去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法

摘要

本发明提供了一种去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，所要解决的问题是：浓缩、纯化等提取狂犬病疫苗方法只能将游离DNA去除，不能去除与抗原蛋白结合的宿主DNA；临床不良反应现象屡见不鲜。本发明的要点是：使用超声波对狂犬病疫苗进行超声处理，将宿主DNA与抗原蛋白的结合、宿主蛋白与抗原蛋白的结合破坏，通过层析纯化去除杂蛋白及宿主DNA。本发明的积极效果是：在保证疫苗效价的前提下，提高疫苗产品质量，去除大量杂蛋白及宿主DNA，解决了目前狂犬病疫苗行业面临的质量问题。

说明书

技术领域

本发明涉及在疫苗制品中去除杂蛋白及宿主DNA的方法。

背景技术

目前狂犬病疫苗的提取普遍采用简单的分子筛凝胶层析提取，使用这种工艺提取得到的狂犬病疫苗，存在以下缺陷：

1、病毒疫苗在提取后仍含有过高的宿主蛋白，去除杂蛋白率不高，导致疫苗在临床使用后有较大的副作用。

2、病毒疫苗提取后宿主DNA含量过高。

3、影响了病毒疫苗产品的产品质量，制约了疫苗产品的生产。

为此许多人在纯化层析过程中，对层析柱连接方式进行尝试，对平衡盐pH值进行调节，改变层析用凝胶等方法，采用不同的纯化方式，仅在结果上取得了轻微变化，没能取得实质上的变化。

狂犬病病毒疫苗是将狂犬病毒接种于适合的动物细胞上，经过动物细胞发生免疫反应后产生抗体，释放到培养液中，再经浓缩纯化后提取得到狂犬病病毒疫苗原液。在此过程中，会产生游离的宿主DNA及与抗原蛋白结合的宿主DNA，原液中还含有大量的宿主蛋白，浓缩纯化工艺会将游离的DNA除去，但与抗原蛋白结合的DNA及宿主蛋白仍有很大一部分残留在纯化原液中，这部分DNA会随着疫苗一起被注入到人体内。由于异源物质的注入，会在人体引起不良反应。

发明内容

为实现对疫苗的处理要尽可能不损失抗原，即不影响疫苗制品的药效，有效的去除杂蛋白及残留宿主DNA的目标，本发明的目的在于提供一种用超声波振荡处理疫苗中间产品-浓缩液和纯化液，去除疫苗制品中杂蛋白及宿主DNA的方法，获得杂蛋白及宿主DNA低含量的狂犬病病毒疫苗。

本发明有以下两个技术方案：

方案一：以疫苗浓缩液为原料

1、使用超声波细胞粉碎机超声处理疫苗浓缩液；

2、经过分子筛层析对上述浓缩液进行第一次提纯，得到本发明所称的第一次纯化液，观察杂蛋白、宿主DNA的去除情况。

方案一的工艺流程是疫苗浓缩液→超声处理→提纯→本发明所称的第一次纯化液。

方案二：以常规的疫苗纯化液为原料

1、使用超声波细胞粉碎机超声处理常规的疫苗纯化液；

2、经过分子筛层析对上述常规的疫苗纯化液再次提纯，得到本发明所称的纯化液，观察杂蛋白、宿主DNA的去除情况。

方案二的工艺流程是常规的疫苗纯化液→超声处理→提纯→本发明所称的纯化液。

利用超声波细胞粉碎机对狂犬病疫苗进行超声处理，可以将杂蛋白、宿主DNA与狂犬病病毒抗原的结合打破、或者将宿主DNA粉碎，经过分子筛层析纯化后，分离得到纯化的狂犬病疫苗，由于超声波的波长远大于狂犬病病毒抗原，所以超声波不会对狂犬病病毒抗原产生强力的破坏，经过合理的设置超声程序，得到最佳的超声波处理功率、工作时间、间隙时间、总工作时间等工作参数，可应用于对狂犬病疫苗的处理。

与现有技术相比，本发明的创新之处在于，在不向疫苗制品中添加任何物理、化学、生物等物质，保证疫苗抗原原始结构的前提下，有效去除杂蛋白、宿主DNA的含量，突破疫苗制品的质量瓶颈，提高产品质量。

