一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因及其抗低温应用

摘要

一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因及其抗低温应用属分子生物学与基因工程领域，本发明提供了一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因和蛋白，同时提供了基因相应的表达载体和宿主细胞，本发明的有益效果在于：一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因的应用，能提高菌株的抗低温能力。

说明书

技术领域

本发明属分子生物学与基因工程领域，具体涉及一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因克隆及其应用。

背景技术

干旱、盐渍和低温都能引起植物水分亏缺，在这期间植物细胞积累一系列的蛋白质来保护细胞免受脱水伤害。环境胁迫除了引起代谢变化和低分子量保护性化合物的积累外，植物的许多基因可被激活转录，并导致植物营养组织中新蛋白的积累，特别是植物干旱、低温诱导蛋白的研究已受到普遍关注，其中胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundantprotein，LEA)是指胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质，其具有亲水性和热稳定性，广泛存在于高等植物中，且受发育阶段、脱落酸(ABA)和脱水信号的调节，因此成为当前在逆境研究方面的一个重要课题。

LEA蛋白是一类亲水性大家族，共同特点是由极性氨基酸组成，为亲水性的多肽，甘氨酸含量＞6％，亲水指数＞1.0，大多数LEA蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸残基。根据LEA蛋白氨基酸序列同源性和特定的序列单元，LEA蛋白被分为6组。由于各组LEA蛋白序列和可能的蛋白质结构不同，每一组LEA蛋白在水分胁迫下有不同的功能。

LEA蛋白表达受发育阶段控制，但它们也能在施加外源ABA的离体胚中表达，许多营养组织在外源ABA、渗透和低温胁迫的诱导下能产生特异的LEA mRNA和LEA蛋白。LEA蛋白表达无组织特异性，可以在转录水平上被ABA、高渗透浓度和水分胁迫所诱导。植物在受到干旱胁迫时，LEA基因的高水平表达和LEA蛋白的大量积累，表明LEA具有干旱保护功能。种子在自然成熟过程中发生自燃的干化作用，LEA蛋白的作用是保护种子细胞免受由干化引起的伤害，并且在部分种类耐受寒冷冻的生理作用中具有重要意义。

LEA蛋白最显著的物理化学特性是具有很高的亲水性和热稳定性，即使在煮沸条件下也能保持水溶状态，同时可能形成一种离子载体为那些即将干化失水的组织细胞中的离子凝结/结晶作好准备。在干旱脱水过程中细胞液的离子浓度会迅速升高，高强度的离子浓度会造成细胞的不可逆伤害。第3组LEA蛋白中的11个氨基酸残基组成的基元序列可形成兼性a2螺旋结构，提供一个具疏水条区的亲水表面，螺旋的疏水面可形成同型二聚体，处在亲水表面的带电基团可鳌合细胞脱水过程中浓缩的离子，如Na⁺和PO³⁺。此外，组成该蛋白的大多数氨基酸残基为碱性、亲水性氨基酸，无半胱氨酸和色氨酸，这些高电荷的氨基酸残基可以重新定向细胞内的水分子，束缚盐离子，从而避免干旱胁迫时细胞内高浓度离子的累积所引起的损伤，同时也可防止组织过度脱水。目前，在多种植物中都有关于第3组LEA蛋白或基因的研究报道，这些基因的表达或蛋白累积与植物的渗透胁迫抗性呈正相关。萌芽3天的大麦幼苗经ABA或干旱处理后，幼苗的所有器官中均有高水平的HVA1 mRNA和蛋白质出现，它可被干旱等环境胁迫和ABA诱导表达。Xu等将HVA1 cDNA全序列导入水稻，获得了抗旱、抗盐的转基因水稻，从而直接证实了第3组LEA基因可能具有干旱保护功能。

