西尼罗病毒NS1蛋白单克隆抗体及其识别的B细胞表位和应用

摘要

本发明公开了一种西尼罗病毒NS1蛋白单克隆抗体及其识别的B细胞表位和应用。本发明筛选得到一株稳定分泌抗WNV-NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC No.4242。该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体WN-3D10与WNV-NS1蛋白发生特异性反应，而与JEV-NS1蛋白不发生反应。本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的WNV-NS1蛋白病毒特异性保守B细胞表位可用于制备成鉴别或诊断西尼罗病毒和日本脑炎病毒的试剂，为建立WNV与黄病毒属病毒的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗西尼罗病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及一个B细胞表位，尤其涉及由上述单克隆抗体所识别的西尼罗病毒NS1蛋白B细胞表位；本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及B细胞表位在制备诊断、预防或治疗西尼罗病毒药物中的应用，属于西尼罗病毒病的防制领域。

背景技术

西尼罗热(West Nile Fever，WNF)是一种由西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)引起的并通过蚊子传播的急性人畜共患传染病。WNV为单股正链RNA病毒，属黄病毒科黄病毒属，并且WNV与日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、圣路易脑炎病毒(Saint-Louis encephalitis virus，SLEV)和墨累河谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitis virus，MVEV)同属日本脑炎病毒血清群(Japanese Encephalitis Virus Serocomplex)，它们之间存在严重的血清学交叉反应。1937年12月科学家从非洲乌干达的西尼罗地区一位发热妇女的血液中首次分离到了该病毒，故将其命名为“西尼罗病毒”。鸟类是其重要宿主，蚊子(主要是库蚊)叮咬是其最主要传播方式。人、动物和鸟类均为易感动物。自从科学家在非洲首次发现WNV之后，20世纪50年代的埃及和以色列、60年代的法国以及70年代的南非也都有过该病的报道，但直到1996年罗马尼亚的WNF爆发，该病毒才真正引起人们的关注。1996-1997年罗马尼亚发病500多人，死亡率接近100％。1999年WNV首次出现于西半球，美国发生WNF的大爆发，该病毒迅速蔓延美国全境，并传播到加拿大和中美洲国家。据报道，人和动物感染WNV后大约20％的感染者会出现发热症状，而大约1/150的感染者会发展为脑炎、脑膜炎或脑膜脑炎，但在最近几次WNF的爆发中，发病率、出现脑炎症状的比率以及死亡率均有所增长，1999年美国爆发的WNF截止到2005年已经引起20000人和25000匹马发病，其中有800人和5000匹马死亡。

到目前为止，中国还没有WNV感染病例的报道。近年来中国国内研究者对一些地区的蚊子和鸟类进行了检测，其结果也均为WNV阴性。但是1987年和2006年所进行的流行病学调查中均出现了WNV抗体阳性者，加之中国周边国家与地区已经有WNF爆发，所以中国急需加强对该病毒的研究，做好可对其进行防控和监测的技术储备。同时由于人和动物感染WNV后往往处于亚临床症状或无症状，所以建立WNV的实验室诊断方法尤为必要。另外，WNV与其它黄病毒属病毒间存在严重的交叉反应，而中国又是JEV的流行区，所以应建立起可对WNV和JEV的感染进行鉴别诊断的方法。

NS1蛋白是WNV的一个保守非结构糖蛋白，含有352个氨基酸，分子质量约为42kDa。NS1蛋白在疫病诊断方面有重要利用价值。NS1蛋白在机体感染后3-8天就可以被检测到，在感染后第5天达到最大量，这一时间要早于临床症状出现的时间，所以NS1蛋白可以被用于病毒感染的早期诊断。该病毒的病毒血症时间短，血液中病毒粒子水平低，不易直接检测病原，而且对该病毒的操作要求在生物安全3级的水平中进行，这都给疫病的诊断带来了不便，而若对待检血清中针对NS1蛋白的抗体进行检测，则可以在对疫病进行诊断的同时区分自然感染动物和弱毒苗免疫动物，并且诊断工作在普通实验室即可完成。另外，由于黄病毒属病毒之间存在严重的血清学交叉反应，所以一般的检测血清中抗体的诊断方法不能有效的对该属各病毒进行鉴别诊断，而已有研究显示NS1蛋白中携带有较多的特异性位点，可以诱导出多个在黄病毒属病毒中无交叉反应的特异性抗体，而若筛选出一株可以分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定出其所分泌的单克隆抗体所识别的WNV-NS1蛋白特异性B细胞表位，那么就可以建立一个可对WNV和其它黄病毒属病毒进行鉴别诊断的ELISA检测方法。