附图说明

下面结合实施例及图谱详尽说明本发明。

附图1：超声后狂犬病疫苗浓缩、本发明所称的第一次纯化液及对照浓缩液分子筛层析纯化图谱，图中曲线1是未超声的狂犬病疫苗浓缩液分子筛层析纯化图谱，曲线2是超声后的狂犬病疫苗浓缩液分子筛层析纯化图谱，曲线3是超声后的本发明所称的第一次纯化液分子筛层析纯化图谱。

附图2：超声后狂犬病疫苗纯化液及对照纯化液分子筛层析纯化图谱，图中曲线4是未超声的狂犬病疫苗纯化液分子筛层析纯化图谱，曲线5是超声后的狂犬病疫苗纯化液分子筛层析纯化图谱。

附图3：狂犬病疫苗浓缩、本发明所称的第一、二次纯化液DNA检测图谱。

附图4：狂犬病疫苗纯化液及本发明所称的纯化液DNA检测图谱。

附图5：DNA琼脂糖凝胶电泳图谱1，图中Marker是DNA marker DL2000，1是纯化液样品(未超声)，2是纯化液样品(超声)，3是浓缩液样品(未超声)，4是浓缩液样品(超声)。

附图6：DNA琼脂糖凝胶电泳图谱2，图中Marker是DNA marker DL2000，5是纯化液样品(未超声)，6是纯化液样品(超声)，7是纯化液样品(超声)。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明，但不用于限制本发明的范围。本实施例采用常规实验技术，这些均是本技术领域人员所熟悉的，可以按照本实施例使用材料厂商所提供的说明书即可进行。

实施例一：针对方案一的实施例

步骤1，使用Φ6变幅杆的Scientz-IID型超声波细胞粉碎机对狂犬病疫苗浓缩液进行超声处理，检测病毒抗原损失情况。

准备常规工艺生产的狂犬病疫苗浓缩液，在冰浴保护下进行超声，保证浓缩液温度不超过26℃，每次超声处理液量为20ml，通过改变超声波细胞粉碎机的功率、工作时间、间隙时间、总工作时间的设置，设计一系列超声程序，通过《中华人民共和国药典》2005版三部附录中要求的ELISA法检测抗原含量，未超声处理的狂犬病疫苗浓缩液为对照，计算抗原损失率，获得超声处理的最佳程序。超声程序及抗原检测结果见表1。

表1：对狂犬病疫苗浓缩液超声程序及抗原检测结果

步骤2，由表1数据可得，在抗原损失小于等于30％的前提下，选取超声程序中最强程序为最佳程序，即功率700W，工作时间5s，间隙时间10s，总工作时间8s的超声程序，再次使用超声波细胞粉碎机按该程序处理上述浓缩液，使用分子筛层析对该浓缩液进行第一次纯化，得到本发明所称的第一次纯化液，观察杂蛋白、宿主DNA的去除情况

准备普通常规工艺生产的狂犬病病毒疫苗浓缩液50ml，在冰浴保护下进行超声，保护疫苗温度不超过26℃，设置参数为功率700W，工作时间10s，间隙时间10s，总工作时间8min。将超声后的浓缩液通过XK26层析柱、Sepharose 4FF凝胶层析纯化，紫外检测系统检测范围设定为1A，记录仪纸速设定为2cm/h，输出设定为100mV。用pH7.6的10mmol/L PBS流动相洗脱，收集第一个吸收峰，即狂犬病疫苗蛋白吸收峰。将同批狂犬病病毒疫苗浓缩液50ml在不经过超声处理，层析纯化后收集纯化后原液作为对照液。将收集到的狂犬病病毒疫苗纯化液分别经行蛋白含量、抗原含量、DNA含量检测，比较实验结果。实验检验结果如表2，层析图谱见图1，DNA含量检测图谱见图3。

上述蛋白含量检测方法为《中华人民共和国药典》2005版三部附录中要求的Lowery法；抗原含量检测方法为《中华人民共和国药典》2005版三部附录中要求的ELISA法；DNA检测方法是按照中国药品生物制品鉴定所2009年最新提供的《Vero细胞DNA残留量测定标准操作规程》进行检测。

步骤3，对步骤2得到本发明所称的第一次纯化液，重复步骤2后，得到本发明所称的第二次纯化液，观察杂蛋白、宿主DNA的去除情况

实验结果如表2，层析图谱见图1，DNA含量检测图谱见图3。

表2：狂犬病疫苗浓缩、本发明所称的第一、二次纯化液检测结果

参见表2，超声处理后的浓缩液经过分子筛层析纯化后得到本发明所称的第一次纯化液与未超声处理后的浓缩液经过分子筛层析纯化后得到的纯化液(对照液)相比，蛋白去除率提高6.5％，DNA含量降低约99％；超声处理后的本发明所称的第一次纯化液经过分子筛层析纯化后得到本发明所称的第二次纯化液与未超声处理后的浓缩液经过分子筛层析纯化后得到的纯化液(对照液)相比，蛋白去除率提高7.1％，DNA含量降低约99.5％～99％，得到理想的结果。