LEA广泛存在于高等植物种子中，首先是在棉花中被发现，后来相继在大麦、胡萝卜、小麦、大豆、番茄和向日葵植物中检测到此类蛋白。

在众多的研究中，并没有看到在多抗植物腊梅中有关LEA的相关报道，而腊梅【Chimonanthus praecox】作为一种具有多抗特性的物种，对外界环境的适应能力比较强，并且腊梅耐旱、耐寒、病虫害较少，在腊梅中一定存在多抗基因。发明人利用本实验室构建的腊梅花ESTs序列，从腊梅花cDNA文库中克隆了胚胎发育晚期丰富蛋白基因(CpLEA3)。构建了腊梅LEA基因的表达载体，使表达菌株表达该基因的编码蛋白，通过低温胁迫后测菌落生物活性以及细胞膜通透性损伤情况，发现CpLEA3基因能提高菌株的抗低温能力，因而本发明具有创新性。

发明内容

(1)提供一种DNA序列，其编码一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因，命名为CpLEA3；(2)提供一种利用基因工程方法得到CpLEA3编码的蛋白；(3)提供CpLEA3在菌株抗低温基因工程方面的应用。

本发明提供了CpLEA3基因，它具有如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

从腊梅花冠cDNA文库中，利用PCR方法筛选克隆出CpLEA3基因：利用RNAiso Reagent(购自大连Takara公司)提取腊梅花冠总RNA，按照SMARTTM cDNA Library Construction Kit合成腊梅花冠cDNA文库，随机挑取1000个文库克隆测序和生物信息学分析，获得腊梅花ESTs序列。从腊梅花ESTs序列中，发现编码CpLEA3的cDNA序列，根据此序列设计上下游引物，并以腊梅花cDNA文库为模板进行PCR扩增，克隆出CpLEA3的全长基因。

CpLEA3的基因由288个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架，为序列表中的SEQ IDNO：1序列。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。

本发明还提供了由CpLEA3基因序列编码的蛋白，其具有序列表中SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，是含有95个氨基酸残基，其理论分子量大小为10.4129kDa，预测等电点为9.98。根据软件分析，CpLEA3蛋白前41个左右氨基酸为叶绿体运输肽，从第4个到第25个氨基酸为跨膜结构域，该蛋白为稳定蛋白。

重组原核表达载体含有CpLEA3基因，重组原核表达载体转化的宿主细胞为大肠杆菌。

如实施例二所述，还可利用基因工程的方法，在高效大肠杆菌表达系统中表达出具有生物活性的CpLEA3蛋白。

关于在菌株抗低温基因工程方面的应用：

CpLEA3基因在菌株抗低温基因工程方面的应用，包括低温胁迫阳性克隆菌株和空载菌株后观察菌株生物活性以及阳性克隆菌株和空载菌株细胞膜通透性。通过低温胁迫，阳性克隆菌株存活率比空载菌株高约20％。通过电导率测定，阳性克隆菌株细胞膜损伤程度仅为空载菌株的55％，阳性克隆菌株细胞膜遭到破坏的程度比空载菌株小，说明CpLEA3基因能提高菌株的抗低温能力。

本发明的有益效果在于提供了一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因(CpLEA3)及蛋白，构建了原核表达载体，并将验证正确的原核表达载体转入BL21表达菌株中诱导表达，通过低温胁迫后测菌落生物活性及菌株细胞膜通透性，分析CpLEA3基因可提高菌株抗低温的能力。

附图说明

图1为以腊梅花冠cDNA为模板，PCR扩增电泳图

其中：M：marker自上到下大小为：1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp1、2：目的条带

图2为CpLEA3原核表达载体的构建过程示意图

图3为SDS-PAGE原核表达全蛋白电泳图

其中：M：Marker从上至下为97、66、43、31(kDa)

