一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测方法

摘要

本发明公开了一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂及制备方法。弓形虫MIC10是弓形虫侵入宿主细胞时分泌的一种蛋白，对弓形虫的侵入和增殖具有重要的作用，本发明是对MIC10基因的不同区域扩增表达，得到重组融合蛋白MIC10A、MIC10B和MIC10C，将纯化后的重组融合蛋白MIC10A、MIC10B分别免疫家兔，制备多克隆抗体，分别作为包被抗体、检测抗体，以纯化的MIC10C作为标准抗原，建立双抗夹心ELISA，检测血清中的弓形虫循环抗原，具有很强的特异性、敏感性、可重复性、稳定性，y＝0.0304Ln(x)-0.0567，R

说明书

技术领域

本发明属生物检验检疫技术领域，具体地说，构建重组蛋白，利用重组蛋白免疫制备的抗体，建立一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测方法。

背景技术

弓形虫(toxoplasma)是一种专性细胞内寄生性原虫，具有广泛的宿主群并在世界范围内流行，引起人兽共患寄生虫病。艾滋病患者、器官移植及恶性肿瘤患者等免疫功能损伤或抑制者，弓形虫作为一种机会感染因子，可致患者死亡。弓形虫病不但是医学上的一种重要疾病，更重要的是它是影响人类优生优育的一个重要生物因子。

人体感染了弓形体，多数可能是无症状的带虫者，仅少数人发病。该病临床表现复杂，轻者为隐性感染，重者可表现为多器官的严重损害，如弓形虫脑病、眼病、肾病、肝病、肺病及弓形体心肌炎等各系统的病变。值得注意的是，弓形体对妊娠有很重要的影响。被弓形体感染的孕妇，不论其有无临床症状，常可通过胎盘将弓形虫传给胎儿，从而直接影响胎儿的发育，使胎儿严重致畸，甚至死亡，亦可发生流产、死产、早产或增加妊娠合并症。感染发生得越早，胎儿受损越严重。在妊娠中三个月感染，多会出现死胎、早产和严重的脑、眼疾患；在妊娠晚期，因胎儿已逐渐成熟，此时母体如受到感染，胎儿可发育正常，亦可出现早产或出生后才出现症状，表现为各系统不同程度的损坏。据报道，偶见孕期感染弓形虫的胎儿在出生后数年甚至成人后才表现出弓形虫病。

据统计全世界四分之一人口受到弓形虫病的威胁，美国每年有400-4000例先天性弓形虫病发生。我国有6100多万人感染弓形虫病，其中育龄妇女有1300万-1500万，弓形虫是宫内感染的病原体之一，每年约有9万名受弓形虫损害的新生儿出生，孕妇弓形虫感染率为6.6％-32.9％，通过胎盘感染胎儿，严重影响胎儿生长发育。在畜牧业方面，怀孕动物出现流产，猪感染弓形虫会引起大批死亡。

可见弓形虫对人类危害极大，尤其是孕妇，在孕前和孕期(妊娠前三个月较好)最好做弓形虫的血清学检测。

ELISA是当前诊断弓形虫感染应用最广的技术，当前商品化的试剂盒主要包括检测抗体和检测循环抗原两大类。其中抗体检测又包括IgG检测试剂盒和IgM检测试剂盒两种。由于IgM抗体是在血清中早期出现，且停留时间较短，所以检测IgM抗体被用于多种疾病的早期诊断；而IgG出现较晚，是慢性期或既往感染的标志。IgG检测的最大缺点在于不能判定是当前感染还是既往感染。IgM检测尽管与当前感染有着很好的相关性，但不适合免疫功能低下人群和孕期检测，这是因为这些人群机体免疫功能低下，检测敏感性低，造成假阴性。

