊髓灰质炎病毒检测相关引物和探针。

在本发明的第一方面，提供了一种聚合酶链式反应方法，它包括步骤：在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对和脊髓灰质炎病毒特异性探针，并且所述引物扩增出的扩增产物具有脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒基因组2A区的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对选自下组：

I型脊髓灰质炎病毒：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；和/或

II型脊髓灰质炎病毒：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；和/或

III型脊髓灰质炎病毒：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

在另一优选例中，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针是Taqman-MGB探针或Taqman探针。

在另一优选例中，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针具有选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：7、8和/或9。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在聚合酶链式反应过程中或之后，检测脊髓灰质炎病毒特异性探针发出的荧光信号。

在另一优选例中，所述的反应体系中含有来自食品的待检测的核酸样品。

在本发明的第二方面，提供了一种检测试剂盒，它含有以下试剂：

(a)扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对，并且所述引物扩增出的扩增产物具有脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒基因组2A区；

(b)脊髓灰质炎病毒特异性探针。

在另一优选例中，所述的扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对选自下组：

I型脊髓灰质炎病毒：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；和/或

II型脊髓灰质炎病毒：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；和/或

III型脊髓灰质炎病毒：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

在另一优选例中，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针是Taqman-MGB探针或Taqman探针。

在另一优选例中，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针具有选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：7、8和/或9。

在另一优选例中，提供了一种用于检测食品中脊髓灰质炎病毒的检测试剂盒，其含有：

(a)针对脊髓灰质炎病毒三种血清型(I、II、III型)设计的三对POL特异性引物，所述的POL特异性引物对特异性地扩增脊髓灰质炎病毒三种血清型基因组2A区的一段序列；

(b)Taqman-MGB探针，所述的Taqman-MGB探针与对应的POL特异性引物扩增产物特异性结合；

(c)任选的标准参照物；

在另一优选例中，所述的标准参照物是脊髓灰质炎病毒cDNA或含脊髓灰质炎病毒扩增目的片段的质粒DNA；

在另一优选例中，所述的POL特异性引物选自下组：

在另一优选例中，所述的Taqman-MGB探针选自下组：

在本发明的第三方面，提供了本发明第二方面所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于检测在食品中是否存在脊髓灰质炎病毒。

在本发明的第四方面，提供了一系列寡核苷酸片段，它们具有选自SEQ IDNO.1-9的核苷酸序列。

在本发明的第五方面，提供了本发明上述特异性扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对和脊髓灰质炎病毒特异性探针的用途，它们被用于制备用于检测在食品中是否存在脊髓灰质炎病毒的试剂盒。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了基于Taqman-MGB探针的实时荧光RT-PCR扩增曲线和标准曲线。其中各图分别为：(A)pMD18-PV1；(B)pMD18-PV2；(C)pMD18-PV3；(D)三个参照分子同时扩增。曲线从左到右分别对应模板量为2.0E+6，2.0E+5，2.0E+4，2.0E+3，2.0E+2和2.0E+1拷贝。其中显示了Ct值与模板拷贝数之间的存在优良的线性关系。

图2显示了I型脊髓灰质炎病毒单独检测与同时检测体系比较。

图3显示了II型脊髓灰质炎病毒单独检测与同时检测体系比较。

图4显示了II型脊髓灰质炎病毒单独检测与同时检测体系比较。

图5显示了三种脊髓灰质炎病毒检测的标准参照物，其中包括：(A)参照分子pMD18-PV1外源插入片段序列(简称为PV1)；(B)参照分子pMD18-PV2外源插入片段序列(简称为PV2)；(C)参照分子pMD18-PV3外源插入片段序列(简称为PV3)。箭头示引物Polio-F/R位置。

具体实施方式

本发明人经过对脊髓灰质炎病毒的各种基因序列的广泛而深入的研究，认为脊髓灰质炎病毒的脊髓灰质炎病毒基因组2A区序列特别适合用于检测和鉴定脊髓灰质炎病毒。针对该区域不仅可以设计出特异性扩增脊髓灰质炎病毒的引物，还可设计出脊髓灰质炎病毒特异性探针。这样，在一次PCR反应中，通过检测探针的荧光信号，就可快速简便地鉴定脊髓灰质炎病毒。