      1、2：含有重组克隆质粒pET-32a::CpLEA3的BL21宿主菌全蛋白

      CK：含有空载体质粒pET-32a的BL21宿主菌全蛋白

图4为低温胁迫后菌株细胞活力平板菌落示意图

其中：pET32a：空载菌株；pET32a-CpLEA3：转基因阳性克隆菌株

      CK：pET32a和pET32a-CpLEA3未做低温胁迫处理

      24h：pET32a和pET32a-CpLEA3在-20℃胁迫处理24h

      48h：pET32a和pET32a-CpLEA3在-20℃胁迫处理48h

      72h：pET32a和pET32a-CpLEA3在-20℃胁迫处理72h

图5为低温胁迫后菌株细胞活力曲线图

图6为-20℃低温胁迫60min后菌株细胞膜通透性的差异示意图

其中：pET32a：空载菌株；pET32a-CpLEA3：转基因阳性克隆菌株

具体实施方式

实施例一：克隆CpLEA3基因

1.提取RNA：

取500mg腊梅花冠用RNAiso Reagent提取腊梅花总RNA。

2.构建cDNA文库：

取总RNA，按照SMARTTM cDNA Library Construction Kit合成腊梅花cDNA文库，随机挑取1000个文库克隆测序和生物信息学分析，获得腊梅花ESTs序列。

3.CpLEA3基因片段的克隆：

根据腊梅花ESTs序列中找出的编码CpLEA3的cDNA序列，设计上下游引物，并以腊梅花cDNA文库为模板进行PCR扩增。

特异性引物如下：

CpLEA3-P1：5’-CGGGATCCATGGCTCGCTCTCTGTTG-3’，斜体碱基为BamH I酶切位点；

CpLEA3-P2：5’-CGAGCTCGTGGTTACGGAATTTCTGGG-3’，斜体碱基为Sac I酶切位点。

克隆PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性50sec；54℃退火30sec；72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在288bp位置上有一特异性的条带(图1)。按常规方法将片段克隆到pMD18-T Vector(购自大连Takara公司)中，并经上海生物工程公司进行测序。

CpLEA3基因的序列分析

经测序该基因cDNA序列开放阅读框包含288bp，含有一个完整的开放阅读框架，为序列表中的SEQ ID NO：1序列。编码95个氨基酸，具有序列表中SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，分子量大小为10.41299kDa，预测等电点为9.98，结果表明获得了全长基因的cDNA序列。

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对该基因编码的氨基酸进行保守区域分析，结果表明：该蛋白属胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)。对CpLEA3基因编码的氨基酸序列进行BLAST，显示的几乎都为LEA3家族，与已确定功能的其他物种氨基酸序列进行进化分析和同源性分析：CpLEA3与柑橘LEA基因编码的氨基酸进化距离最近。

利用SOPMA对CpLEA3进行二级结构预测，发现含有61.11％的α螺旋(h)，6.32％的延伸链(e)，31.58％的随机卷曲(c)。用TMpred软件对蛋白质结构进行分析，预测该基因从第4个到第25个氨基酸为跨膜结构域。根据CHLOROP软件分析CpLEA3前41个左右氨基酸为叶绿体运输肽，是稳定蛋白。

实施例二：CpLEA3在菌株中的高效表达

1.原核表达载体的构建：

为了表明CpLEA3基因的编码功能，将CpLEA3基因连接到pET-32a(+)的Sac I和BamH I位点之间，并转化大肠杆菌BL21，获得高效表达。

设计并合成一对特异性引物：

5’-CGGGATCCATGGCTCGCTCTCTGTTG-3’，斜体碱基为BamH I酶切位点；

5’-CGAGCTCGTGGTTACGGAATTTCTGGG-3’，斜体碱基为Sac I酶切位点。

按分子克隆常规实验程序，用PCR的方法扩增出两端带有特定酶切位点的基因编码序列，将基因和载体pMD18-T(购于上海鼎国生物公司)连接，验证正确。取pMD18::CpLEA3质粒和pET-32a(+)质粒(购于上海鼎国生物公司)分别用BamHI、Sac I双酶切、再连接(构建过程见图2)，将连接产物转化大肠杆菌BL21菌株(购于凯基生物公司)中，并用含100ug/ml Amp的LB培养基筛选重组子。经质粒酶切鉴定和PCR鉴定后，将连接正确的重组子进行测序，证明插入载体的DNA序列的阅读框架是正确的。将构建成带有CpLEA3基因的表达载体，命名pET-32a::CpLEA3，用于诱导表达分析。