发明内容

本发明目的之一是提供一株分泌西尼罗病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与WNV-NS1蛋白发生特异性反应，而与JEV-NS1蛋白不反应；

本发明目的之三是鉴定一个WNV-NS1蛋白的WNV特异性B细胞表位。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明利用pMAL-c2x原核表达载体对WNV-NS1基因进行原核表达，将所表达出的可溶性WNV-NS1蛋白纯化后作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。此外，本发明还利用杆状病毒表达系统对WNV-NS1基因进行真核表达，对所表达的包涵体形式的WNV-NS1蛋白进行变性、纯化和复性后作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，最终筛选获得一株稳定分泌抗WNV-NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC No.4242；分类命名是：小鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏时间：2010年10月13日；保藏单位是：中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其命名为WN-3D10，Western b1ot检测结果表明WN-3D10可与WNV-NS1蛋白发生特异性反应，而与JEV-NS1蛋白不发生反应。

本发明利用噬菌体展示技术和肽扫描技术对WN-3D10所识别的WNV-NS1蛋白的B细胞表位进行了鉴定，最终将该表位精确定位为：²⁷AWMDRYKYYP³⁶(SEQ ID No.1)。同时，序列比对结果显示²⁷AWMDRYKYYP³⁶为WNV所特有并保守的B细胞表位。

综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对WNV-NS1蛋白的单克隆抗体，本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的WNV-NS1蛋白病毒特异性保守B细胞表位可用于制备成鉴别或诊断西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)或日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的试剂，为建立WNV与黄病毒属病毒的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。

附图说明

图1应用Western blot试验检测单克隆抗体WN-3D10与WNV-NS1蛋白和JEV-NS1蛋白的反应性结果。1，3，5：WNV-NS1蛋白；2，4，6：JEV-NS1蛋白；M：标准蛋白Marker。

图2噬菌体克隆测序结果及与WNV-NS1蛋白相似性比较。

图3原核表达的15氨基酸短肽SDS-PAGE分析；1.MBP-15VP；M：标准蛋白Marker。

图4原核表达的15氨基酸短肽与WN-3D10反应性的Western blot分析M：标准蛋白Marker；1：MBP-15VP和WN-3D10的反应；2：MBP和WN-3D10的反应。

图5原核表达的15氨基酸短肽与WN-3D10反应性的间接ELISA分析。

图6表1中所合成短肽与WN-3D10反应性的间接ELISA分析1：NS1-15VP和WN-3D10的反应；2：NS1-13ET和WN-3D10的反应；3：NS1-11AE和WN-3D10的反应；4：NS1-9WP和WN-3D10的反应；5：NS1-7MY和WN-3D10的反应。

图7表2中所合成短肽与WN-3D10反应性的间接ELISA分析1：NS1-10AP和WN-3D10的反应；2：NS1-10WE和WN-3D10的反应；3：NS1-8WY和WN-3D10的反应；4：NS1-8MP和WN-3D10的反应。

图8所鉴定B细胞表位的病毒特异性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

主要实验材料和来源

1.蛋白、细胞、毒种和抗体

原核表达并纯化的WNV-NS1蛋白、真核表达并纯化的WNV-NS1蛋白、SP2/0细胞、Sf9细胞和携带WNV-NS1基因的重组杆状病毒BACV-NS1均由本实验室保存；原核表达的JEV-NS1蛋白和抗JEV-NS1蛋白单克隆抗体JE-1H6(已验证其只能与JEV-NS1蛋白发生反应)由哈尔滨兽医研究所华荣虹副研究员惠赠(上述蛋白和抗体也可按照有关文献记载的方法制备得到)；黄病毒属病毒NS1蛋白单克隆抗体Flavi-4G4(已验证其与黄病毒属病毒NS1蛋白均能发生反应)由澳大利亚动物卫生研究所Ros s教授惠赠(上述抗体也可按照有关文献记载的方法制备得到)。

2.主要试剂和药品

胎牛血清(FBS)、DMEM干粉和L-谷氨酰胺购自GIBCOL公司；弗氏佐剂、50％PEG、50×HAT、50×HT和8-氮鸟嘌呤(8-AG)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗小鼠IgG均购自Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG为金桥生物技术有限公司进口分装产品；SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotechnology公司；库容量为2.7×10⁹的M13噬菌体随机肽库Ph.D.-12TM、四环素(Tet)抗性的宿主菌ER2738以及原核表达载体pMAL-c2X均购自NEB公司；Ex Taq DNA聚合酶、T₄ DNA连接酶、限制性内切酶EcoR I和Sal I购自宝生物工程(大连)公司。