具体地，本发明人针对三种血清型PVs设计了三套引物和探针，每套引物和探针均高度特异于对应血清型病毒检测。以参照分子为外标准品的检测下限分析表明建立的单独和同时检测体系可检测到的最低模板量为2拷贝，较前人建立的脊髓灰质炎病毒RT-PCR检测方法灵敏度提高至少一个数量级。而本发明的检测脊髓灰质炎病毒的体系灵敏度则显著提高到可检测低至54个拷贝的脊髓灰质炎病毒。

引物

如本文所用，术语“脊髓灰质炎病毒特异性探针”指这样的引物(对)，它扩增出的扩增产物具有的脊髓灰质炎病毒基因组2A区的核苷酸序列(例如SEQID NO：12-14所示核苷酸序列)。

在引物设计上，为了能够更好地满足目前对野生型和疫苗型脊髓灰质炎病毒检测的需要。本发明人选择了变异度更小、两者序列同源性更高的2A区作为检测靶序列。同时，本发明人对已公布的野生型和疫苗型脊髓灰质炎病毒cDNA序列进行比对和分析，选择各血清型间相对保守的一段序列设计引物和探针。

一种优选的、适用于I型脊髓灰质炎病毒的引物对具有SEQ ID NO：1和2所示的序列。

一种优选的、适用于II型脊髓灰质炎病毒的引物对具有SEQ ID NO：3和4所示的序列。

一种优选的、适用于III型脊髓灰质炎病毒的引物对具有SEQ ID NO：5和6所示的序列。

如本文所用，术语“POL特异性引物”，指长度为22±4Nt的寡核苷酸链，其与三种血清型(I、II、III型)脊髓灰质炎病毒其中一种血清型病毒RNA逆转录后的cDNA序列完全互补或者相同。

探针

如本文所用，术语“脊髓灰质炎病毒特异性探针”指能够结合于脊髓灰质炎病毒的扩增产物，但不结合于其他物种(如猪、牛、羊或其他病毒等)的扩增产物的探针。更佳地，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针特异性结合于脊髓灰质炎病毒的、如SEQ ID NO：12-14所示的脊髓灰质炎病毒基因组2A区的核苷酸序列。

一种优选的、适用于I型脊髓灰质炎病毒的探针具有SEQ ID NO：7所示的序列。

一种优选的、适用于II型脊髓灰质炎病毒的探针具有SEQ ID NO：8所示的序列。

一种优选的、适用于III型脊髓灰质炎病毒的探针具有SEQ ID NO：9所示的序列。

可用于本发明的探针没有特别限制，可以包括(但并不限于)：和Taqman探针和Taqman-MGB探针，优选Taqman-MGB探针，因为Taqman-MGB探针由于具有特异性好、灵敏度高、稳定性好、优化步骤简单、结果精确、分辨率高等优点。同时，Taqman-MGB探针设计的长度较普通Taqman探针更短，可小于20bp。另外，Taqman-MGB探针可提高配对与非配对模板间的Tm值差异，当非配对模板与配对模板间有一个碱基的差异时，该探针即不与其结合而不能进行PCR扩增，从而大大提高检测的特异性。

如本文所用，术语“特异性Taqman-MGB探针”，指长度为18±4Nt的寡核苷酸链，其5’端标记着FAM荧光激发基团，3’端标记着MGB荧光基团；其与三种血清型脊髓灰质炎病毒RNA逆转录后的cDNA序列完全互补或者相同；其与POL特异性引物结合组成一套实时荧光PCR反应体系。

应理解，特异性Taqman-MGB探针是与POL特异性引物匹配使用的。例如，当对I型脊髓灰质炎病毒进行检测时，选用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2作为引物，SEQ ID NO：7作为探针实施PCR扩增。

Taqman-MGB探针能分辨出模板与探针结合区一个碱基的差别，检测特异性高，且MGB探针长度在13-19个碱基，对于突变度较高的病毒株间寻找适宜的检测区域十分有利。使用本发明的MGB探针较普通Taqman探针可以实现更高的检测骨髓灰质炎病毒的灵敏度。