2.原核表达：

将含有pET-32a::CpLEA3重组子的菌株，接种于LB培养基(1L：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCL10克)，37℃培养至菌液OD₆₀₀＝0.4-0.6。将BL21重组表达菌株研磨及超声破碎，我们得到了含有重组克隆质粒pET-32a::CpLEA3的BL21宿主菌粗酶液。进行12％SDS-PAGE电泳检测，从图3中可以看出，CpLEA3基因在BL21菌株中高效表达。

实施例三：低温胁迫后菌株细胞活力测定

分别取阳性克隆和转空载体菌株的单菌落于5mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.5，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养3h。分别分成2份，第1份稀释10000倍后涂于含100μg/mL Amp的LB培养基上，在37℃培养过夜；第2份分别吸取1mL在-20℃进行24h、48h和72h低温胁迫处理，处理后分别稀释10000倍后涂于含100μg/mL Amp的LB培养基上，37℃培养过夜。分别在次日统计菌落数(如图4)，以胁迫后生长的菌落数与未胁迫对照组比值来计算存活率(如图5)。

存活率＝(胁迫后生长的菌落数/未胁迫对照组生长的菌落数)×100％

结果表明：低温胁迫下阳性克隆菌株存活率明显高于空载菌株，24h后阳性克隆菌株存活率比空载菌株高21.19％，48h后阳性克隆菌株存活率比空载菌株高19.61％，72h后阳性克隆菌株存活率比空载菌株高20.02％，说明CpLEA3基因能提高菌株的抗低温能力。

实施例四：低温胁迫后菌株细胞膜通透性测定

采用电导率法测定，分别挑取阳性克隆和转空载体菌株的单菌落于5mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.5，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养3h。将诱导表达的阳性克隆和转空载体的菌体用去离子水悬浮至1*10⁹du/mL，分别将其在-20℃下处理60min后，取10ml菌体悬浮液离心(4000g，10min)，上清液用于测定电导率A。菌体再用10ml去离子水悬浮，置于100℃下煮15min后，离心(4000g，10min)，上清液用于测定电导率B。

相对电导率＝(电导率A/电导率A+电导率B)×100％

结果表明(如图6)：低温胁迫下阳性克隆菌株电导率仅为空载菌株的55％，说明转CpLEA3基因阳性克隆菌株细胞膜遭到破坏的程度明显小于空载菌株，该基因可以提高菌株的抗低温能力。

序列表

SEQ ID NO.1的序列

(i)序列特征：(A)长度：288bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.

1      ATGGCTCGCT CTCTGTTGAA GGCTAATCTT GCCGCTGCTA TCGCCGACGG CGTCTCCCTC

61     TCCATATCAA TGGCCAGGCG AGGTTTCTCA TCAGCAGCAC AAGGGAGAAG CAGGGTAGCA

121    AAAGCAGAGG AGAAGGTGAA GATGGTGATG ATGAAAGAAA GTGCTGATGC AAACTCTTGG

181    GTGCCCGACC CCGTCACCGG CTACTACCGA CCAGCAAATC GTACCGCCGA TGTCGATGTG

241    GCCGAGCTGC GGGAGATGCT CTTAACCCAG AAATTCCGTA ACCACTGA

 

SEQ ID NO.2的序列

(i)序列特征：(A)长度：95个氨基酸；(B)类型：氨基酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

1      MARSLLKANL AAAIADGVSL

21     SISMARRGFS SAAQGRSRVA

41     KAEEKVKMVM MKESADANSW

61     VPDPVTGYYR PANRTADVDV

81     AELREMLLTQ KFRNH*