3.实验动物

6周龄BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

实施例1 单克隆抗体的制备

1.小鼠免疫

以纯化后的原核表达重组NS1蛋白免疫5只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔两周，一免将重组NS1蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，二免和三免将重组NS1蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，免疫剂量为50μg/只，免疫途径为腹腔免疫。

分别在二免和三免后一周对小鼠进行断尾采血，分离血清(4℃，10000rpm，20min)，用间接ELISA检测抗体水平。在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠再进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原(不加佐剂)。

2.细胞融合

融合前1天准备饲养细胞，按照常规方法去BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞4∶1的比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。

3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

利用纯化后的真核表达WNV-NS1蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的克隆，克隆3轮，将克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得一株可以稳定分泌抗WNV-NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC No.4242，将其分泌的单克隆抗体命名为WN-3D10。

4.单克隆抗体的大量制备

给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.5mL/只，1周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，7-10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水10000r/min离心10min，去除上层油脂和沉淀，上清分装保存于-20℃。

实施例2 单克隆抗体的鉴定

1.单克隆抗体的亚类鉴定

按照SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例1所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。

结果显示本发明单克隆抗体WN-3D10的重链为IgG₁，轻链为κ链。

2.Western blot试验

将WNV-NS1蛋白和JEV-NS1蛋白进行SDS-PAGE电泳然后进行电转印，电转条件为18V电压30min。转印后的硝酸纤维素膜放入含50g/L脱脂奶粉的PBS封闭液中4℃封闭过夜；将封闭好的硝酸纤维素膜放入阳性杂交瘤培养液上清中室温作用1h，用PBST(含0.5mL/L吐温-20的pH7.4的PBS缓冲液)洗涤3次，再与经PBS 5000倍稀释的山羊抗小鼠IgG HRP标记抗体室温作用1h，PBST洗涤3次，DAB显色试剂盒显色，扫描记录。

为了印证本发明所制备的单克隆抗体与WNV-NS1蛋白反应的特异性，本实验还设定了JE-1H6和Flavi-4G4两种单克隆抗体作为对照，已有实验结果表明JE-1H6只与JEV-NS1蛋白发生特异性反应，而与WNV-NS1蛋白不发生反应，Flavi-4G4则与两种蛋白都发生反应。

试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体WN-3D10能够与WNV-NS1蛋白发生特异性反应，而与JEV-NS1蛋白不反应，同时所设对照JE-1H6和Flavi-4G4均成立(图1)，同时根据本实验结果推测WN-3D10所识别的WNV-NS1蛋白B细胞表位是一个线性表位。

实施例3 B细胞表位的鉴定

1.噬菌体展示随机肽库的生物淘选与噬菌体基因组序列测定

参照NEB公司噬菌体展示随机12肽库操作手册，用所制备纯化出的单克隆抗体WN-3D10对随机肽库进行3轮淘选，从而淘选出所展示肽段可与单克隆抗体特异性结合的噬菌体。3轮淘选单克隆抗体包被量均为100μg/mL，150μL/孔，而3轮淘选所用的PBST缓冲液中吐温-20浓度分别为0.1％、0.3％和0.5％。

从第3轮洗脱下来的噬菌体中取2μL做10倍系列稀释，每一稀释度取10μL接种200μL对数生长期ER2738宿主菌，作用5min后将全部菌液与3mL琼脂培养基混合倾注于含有IPTG和X-gal的固体培养基之上，37℃培养过夜。

从总量不到100个噬菌斑的平板上，随机挑取10个噬斑，分别接种8管1mL对数生长期ER2738宿主菌，37℃摇床培养4.5h。之后将培养物10000rpm，离心30s，上清移入新管中再次10000rpm，离心30s，取600μL上清即为扩增噬菌体贮液。之后根据操作手册中介绍的方法即可从上述噬菌体贮液中提取出噬菌体基因组DNA，并交由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。

噬菌体测序结果显示WNV-3D10所淘选出的10个噬菌体克隆中有8个拥有一些共同序列(图2)，通过比较整合最终确定出一条一致序列DRYKYY，而且WNV-NS1蛋白上存在该序列，故认为DRYKYY应该是WN-1C10所识别的一个线性表位，或者是该表位的核心序列。

2.B细胞表位的初步鉴定

以上述NS1蛋白上的相似区段为核心，分别向蛋白N端和C端各延伸4-5个氨基酸，最终选取长度为15个氨基酸的短肽(VEAWMDRYKYYPETP)为研究对象，进行WNV-NS1蛋白B细胞表位的初步鉴定。具体方法如下：