循环抗原(CAG)是弓形虫急性感染期虫体自身排泄和裂解产物，在虫体的侵入和繁殖过程中，由虫体分泌出来，因此检测CAG可以更加准确地诊断弓形虫的感染。而MIC10被证实是在虫体感染过程中分泌的循环抗原(CAG)中的一种主要蛋白，体外培养时虫体大量分泌该蛋白到培养基中，因此检测该蛋白不仅可对感染定性，而且还可通过对该蛋白定量来确定感染强度。

发明内容

本发明的目的是提供重组蛋白MIC-10。

所述的重组蛋白MIC-10为MIC-10A、MIC-10B或MIC-10C，其核苷酸序列依次分别如：SEQ ID No.1所示、SEQ ID No.2所示或SEQ ID No.3所示；

重组蛋白MIC-10的制备方法，它包括：

1)人工合成引物；

制备重组蛋白MIC-10A引物为：

FW：GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTAC

RV：GATCAAGCTTTCATTCACGAAGTCCTCTTTTC

制备重组蛋白MIC-10B引物为：

FW：GATCGGATCCGCCGCTGAGCGTGAGGAGAAG

RV：GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG

制备重组蛋白MIC-10C引物为：

FW：GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTAC

RV：GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG

2)提取RH株弓形虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得基因片段，克隆到PMD-18T载体上；

3)将MIC10A基因片段插入表达载体PET28A中构建重组表达质粒PET28A-MIC-10A、PET28A-MIC-10B或PET28A-MIC-10C；

4)将重组表达质粒PET28A-MIC10A转入BL21(DE3)中进行表达，得重组融合蛋白MIC-10A、MIC-10B或MIC-10C，用镍柱纯化重组蛋白。

抗重组蛋白MIC-10多克隆抗体，是由下述方法制备的：

用重组蛋白MIC-10免疫3月龄雌性家兔，皮下3点注射，免疫剂量500ug/只/次，间隔21d免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐剂，第2、3次采用弗氏不完全佐剂，最第三次免疫后21天，心脏放血，37℃放置1小时后，4℃过夜，次日3000转离心15分钟，取上清，用protein A层析柱纯化兔抗MIC10，按说明书进行。纯化后的IgG用PBS透析3次，用BCA法测定蛋白浓度，-80℃冻存；

所述的重组蛋白MIC-10为MIC-10A或MIC-10B。

一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒，它包括：包被抗体、生物素标记的检测抗体、阳性对照、洗涤液、封闭液、酶标亲和素、底物、终止液和样本稀释液，其特征在于：所述的包被抗体为兔抗重组蛋白MIC-10AIgG、检测抗体为兔抗重组蛋白MIC-10BIgG或包被抗体为兔抗重组蛋白MIC-10BIgG、检测抗体为免抗重组蛋白MIC-10AIgG；所述的阳性对照为重组蛋白MIC-10C；