本发明的MGB探针有以下优点：

(1)缩短探针的长度，提高Tm值，尤其对AT含量高的序列的MGB探针的设计有很大的帮助。

(2)提高配对与非配对模板间的Tm值差异，特别适合GC含量偏低，SNP分析和microRNA检测分析；

(3)MGB为不发光的荧光基团，与TAMRA踤灭基团相比，有本底更低、信噪比更高、结果更精确、分辨率更高的优点。

参照物

本发明还提供了用于食品中脊髓灰质炎病毒检测的标准参照物。所述的标准参照物是脊髓灰质炎病毒cDNA或含脊髓灰质炎病毒扩增目的片段的质粒DNA。优选的标准参照物是脊髓灰质炎病毒基因组2A区的DNA或其扩增目的片段的质粒DNA。

例如，参照物可以是分别含有三种血清型脊髓灰质炎病毒RNA逆转录后的cDNA溶液。这些标准参照物可用本领域常规方法制备。

检测方法

本发明还提供了用于同时检测三种血清型脊髓灰质炎病毒的方法。

例如，将SEQ ID NO：1-6三对POL特异性引物和SEQ ID NO：7-9三条特异性Taqman-MGB探针分别按照等浓度混合作为PCR扩增反应的引物和探针。

实时荧光PCR是密闭扩增检测方法，扩增体系加样完毕后，即可进行扩增和检测，不需扩增后再进行分析；不仅减少环境污染的可能性，还由于有引物对与探针共同杂交，比普通PCR特异性更高。

TaqMan聚合酶链反应技术利用Taq酶5′→3′外切酶活性，在延伸的过程中实现对杂交探针的切断，消除探针3′端荧光基团对5′端标记报告荧光基团信号的淬灭作用。荧光信号的强弱与PCR产物的数量呈正比，检测系统通过检测荧光可推测PCR产物的数量。

本发明方法中优选的扩增区域为脊髓灰质炎病毒的、如SEQ ID NO：12-14所示的脊髓灰质炎病毒基因组2A区的核苷酸序列，该区域是脊髓灰质炎病毒特有的，可用于检测脊髓灰质炎病毒。

根据本发明的教导，本领域技术人员将能够设计和合成引物以及脊髓灰质炎病毒特异性探针，并用于荧光实时PCR定性定量检测技术。

在本发明中，除了检测所针对的靶序列以及相应采用的引物(对)和探针等与现有技术不同之外，诸如从样品总抽提DNA、PCR扩增和荧光检测等步骤的条件可与现有技术相同，本领域技术人员完全可以用常规的条件进行上述各种步骤。当然，也可采用本申请实施例中所给出的优选条件。

例如，可用于本发明的病毒富集、RNA提取技术和方法没有特别的限制，可以是本领域应用较多、稳定性好、可靠性高的各种提取技术。一种优选方法是PEG8000富集和Trizol RNA提取法。

在本发明的优选实施例中，电泳结果表明，扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对能对脊髓灰质炎病毒的核酸进行扩增。实时荧光检测结果表明，仅在含脊髓灰质炎病毒的标本表现阳性，达到了预期的效果。这表明，通过合理选择出的脊髓灰质炎病毒特异性探针是极为有效和特异的。

使用定量PCR仪进行实时荧光检测时，根据荧光标记物(FAM、TET)的不同，可在530nm或640nm等波长检测。

在一优选例中，本发明通过设计的三对引物和三条探针，采用实时荧光PCR检测技术，检测和鉴定食品中所有三种血清型脊髓灰质炎病毒。一方面可通过使用配对的引物和探针分别检测I、II和III型脊髓灰质炎病毒，另一方面也可以通过将三对引物和三条探针混合使用同时检测I、II和III型脊髓灰质炎病毒。在反应设计的标准参照物可发出明显的可检测信号及空白对照无可检测信号情况下，根据样品实施实时荧光PCR扩增是否有明显的可检测信号判断样品是否受脊髓灰质炎病毒污染。

在另一优选例中，一种贝类食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光PCR检测方法，可具体包括如下步骤：

①.食品中脊髓灰质炎病毒RNA的提取；

②.脊髓灰质炎病毒RNA逆转录为cDNA；

③.以cDNA为模板，用(a)所述POL特异性引物和(b)所述Taqman-MGB探针分别进行PCR扩增，并测定产生的可检测信号。其中，所述的POL特异性引物对特异性地扩增脊髓灰质炎病毒三种血清型基因组2A区的一段序列，所述的Taqman-MGB探针与对应的POL特异性引物扩增产物特异性结合；

