抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体,杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒

摘要

本发明公开了一种抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒。该单克隆抗体是由保藏号为CCTCC C2010122的杂交瘤细胞分泌产生的，其效价和特异性高。研制成的抗原捕获ELISA试剂盒包含有包被有单克隆抗体的固相载体，辣根过氧化物酶标记的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体、酶的底物反应液、阳性和阴性对照、洗涤液和反应终止液。该试剂盒特异性和灵敏度高，操作简单，可用于大规模H3N2猪流感病毒的临床和实验室检测，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及其抗原捕获ELISA试剂盒。

背景技术

猪流感(swine influenza，SI)是甲型(A型)流感病毒引起的猪或人的一种急性、人畜共患呼吸道传染性疾病。属于正粘病毒科、A(甲)型流感病毒属，为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。A型流感病毒包含有16种血球凝集素蛋白(H1-H16)和9种神经氨(糖)酸苷酶蛋白(N1-N9)。目前最常见的亚型是H1N1，H1N2和H3N2，全世界很多新的病毒变种和亚型还在不断地被发现中。

猪流感的临床症状为体温突然升高(40-45℃)。猪流感能造成急性上呼吸道感染，典型特征是发热、嗜睡、厌食、体重减轻、呼吸困难，以及流涕、喷嚏、结膜炎，后期有咳嗽，有时还会出现流产。猪流感可继发细菌或病毒感染，严重时可导致呼吸衰竭(WorldOrganization for Animal Health[OIE].Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrialanimals[online]Paris；OIE；2008.Swineinfluenza.Availableat：http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/2008/df/2.08.08_SWINE_INFLUENZA.pdf.Accessed 7 Jan 2008)。某些毒株感染后，猪仅有轻微的或没有临床症状，发病率很高但死亡率低于1％-4％(Acha PN，Szyfres B(Pan American Health Organization[PAHO]).Zoonoses and communicable diseases common toman and animals.Volume 2.Chlamydiosis，rickettsioses and viroses.3rd ed.Washington DC：PAHO；2003.Scientific and Technical Publication No.580.Influenza；p.155-72)。此外，猪流感病毒也是猪免疫抑制的主要诱因之一，猪群感染猪流感病毒可引起猪繁殖能力减退，育肥猪增重减慢等(Choi Y K，Goyal S M，Joo H S.Prevalence of swine influenza virus subtypeson swine farms in the united states[J].Arch Virol，2002，147：1209-1220)。猪流感不仅给养猪业造成重大经济损失，还对人类健康造成威胁，因此研究快速、敏感、准确的猪流感诊断产品，具有重要的经济价值和公共卫生意义。

血清学调查和毒株监测研究发现，1999～2003年间我国东北、西北、华中、华东、华南及西南地区等20个省、市猪群大范围存在H3亚型流感病毒感染(李海燕，于康震，辛晓光，等.部分省市猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定[J]动物医学进展，2003，24(3)：67-72)，Sreta等研究了H1N1和H3N2亚型(泰国分离株)对断奶乳猪仔猪的致病力，发现这2种亚型均可诱导流感样症状和肺损伤(SRETAD，KEDKOVlD R，TUAMsANG S，etal.Patbogenesis of swine influenza rims(nlai isolates)in weanling pigs：an experimentaltrial[J]Virol J.2009.6(1)：34)，此病一旦暴发流行，很难将其控制和根除，因此及时准确地检测出SIV，对预防和控制猪流感暴发流行具有重大意义。

猪流感病毒抗原检测方法较多，到目前为止，国际上通用的猪流感抗原检测方法有鸡胚分离、荧光RT-PCR、RT-PCR等。病毒分离耗时长，同时存在生物安全隐患；RT-PCR和荧光RT-PCR方法对检测设备和人员专业知识要求较高、成本大，难以在普通实验室和基层开展，因此，研制一种直接检测样品中H3N2猪流感病毒的快速、便捷、适合现场使用的检测试剂盒具有很强的实用价值和广阔的应用前景，对猪流感的防控具有重要意义。

本发明制备了H3N2猪流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，并以此单克隆抗体为基础，建立起具有高度敏感性和特异性、操作简单的ELISA检测方法。该方法能快速、经济、高通量检测样品中H3N2猪流感病毒。