所述的封闭液为含1％BSA、10％马血清的TBS，底物为TMB，终止液为2M硫酸。

一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒使用方法，它包括：

1)加入100μl纯化的5ug/ml兔抗重组MIC-10AIgG，包被ELISA反应板，4℃孵育过夜；

2)用TBST洗5次，每次5分钟；

3)每孔加入300μl封闭液封闭，37℃孵育30分钟；

4)用TBST洗5次，每次5分钟；

5)每孔加入100μl不同稀释度的待检血清样品，37℃孵育1小时；

6)用TBST洗5次，每次5分钟；

7)每孔加入100μl生物素标记的兔抗MIC-10BIgG，37℃孵育1小时；

8)用TBST洗5次，每次5分钟；

9)加入酶标亲和素，37℃孵育30分钟；

10)用TBST洗5次，每次5分钟，孵育10分钟；

11)每孔加入100ul底物，室温避光显色30分钟；每孔加入50ul 2M硫酸终止反应。

12)读板，记录OD值；根据标准曲线，计算待检血清样品中的MIC10含量；

所述的包被抗体为兔抗MIC-10BIgG、检测抗体为兔抗重组蛋白MIC-10AIgG。

本发明一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂及制备方法。弓形虫微线体蛋白10(MIC10)是弓形虫侵入宿主细胞时分泌的一种蛋白，对弓形虫的侵入和增殖具有重要的作用。本发明是对MIC10基因的不同区域扩增，插入表达载体PET28A中构建重组表达质粒，将重组表达质粒转入原核细胞进行表达，得到重组融合蛋白MIC10A、MIC10B和MIC10C，将纯化后的重组融合蛋白MIC10A、MIC10B分别免疫家兔，制备高效价的多克隆抗体。用纯化后的兔抗MIC10A IgG作为包被抗体，以生物素标记的兔抗MIC10B IgG作为检测抗体，以纯化的MIC10C作为标准抗原，以一定稀释倍数的人和动物的血清作为检测样本，建立双抗夹心ELISA，作为对弓形虫循环抗原的检测方法，具有很强的特异性、敏感性、可重复性、稳定性，y＝0.0304Ln(x)-0.0567，R²＝0.9643，最小检出量为50pg/ml。

附图说明

图1为MIC-10A和MIC-10B基因的PCR扩增鉴定结果，其中1：MIC10-A，2：MIC10-B。

图2为MIC-10A和MIC-10B重组质粒的酶切鉴定结果，其中1：MIC10-A，2：MIC10-B。

图3为重组蛋白MIC-10A、MIC-10B、MIC-10C与MIC10全长基因(其碱基序如SEQ IDNo.4所示)的关系图。

图4为双抗夹心ELISA方法的标准曲线。

具体实施方式

实施例1重组蛋白MIC-10A的制备

1)人工合成下述引物：

FW：GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTAC

RV：GATCAAGCTTTCATTCACGAAGTCCTCTTTTC

2)提取RH株弓形虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性2分钟，94℃变性50秒，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环，最后72℃延伸6min。，获得MIC-10A基因片段，见附图1，克隆到PMD-18T载体上，酶切鉴定，见附图2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

3)将MIC10A基因片段插入表达载体PET28A中构建重组表达质粒PET28A-MIC-10A；

4)将重组表达质粒PET28A-MIC10A转入BL21(DE3)中进行表达，得重组蛋白MIC-10A，用镍柱纯化重组蛋白。

实施例2重组蛋白MIC-10B的制备

1)人工合成下述引物：

FW：GATCGGATCCGCCGCTGAGCGTGAGGAGAAG

RV：GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG

2)提取RH株弓形虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性2分钟，94℃变性50秒，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环，最后72℃延伸6min，获得MIC-10B基因片段，见附图1，克隆到PMD-18T载体上，酶切鉴定，见附图2，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

3)将MIC10B基因片段插入表达载体PET28A中构建重组表达质粒PET28A-MIC-10B；酶切鉴定，见附图2；

4)将重组表达质粒PET28A-MIC-10A转入BL21(DE3)中进行表达，得重组融合蛋白MIC-10B，用镍柱纯化重组蛋白。

实施例3重组融合蛋白MIC-10C的制备

1)人工合成下述引物：

FW：GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTAC

RV：GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG

2)提取RH株弓形虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性2分钟，94℃变性50秒，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环，最后72℃延伸6分钟，获得MIC10C基因片段；克隆到PMD-18T载体上，酶切鉴定，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

3)将MIC10C基因片段插入表达载体PET28A中构建重组表达质粒PET28A-MIC-10C；

4)将重组表达质粒PET28A-MIC-10C转入BL21(DE3)中进行表达，得重组融合蛋白MIC-10C，用镍柱纯化重组蛋白。

实施例4抗MIC-10A和MIC-10B兔多克隆抗体的制备

免疫：分别用MIC-10A和MIC-10B免疫3月龄雌性新西兰大耳白兔，皮下3点注射，免疫剂量500ug/只/次，间隔21d免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐剂，第2、3次采用弗氏不完全佐剂，最后一次免疫后21天，心脏放血，37℃放置1小时后，4℃过夜，第2天3000转离心15分钟，取上清，-80℃冻存备用。