④.根据收集的可检测信号分析测定数据，从而确定和检测出贝类食品样品是否受脊髓灰质炎病毒污染。

在另一优选例中，步骤③中，测定可检测信号是在实时荧光PCR扩增反应中，探针的报告基团FAM所产生的荧光信号；在步骤③中还包括将标准参照物和双蒸水作为模板，用(a)所述POL特异性引物和(b)所述Taqman-MGB探针分别进行的PCR扩增；并且在步骤④中包括对标准参照物和双蒸水的扩增测定和收集可检测信号，并进行数据分析。其中，所述的标准参照物是脊髓灰质炎病毒cDNA或含脊髓灰质炎病毒扩增目的片段的质粒DNA。

本发明的主要优点在于：

(1)可简便、快速地检测和鉴定食品中的脊髓灰质炎病毒。

(2)基于脊髓灰质炎病毒基因组2A区的引物对可有效地特异性扩增脊髓灰质炎病毒的核酸序列，而脊髓灰质炎病毒特异性探针则可更特异性地区分脊髓灰质炎病毒和其他病毒。

(3)检测结果线性好，可用于定量分析。

(4)检测方法灵敏度提高至少一个数量级。可检测低至54个拷贝的脊髓灰质炎病毒。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1材料与方法

1.1材料与试剂

血清I、II、III型脊髓灰质炎病毒灭活疫苗悬浮液获自美国加州大学，A9、A16、B2、B3和B5型灭活柯萨奇病毒和含GII型诺如病毒粪便样品购自中国疾病预防控制中心病毒预防控制研究所。

PBS缓冲液：0.14mol/L NaCl，0.003mol/L KCl，0.00175mol/L KH₂PO₄，0.01mol/L Na₂HPO₄，pH 7.5，上海生工生物工程有限公司；甘氨酸缓冲液：0.1mol/L甘氨酸，0.3mol/L NaCl，pH 9.5；PEG 8000溶液：16％PEG 8000，0.525mol/L NaCl；TIANamp病毒RNA提取试剂盒：天根生物科技有限公司，Cat.No.SD101；Prime Script^TM反转录试剂盒：宝生物工程有限公司，Cat.No.DRR037A；Premix Ex Taq^TM实时荧光扩增试剂盒：宝生物工程有限公司，Cat.No.DRR039A。

1.2引物与探针

对GenBank数据库中已公布的脊髓灰质炎病毒cDNA序列进行比对和分析，寻找各血清型间相对保守，与其它肠道病毒株同源性较低的区域，选择脊髓灰质炎病毒基因组2A区设计引物和探针。由于简并引物对实时荧光PCR反应效率影响较大，对I、II和III型脊髓灰质炎病毒分别设计了一套特异性引物和探针FP1/RP1/Probe1、FP2/RP2/Probe2和FP3/RP3/Probe3(表1)，三对引物扩增区域在三种血清型中所处位置相近。进行Blast比对后，设计的引物和探针仅与脊髓灰质炎病毒相关序列匹配。

表1三种血清型脊髓灰质炎病毒实时荧光RT-PCR检测引物和探针

注：M：A/C；Y：C/T；S：G/C；B：C/G/T。

1.3病毒灭活疫苗、粪便样品中病毒RNA提取

脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、含诺如病毒粪便、灭活柯萨奇病毒样品使用TIANamp病毒RNA提取试剂盒进行RNA提取和纯化。

1.4脊髓灰质炎病毒灭活疫苗悬浮液中病毒拷贝数测定

分别取140μlI、II、III型脊髓灰质炎病毒灭活疫苗悬浮液(每种血清型取10^-4、10^-5和10^-6三个稀释液)进行病毒RNA提取，采用本发明建立的实时荧光检测体系进行扩增，重复三次，通过建立的标准曲线计算样品病毒拷贝数。经计算I、II、III型脊髓灰质炎病毒悬浮液浓度分别为2.52×10⁶、5.36×10⁶和6.55×10⁶拷贝/μl。

1.5食品样品中病毒的人工接种

1.5.1贝类和蔬果样品

称取5g牡蛎肠腺组织，将140μl浓度为2700、270和54拷贝I型脊髓灰质炎病毒悬浮液分别注入牡蛎肠腺组织中，匀浆后转移至50ml离心管中。

称取15g新鲜蓝莓或生菜样品，将140μl浓度分别为2700、270和54拷贝I型脊髓灰质炎病毒悬浮液均匀点种于蔬果外表面，室温放置30min，使病毒悬浮液完全被蔬果表面吸附并干燥。