发明内容

本发明的目的之一是提供特异性抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B4。本发明另一目的是提供体外检测H3N2猪流感病毒的抗原捕获ELISA检测试剂盒，该试剂盒能对血液、组织和棉拭子等样品中H3N2猪流感病毒进行特异性检测，操作简单、敏感性高、特异性好。

本发明所提供的抗H3N2猪流感血凝素蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株2B4分泌产生的，该杂交瘤细胞株已于2010年12月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏号为CCTCC C2010122。

一种检测H3N2猪流感病毒的抗原捕获ELISA试剂盒，包含有包被有单克隆抗体的固相载体，辣根过氧化物酶标记的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体、酶的底物反应液、阳性和阴性对照、洗涤液和反应终止液；所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCCC2010122的杂交瘤细胞株产生的。

所述的辣根过氧化物酶标记的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体的制备过程如下：用昆虫杆状病毒表达系统表达的重组H3N2猪流感病毒的血凝素蛋白免疫雄性新西兰兔1mg/只，皮下多点注射，分别在0，3，6周共免疫3次；取血清纯化得抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体；再用辣根过氧化物酶标记。

所述的阳性对照为昆虫杆状病毒表达系统表达的重组H3N2猪流感表达血凝素蛋白溶液，浓度为100μg/mL，阴性对照为SPF鸡胚尿囊液100倍稀释液。

一种病毒含有多种抗原，一种抗原又可能含有多个抗原表位。因此，针对一种抗原可以获得不止一个抗体，但这些抗体对抗原的结合特性可能是不同的。为了找到能与抗原特异性结合的单克隆抗体，需要进行大量的反复比较、筛选和鉴定工作。本发明通过大量的工作，获得了能分泌特异性结合H3N2猪流感病毒血凝素蛋白的杂交瘤细胞株2B4；并在此基础上首次制备出体外检测H3N2猪流感病毒的抗原捕获ELISA检测试剂盒。该试剂盒特异性和灵敏度高，操作简单，可用于大规模H3N2猪流感病毒的临床和实验室检测，应用前景广阔。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、抗H3N2猪流感病毒特异性单克隆抗体的制备

本发明中单克隆抗体是利用杂交瘤技术来制备的，具体如下：

a.动物免疫

将经甲醛灭活的H3N2亚型猪流感病毒免疫Balb/c小鼠，进行3次免疫。

b.细胞融合

分离免疫小鼠的脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞株融合。

c.阳性杂交瘤细胞株筛选

加入小鼠腹腔饲养细胞与融合细胞共培养，并筛选阳性株。

d.有限稀释法克隆化筛选

利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到能稳定分泌抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白的杂交瘤细胞株。

本发明得到了一株能稳定分泌、特异性强的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白的杂交瘤细胞株，命名为2B4。

e.单克隆抗体的生产和纯化

本发明采用了2种方法进行单克隆抗体的生产，一是接种小鼠腹腔的方法生产单克隆抗体，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，最后用ProteinG预装层析柱纯化。二是按照常规的细胞培养方法。这2种方法均为单克隆抗体技术中常用的方法。

实施例2、H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒研制

一、H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒组成

本发明所述H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒组成为：已包被本发明所述单克隆抗体的固相载体即酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体、酶的底物反应液、阳性和阴性对照、洗涤液和反应终止液。

1)ELISA条板包被抗H3N2猪流感单克隆抗体

用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6)将纯化的本发明所述单克隆抗体稀释至浓度为10μg/mL，包被96孔EIA/RIA高效结合酶标板(美国Corning公司)，100μL/孔，4℃过夜。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干。用PBST稀释脱脂奶粉至终浓度5％作为封闭液，每孔加入该封闭液100μL，37℃封闭1h。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干，干燥后真空密封保存。

25×PBST的配制：

NaCl：100.0g，KCl：0.2g，MCI₂·6H₂O：2.5g，KH₂PO₄：5.0g，Na₂HPO₄：28.5g，tween-20：12.5mL，硫柳汞：2.5g，用蒸馏水定容至1000mL，加入0.02％叠氮纳作为防腐剂，除菌过滤后分装。