实施例5抗MIC10A和MIC10B兔多克隆抗体的纯化

用protein A(GE公司)层析柱纯化兔抗MIC-10AIgG和MIC-10B IgG，按说明书进行，纯化后的IgG用PBS透析3次，用BCA法测定蛋白浓度。

实施例6兔抗MIC-10B lgG的生物素化

将实施例5制得的兔抗MIC-10A或B IgG，用生物素标记，标记试剂盒采用Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit(Pierce，USA)，按说明书进行。

实施例7双抗夹心ELISA方法的标准曲线的建立

1.加入100μl纯化的兔抗MIC-10A(5ug/ml)IgG包被ELISA反应板，4℃孵育过夜；

2、用TBST洗5次，每次5分钟；

3、每孔加入300μl封闭液(1％BSA、10％马血清的TBS)，37℃孵育30分钟；

4.用TBST洗5次，每次5分钟

5.每孔加入100μl不同稀释度的MIC-10C(标准样品)，37℃孵育1小时；

6.用TBST洗5次，每次5分钟

7.每孔加入100μl生物素标记的兔抗MIC-10BIgG，37℃孵育1小时；

8.用TBST洗5次，每次5分钟；

9.加入酶标亲和素，37℃孵育30分钟；

10.用TBST洗5次，每次5分钟，孵育10分钟；

注：最后1次洗用TBS(不含Tween20)

11.每孔加入100ul底物(TMB)，室温避光显色30分钟；每孔加入50ul 2M硫酸终止反应。

12.450nm读板，记录OD值，绘制标准曲线，见图4。

通过实验证明，本方法测定的MIC10C浓度与吸光度值在50-5000pg/ml的范围存在明显的线性关系，相关系数R²＝0.9643，y＝0.0304Ln(x)-0.0567，最小检出量为50pg/ml。表明本方法具有很高的敏感性，完全满足检测临床样本的需要。

实施例8一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒

它包括：包被抗体、生物素标记的检测抗体、阳性对照、洗涤液、封闭液、酶标亲和素、底物(TMB)、终止液，所述的包被抗体为兔抗重组蛋白MIC-10AIgG、检测抗体为生物素标记的兔抗MIC-10BIgG或包被抗体为兔抗重组蛋白MIC-10BIgG、检测抗体为生物素标记的重组蛋白MIC-10A；所述的阳性对照为重组蛋白MIC-10C；

所述的封闭液为含1％BSA、10％马血清的TBS，底物为TMB，终止液为2M硫酸。

实施例9一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒使用方法

1)加入100μl纯化的兔抗MIC-10AIgG(5ug/ml)包被ELISA反应板，4℃孵育过夜；

2)用TBST洗5次，每次5分钟；

3)每孔加入300μl 1％BSA、10％马血清的TBS封闭，37℃孵育30分钟；

4)用TBST洗5次，每次5分钟

5)每孔加入100μl不同稀释度的待检血清样品，37℃孵育1小时；

6)用TBST洗5次，每次5分钟

7)每孔加入100μl生物素标记的兔抗MIC-10BIgG，37℃孵育1小时；

8)用TBST洗5次，每次5分钟；

9)加入酶标亲和素，37℃孵育30分钟；

10)用TBST洗5次，每次5分钟，孵育10分钟；

注：最后1次洗也可以用TBS(不含Tween20)

11)每孔加入100ul底物(TMB)，室温避光显色30分钟；每孔加入50ul 2M硫酸终止反应。

12)450nm读板，记录OD值；根据标准曲线，计算待检血清样品中的MIC10含量。

实施例10一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒使用方法

包被抗体为兔抗重组蛋白MIC-10BIgG、检测抗体为生物素标记的重组蛋白MIC-10AIgG，其它同实施例9。