分别取一份不含脊髓灰质炎病毒污染的贝类或蔬果样品作为阴性对照。II型、III型脊髓灰质炎病毒的接种方法同上。I、II、III型病毒同时添加的样品中每种血清型病毒分别占总量的1/3，接种方法同上。

1.5.2水样

分别取140μl浓度为2700、270和54拷贝I型脊髓灰质炎病毒悬浮液加入100ml自来水中，充分混匀，室温放置60min。同时制备一份不含脊髓灰质炎病毒的100ml水样作为阴性对照。II型和III型脊髓灰质炎病毒接种方法同上。I、II、III型病毒同时添加的水样中每种血清型病毒分别占总量的1/3，接种方法同上。

1.6食品中脊髓灰质炎病毒富集和RNA提取与纯化

1.6.1贝类样品

采用Kingsley等人的方法进行(Kingsley DH.Detection of hepatitisA virus and Norwalk-like virus in imported clams associated withfood-brone illness[J].Appl Environ Microbiol，2002，68(8)：3914-3918.)。

1.6.2蔬果样品

将样品放入50ml离心管中，加入35ml甘氨酸缓冲液，37℃振荡30min。4℃10000×g离心30min。转移上清至一新离心管，加入等体积PEG8000溶液，4℃放置过夜。4℃12000×g离心30min，弃上清。向沉淀中加入140μlPBS缓冲液使沉淀悬浮均匀。采用TIANamp病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。

1.6.3水样

将100ml水样分次通过直径为47mm，孔径为0.45μm的醋酸/硝酸混合纤维素滤膜进行过滤(密理博贸易有限公司，Cat.No.R7SN20186)；取出滤膜，平整放于聚乙烯薄膜袋中，加入1131.2μl Buffer RL-carrier RNA混合液(TIANamp病毒RNA提取试剂盒)，剧烈振荡30s；室温浸泡滤膜20min，将液体完全转移到15ml离心管中。采用TIANamp病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。

1.7反转录反应

反应体系为10μl，包括1×Buffer，0.5μl RT Enzyme Mix，0.5μlOligo(dT)(0.125μmol/L)，5μl RNA溶液。反应条件为：37℃，15min；85℃，5s。

1.8实时荧光RT-PCR反应和标准曲线制备

反应体系为20μl，包括1×Premix Ex Taq，上下游引物各0.2μmol/L，探针0.2μmol/L，1×ROX Reference Dye，2μl病毒cDNA或参照分子DNA溶液。使用ABI PRISM 7300序列分析系统(ABI公司)进行实时荧光扩增，条件为：95℃，10s；95℃，5s，60℃，31s，45个循环。

为了解决脊髓灰质炎病毒阳性样品获取困难的问题，本发明分别构建了适于三种血清型脊髓灰质炎病毒检测的参照分子。在病毒基因组2A区设计引物Polio-F/-R用于脊髓灰质炎病毒检测参照分子的构建，序列见下表。分别以I型、II型、III型脊髓灰质炎病毒cDNA为模板进行扩增，目的片段大小分别为564bp、561bp和561bp，以上片段回收纯化后，通过T-A连接克隆到pMD-18T载体(宝生物工程(大连)有限公司)中，经过酶切和测序鉴定确定阳性克隆。得到分别含有I型、II型、III型脊髓灰质炎病毒2A区特异性片段的参照分子pMD18-PV1(3258bp)、pMD18-PV2(3255bp)和pMD18-PV3(3255bp)。三个参照分子外源插入片段序列见SEQ ID NO：12-14和图5。

注：Y：T/C；M：A/C；S：C/G；B：C/G/T。

为了建立标准曲线，将构建的三种参照分子(待发表)DNA分别稀释至10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10拷贝/μl。进一步稀释至5、2和1拷贝/μl用于检测下限分析。对三种血清型病毒同时检测的标准曲线制备，则采用含有等量三种参照分子的稀释液，进行十倍梯度稀释，将三对引物和探针混合后进行扩增。反应均重复三次。在荧光扩增曲线对数期选择域值，获得Ct值。以Ct值为横坐标，DNA拷贝数对数值为纵坐标作图即得到标准曲线。PCR反应效率通过以下公式计算：E＝10^-1/slope-1。对人工接种的食品样品中脊髓灰质炎病毒的检测，则通过上述获得的标准曲线和方程计算拷贝数，并对三次重复间的拷贝数相对标准偏差(RSD)进行计算。