2)抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体及标记

用昆虫杆状病毒表达系统表达的重组H3N2猪流感病毒的血凝素蛋白免疫雄性新西兰兔。1mg/只，皮下多点注射，分别在0，3，6周共免疫3次。取血清纯化得抗H3N2猪流感病毒血凝素蛋白多克隆抗体。采用“简易过碘酸钠法”用辣根过氧化物酶标记该多克隆抗体。

1.称取6mg HRP溶解于蒸馏水中。

2.于上液中加入0.2mL新鲜配制的0.1mol/L NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20min。

3.将上述溶液装入透析袋中，对0.001mol/L，pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。

4.加20μL 0.2mol/L、pH9.5碳酸盐缓冲液，使溶液pH上升至9.0～9.5，立即加入1mL多抗(约5mg)溶液，室温避光搅拌2h。

5.加0.1mL新配的4mg/mLNaBH₄液，混匀，置4℃2h。

6.将上述液装入透析袋中，对0.15mol/mL pH7.4PBS透析，4℃2h。

7.取出透析袋，置PEG8000干粉中浓缩袋内液体至5mL，吸出，-20℃保存。

3)底物

采用3，3，5，5-四甲基联苯胺(SIGMA公司)作为辣根过氧化物酶的底物。以0.5％过氧化脲为氧化剂。

4)阳性和阴性对照

阳性对照：昆虫杆状病毒表达系统表达的重组H3N2猪流感病毒的血凝素蛋白，浓度为100μg/mL。

阴性对照：SPF鸡胚尿囊液100倍稀释液。

5)洗涤液

如前述PBST配制。

6)反应终止液

用三蒸水配制2mol/L H₂SO₄溶液。

二、H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒的使用方法

1)样本处理

组织样本用PBS研磨，取上清备用。棉拭子样本加入适量PBS后振荡，离心取上清。

2)加入对照和待测样本：取待测样本100μL加入相应酶标孔，阳性和阴性对照孔分别加100μL阳性和阴性对照，敲击已加样板的一侧，以确保样品均匀覆盖孔底。加样后的酶标板置湿盒中37℃孵育1h，然后用PBST洗板3次，甩干。

3)加酶标多克隆抗体：加入酶工作液(配制方法：以PBST稀释酶标抗体，稀释倍数1∶1000)，100μL/孔，湿盒中37℃孵育1h，取出后PBST洗板3次，甩干。

4)加底物液显色：100μL/孔，室温避光5～15min。

5)终止：用2mol/LH₂SO₄终止显色反应，50μL/孔。

6)测450nm值：酶标板置酶标仪上测定450nm值。

7)结果判定

按上述方法，对30份阴性尿囊液进行了检测。按照公式临界值＝阴性OD平均值+3×标准差，计算得阴阳临界值为：0.104。待检样本OD值大于0.104的判为阳性，否则判为阴性。

实施例3H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒的特异性和敏感性测定

1)特异性测定(以下实验材料均经56℃30min灭活处理)

为了验证本发明的H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒的特异性，按照实施例2对2株新城疫病毒样本(1、2号)、3株H1N1病毒样本(3、4、5号)、1株H5N1病毒样本(6号)、1株H7N1(7号)和1株H9N2病毒样本(8号)进行了检测。结果表明，本发明试剂盒对上述蛋白样本的检测OD值在0.056～0.093之间(表1)，显示出良好的特异性。

表1试剂盒的特异性检测

2)敏感性测定

将H3N2病毒尿囊液连续2倍稀释，得到2²～2^-2个HA单位，然后按实施例2进行检测。结果表明本发明试剂盒能检测到2^-1个HA单位的抗原(表2)。

表2试剂盒敏感性测定

实施例4H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒对临床样本的检测

利用本发明H3N2猪流感病毒血凝素蛋白捕获ELISA检测试剂盒，对本发明人所在单位的1390份猪鼻腔棉拭子进行了检测，检出阳性样本数6份(表3)。提取这6份样本RNA采样荧光RT-PCR方法进行确认，其荧光RT-PCR检测结果也为阳性，符合率为100％。

表3临床样本检测