步骤4，使用Φ3变幅杆的Scientz-IID型超声波细胞粉碎机处理狂犬病疫苗中提取的DNA样品，经过琼脂糖凝胶电泳后对DNA的粉碎情况进行分析

由于宿主DNA与抗原蛋白结合，或宿主DNA分子大小与抗原蛋白分子大小接近程度小于分子筛分离范围，致使宿主DNA与抗原蛋白层析后无法有效分离。通过超声处理狂犬病疫苗浓缩液或纯化液，打破宿主DNA与抗原蛋白结合或将大片段的DNA分子粉碎为小片段的DNA分子，经过琼脂糖凝胶电泳，可观察DNA片段的粉碎情况。DNA琼脂糖凝胶电泳图谱见附图5。

由附图5、附图6可看出，在狂犬病疫苗纯化液中提取到的样品DNA片段(1号)大约为5000bp，经过功率200W，工作2s，间隙8s，工作10次后样品DNA片段(2号)大约为2500bp，在狂犬病疫苗浓缩液中提取到的样品DNA片段(3号)大约为6000bp，经过功率200W，工作2s，间隙8s，工作10次后样品DNA片段(4号)大约为3000bp，所以超声可以打断宿主DNA片段，浓缩液或纯化液超声处理后在经过层析纯化，可有效去除宿主DNA。

实施例一的工艺流程是：对疫苗浓缩液→超声处理→检测病毒抗原损失情况→疫苗浓缩液→超声处理→第一次提纯→本发明所称的第一次纯化液→超声处理→第二次提纯→本发明所称的第二次纯化液→超声处理DNA样品→分析。

实施例二：针对方案二的实施例

步骤1，使用Φ6变幅杆的Scientz-IID型超声波细胞粉碎机对常规的疫苗纯化液进行超声处理，检测病毒抗原损失情况。

准备常规工艺生产的狂犬病疫苗纯化液，在冰浴保护下进行超声，保证纯化液温度不超过26℃，每次超声处理液量为20ml，通过改变超声波细胞粉碎机的功率、工作时间、间隙时间、总工作时间的设置，设计一系列超声程序，通过《中华人民共和国药典》2005版三部附录中要求的ELISA法检测抗原含量，未超声处理的狂犬病疫苗纯化液为对照，计算抗原损失率，获得超声处理的最佳程序。超声程序及抗原检测结果见表3。

表3：对狂犬病疫苗纯化液超声程序及抗原检测结果

由表3数据可得，在抗原损失率工艺规定的小于30％的前提下，选取超声程序中最强程序为最佳程序，即功率700W，工作时间10s，间隙时间10s，总工作时间8s的超声程序，并在此后的实施例步骤2中应用此程序进行处理。

步骤2：根据病毒抗原损失情况，再次使用超声波细胞粉碎机处理上述常规的疫苗纯化液，使用分子筛层析对该纯化液进行纯化，得到本发明所称的纯化液，观察杂蛋白、宿主DNA的去除情况，具体步骤同实施例一中的步骤2。

实验结果如表4，层析图谱见图2，DNA含量检测图谱见图4。

表4：狂犬病疫苗纯化液及本发明所称的第三次纯化液DNA检测结果

参见表4，超声处理后的纯化液经过分子筛层析纯化后得到本发明所称的纯化液与未超声处理后的纯化液经过分子筛层析纯化后得到的纯化液(对照液)相比，蛋白去除率提高10.3％，DNA含量降低约99.0％～99.9％得到理想的结果。

步骤3：使用Φ3变幅杆的Scientz-IID型超声波细胞粉碎机处理狂犬病疫苗中提取的DNA样品，经过琼脂糖凝胶电泳后对DNA的粉碎情况进行分析，具体步骤同实施例一中的步骤4。

实施例二的工艺流程是：对疫苗浓缩液→超声处理→检测病毒抗原损失情况→常规疫苗纯化液→超声处理→提纯→本发明所称的纯化液→超声处理DNA样品→分析。