2结果

2.1实时荧光RT-PCR检测体系特异性测试

为了鉴定建立的检测体系的特异性，以I、II、III型脊髓灰质炎病毒，B2、B3、B5、A9和A16型柯萨奇病毒及GII型诺如病毒cDNA为模板，分别采用设计的三套引物和探针进行RT-PCR扩增。采用引物和探针FP1/RP1/Probe1进行扩增时，仅有I型脊髓灰质炎病毒cDNA模板产生明显的扩增曲线，以其它病毒或血清型cDNA(包括诺如病毒、柯萨奇病毒、II、III型脊髓灰质炎病毒)为模板时均未出现荧光信号增幅(表2)。同样地，利用引物和探针FP2/RP2/Probe2和FP3/RP3/Probe3进行扩增时，只有分别以II型和III型脊髓灰质炎病毒cDNA为模板才可见显著的荧光增幅。因此，针对I、II和III型脊髓灰质炎病毒建立的Taqman-MGB探针实时荧光检测体系分别高度特异于对应血清型脊髓灰质炎病毒检测。

表2实时荧光RT-PCR检测体系特异性测试

注：“+”表示检测结果为阳性；“-”表示检测结果为阴性。

^a脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒cDNA样品使用引物EV1/EV2(Andreoletti L，Hober D，Belaich S，et al.Rapid detection of enterovirus in clinicalspecimens using PCR and microwell capture hybridization assay.[J].JVirol Methods 1996，62(1)：1-10.)进行检测，可扩增到435bp目的片段。

^b诺如病毒cDNA样品使用引物GII-SKF/SKR(Kojima S，Kageyama T，Fukushi S，et al.Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like virus[J].J Virol Methods，2002，100：107-114.)进行检测，可扩增到344bp目的片段。

2.2三种血清型脊髓灰质炎病毒的单独检测

2.2.1标准曲线制备

以6个浓度的参照分子pMD18-PV1、pMD18-PV2和pMD18-PV3DNA为外标准品构建标准曲线。结果显示，针对I、II和III型脊髓灰质炎病毒检测建立的标准曲线PCR反应效率分别为1.04，1.01和1.03，均接近1，说明扩增反应基本未受抑制因子影响。Ct值与模板浓度对数的相关系数(R²)均大于0.999。对实时荧光PCR体系可重复性分析表明，标准偏差(SD)均小于0.25，介于0.025至0.211之间(表3)，在可接受范围内，说明建立的检测体系具有较好的可重复性(图1A-1D)。因此针对I、II和III型脊髓灰质炎病毒建立的实时荧光检测体系适于进一步对食品样品的检测。

表3  基于参照分子的I、II和III型脊髓灰质炎病毒检测体系可重复性分析

2.2.2检测下限分析

分别以5、2和1拷贝/μl三个参照分子DNA溶液为模板测试检测体系灵敏度，每个浓度DNA重复检测10次。结果显示包括最低1拷贝/μl模板(2拷贝/反应)在10次检测中均可被稳定检出。因此，建立的三种实时荧光检测体系的检测下限均为2拷贝参照分子DNA。

2.3三种血清型脊髓灰质炎病毒的同时检测

2.3.1标准曲线制备和检测下限分析

为了满足口岸快速检测的要求和简化检测流程，实现三种血清型病毒的同时检测，本发明对建立的三个检测体系进行混合用于检测。将上述针对三种血清型病毒分别设计的三套引物和探针进行混合，对反应体系和反应条件优化后，建立了一个反应管内同时检测三种血清型脊髓灰质炎病毒的实时荧光体系。

通过制备的标准曲线可以看出(图1A-1D)，PCR反应效率达1.01，相关系数为0.999。三次平行重复的SD值介于0.004至0.244之间(表3)。对体系的检测下限分析表明，与对三种血清型病毒分别检测的灵敏度相似，对三种血清型病毒同时检测可扩增到的最低模板量亦为2个拷贝参照分子DNA。