(1)人工合成一对互补寡核苷酸链，分别编码上述15个氨基酸短肽。

编码VEAWMDRYKYYPETPWNVNS1-15VP-EcoR I

F：5′-aattcgaggcttggatggaccggtacaagtattaccctgaaacgccacaataag-3′(SEQ ID No.2)，划线部分为引入的EcoR I粘性延伸末端。

WNVNS1-15VP-Sal I

R：5′-tcgacttattgtggcgtttcagggtaatacttgtaccggtceatccaagcctcG-3′(SEQ ID No.3)，划线部分为引入的Sal I粘性延伸末端。

以上引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成

(2)将两对互补链直接54℃退火10min形成带有粘性末端的双链DNA，同时用EcoR I和Sal I对pMAL-c2x进行双酶切。

(3)将两条退火形成的双链DNA与酶切后的pMAL-c2x相连接

(4)连接产物转化BL21感受态细胞，用两对互补链中的上游链和载体下游引物M13-47对重组质粒进行PCR鉴定，将重组质粒分别命名为pMAL-NS1-15VP。

(5)挑取单个阳性菌落过夜培养，之后以1∶100接种于40mL LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600约为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，37℃诱导表达5h，收集菌体用4mL PBS缓冲液重悬，超声波破碎菌体，10000rpm，4℃，离心20min。收集上清和沉淀，并分别对其进行SDS-PAGE电泳分析，以确定短肽的表达情况(图3)。

结果显示短肽成功表达，并且其与pMAL-c2x载体所携带的麦芽糖结合蛋白(MBP)形成融合蛋白，将该融合蛋白命名为MBP-15VP。

(6)确认短肽成功表达后，利用WN-3D10对短肽进行Western blot分析，并将短肽100ng/孔包被ELISA反应板进行间接ELISA检测。

结果显示所表达的15氨基酸短肽可以与WN-3D10发生特异性反应(图4，图5)。进而将WN-3D10所识别的WNV-NS1蛋白B细胞表位初步定位于²⁵VEAWMDRYKYYPETP³⁹。

3.B细胞表位的精确定位

利用肽扫描技术合成如下短肽(表1)，并对其进行间接ELISA检测，包被量为100ng/孔，进而精确定位B细胞表位。

表1 针对WN-3D10所合成的短肽

结果显示NS1-15VP、NS1-13ET、NS1-11AE和NS1-9WP均可以与WN-3D10呈阳性反应，而NS1-7MY与WN-3D10呈阴性反应。不过NS1-9WP与WN-3D10反应的OD492值较低约为0.2，说明两者的结合效率较低，从而进一步说明NS1-11AE与NS1-9WP之间存在某些关键氨基酸，决定了表位短肽和单克隆抗体的结合效率(图6)。从而将WN-3D10所识别的表位精确到NS1-11AE和NS1-7MY之间。

根据上述间接ELISA检测结果进一步合成出如下4条短肽(表2)，最终完成WN-3D10所识别WNV-NS1蛋白B细胞表位的精确定位。

表2 针对WN-3D10所合成的短肽

对表2中的短肽进行间接ELISA检测显示NS1-10AP和NS1-10WE均可以与WN-3D10呈阳性反应，但NS1-10WE与WN-3D10反应的OD492值较低约为0.19，而NS1-8WY和NS1-8MP均呈阴性反应(图7)。上述结果说明27位的A对WN-3D10所识别的表位来说是一个关键氨基酸，它的缺失会显著降低WN-3D10与相应表位的结合效率，而37位的E对WN-3D10所识别的表位来说则是一个非必须氨基酸，它的缺失不会影响WN-3D10与相应表位的结合效率。

综上所述，本发明将WN-3D10所识别的WNV-NS1蛋白B细胞表位精确定位为²⁷AWMDRYKYYP³⁶。

4.B细胞表位的保守型和病毒特异性分析

利用European Bioinformatics Institute(EBI)数据库提供的氨基酸序列Blast程序，对所鉴定出的WNV-NS1蛋白B细胞表位进行保守性分析，同时将该表位序列与其它黄病毒属病毒NS1蛋白相应区段进行比对，分析该表位是否是WNV特异性表位。

Blast结果显示所鉴定出的WNV-NS1蛋白B细胞表位在WNV各毒株中是保守的，而且和其它黄病毒属病毒NS1蛋白相应区段的比较显示该表位是WNV所特有的(图8)。