2.3.2同时检测与单独检测体系的比较

本发明对三种血清型脊髓灰质炎病毒实施单独检测和同时检测的PCR扩增反应进行了比较。以3个浓度样品cDNA为模板，通过单独与同时检测体系对I、II和III型脊髓灰质炎病毒的分析表明，平均Ct值差值分别介于-0.11至0.043，-0.043至0.32，以及0.093至0.226之间；SD值分别小于等于0.32，0.27和0.34(表4)。对三种血清型病毒实施单独检测与同时检测的Ct值差异未达显著水平，扩增曲线基本重合(图2-4)。由此可见，对三种血清型脊髓灰质炎病毒进行同时检测与单独检测效果无显著差异。

表4对I、II、III型脊髓灰质炎病毒实施单独检测和同时检测的比较

2.4食品样品中脊髓灰质炎病毒的检测

为了鉴定建立的检测体系对食品样品中脊髓灰质炎病毒的实际检测效果，本发明选择了易受病毒污染的四类食品，包括牡蛎、蓝莓、生菜和水进行病毒人工接种。结果如表5所示，在四种食品样品中分别添加I、II或III型2700，270和54拷贝病毒，扩增曲线均可稳定出现荧光增幅。拷贝数的RSD在1.8％至45.0％之间，相比较而言，较大的三个RSD值(42.8％，45.0％)出现在添加浓度最低的54拷贝病毒的水样中。同时添加三种血清型病毒的食品样品检测结果与单独添加的结果相似，即当病毒添加量低至54拷贝时，仍可稳定获得有荧光增幅的扩增曲线，RSD值在3.8％至40.3％间。因此，建立的脊髓灰质炎病毒Taqman-MGB实时荧光RT-PCR检测方法适于食品中脊髓灰质炎病毒的检测。

表5  食品样品中脊髓灰质炎病毒的检测

3讨论

近年来，包括中国在内的很多国家均发现了野生型和疫苗型脊髓灰质炎病毒感染病例。降低食源性脊髓灰质炎病毒感染和扩散是防控病毒流行的一个重要方面。由于贝类、蔬果和水样等食品样品中病毒含量较低，建立特异性好、灵敏度高的检测方法至关重要。

本发明人针对脊髓灰质炎病毒基因组2A区设计引物和探针，对三种血清型脊髓灰质炎病毒进行单独和同时检测。通过参照分子建立标准曲线，对人工接种病毒的牡蛎、蓝莓、生菜和水等食品样品进行检测。

结果表明，建立的检测体系具有很高特异性，对三种血清型脊髓灰质炎病毒进行单独和同时检测的下限均为2拷贝参照分子DNA。基于参照分子建立的四条标准曲线具有很好线性关系(R²＞0.999)和较高反应效率(1.01-1.04)。对四种食品样品的分析表明，建立的实时荧光RT-PCR方法可稳定检测到各添加浓度脊髓灰质炎病毒。

对四类易受病毒污染的人工接种食品样品分析表明，无论实施单独检测还是同时检测，对添加低至54拷贝病毒的样品均可稳定检测到荧光信号增幅。经实时荧光RT-PCR分析表明，在贝类、蔬菜、水果和水等食品样品中均可稳定检测到低至54拷贝病毒，为已报道的人工接种病毒食品检测中检测脊髓灰质炎病毒的最优结果。

因此，本发明建立的实时荧光RT-PCR检测体系适于食品中脊髓灰质炎病毒的检测。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心

<120>食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒

<130>094616

<160>14

<170>PatentIn version 3.4

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<213>人工序列

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<223>引物

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<223>探针

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tgtacactgc aggttac                                                 17

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<223>I型脊髓灰质炎病毒检测的标准参照物

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gtaaatgatc acaacccgac caaggtcacc tccaaaatca gagtgtatct aaaacccaaa   60

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>II型脊髓灰质炎病毒检测的标准参照物

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<212>DNA

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>III型脊髓灰质炎病毒检测的标准参照物

<400>14

gtaaatgatc acaacccgac taaagtaacc tccaaagtcc gcatttacat gaaacccaaa     60

cacgtacgtg tctggtgccc tagaccgccg cgcgcggtac cttattatgg accaggggtg    120

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