檀香种胚苗茎段的离体快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种檀香的种胚苗茎段离体快速繁殖方法，涉及植物组织培养方法，具体步骤是(1)将檀香种子置于果胶酶和纤维素酶溶液中进行酶解、杀菌处理，然后取出种子，无菌条件下分离种胚并进行培养，获得无菌种胚苗；(2)切取种胚苗茎段，诱导腋芽成苗，再以该成苗的茎段继续增殖，10～12代扩大繁殖茎段苗数量；(3)利用AgNO

说明书

技术领域

本发明属于植物组培养技术领域，特别涉及檀香种胚苗茎段的离体快速繁殖方法。

背景技术

檀香(Santalum album L.)别名叫白檀，檀香属、檀香科，生长于热带地区，主要生产于印度、印度尼西亚、越南、澳大利亚等热带地区国家。檀香木是一种名贵的药材，其药用部位为树干的心材。具有行心温中、开胃止痛的功效。主治寒凝气滞、冠心病、心胶痛、腹痛、胃痛少食、性病等，可以消炎、抗菌、抗痉挛、催情、收敛、镇咳、清热润肺、祛胃胀气、利尿、治疗皮肤病、止血崩。近年的研究发现，它还可以抑制癌细胞的生长。檀香木除了是名贵药材，还是一种贵重、稀缺的工业原料，在全世界范围内被广泛地运用于精油提炼；工艺品雕刻；医药行业；宗教用品加工业；化妆品；日用品；保健食品等行业。主要的檀香木需求国是美国和英国，大约占了所有出口檀香的75％，其余还有中国(包括台湾、香港)、法国、南非、苏联、中东、马来西亚、日本等，以及印度、印度尼西亚、澳大利亚三个出口大国的本土。据统计，仅中国每年进口的各类檀香木达到3100吨以上，其它国家更数倍于这个数量。而全球需求最甚的印度优质檀香却每年生产量不超过1400吨，主要供印度本国使用。自1900年到现在的100多年，檀香木的成交价一直处于持续上涨趋势，现今已达到300-600元/公斤。我国从印度引进该树种后，为了扩大繁殖，多年来采用组织培养技术繁殖种苗，但由于现今技术还没有完善，特别是幼苗生根问题上没有得到很好的解决，不能达到规模生产的要求，而种子国外又严格限制出口，种苗不能保证，造成我国檀香树种严重缺乏，市场上檀香奇贵，“一串檀香一串金”成为目前檀香的世界行情走势。

专利申请号为200710032982.2的中国专利公开了一种檀香的组织培养快繁方法，本发明以檀香树嫩芽为外植体，通过不定芽的诱导阶段、丛芽繁殖阶段、生根阶段和移栽阶段，调配和优选培养基配方和培养条件，完成了檀香的组织培养技术。但该发明生根率极低，且在我们试验过程中，相关的生根培养基和方法都使用过，不仅生根率低，且生根培养过程还会出现茎段苗大量落叶的反常情况，因此生根率成了该方法的瓶颈技术，该方法很难达到檀香种苗产业化生产要求。

专利申请号为200910040708.9的中国专利公开了一种用檀香树种子胚离体快速育苗的方法，本发明取檀香种子胚在试管中直接培养成苗，但是檀香种壳坚硬，在无菌条件下脱种壳分离檀香的种胚非常困难，且国外限制种子出口也给种子引进带来了难度，因此该方法同样很难实现檀香种苗的规模生产和可持续发展。

专利申请号为200910040709.3的中国专利公开了一种檀香苗的快速繁育方法，其方法是取檀香种子，浸于0.3～0.5％高锰酸钾溶液消毒5～10分钟；后取出种子浸于100ml.L^-1的赤霉素水溶液中，超声处理3～15分钟，种子继续浸泡10～15min后，再温水浸泡10～15min无菌水冲洗，再播种催芽。该方法虽然解决了播种出芽率的问题，但是种子限制进口给檀香育苗及产业化生产带来了非常大的困难。

找到真正能够解决檀香组织培养生产技术，突破技术瓶颈(如檀香试管苗生根率、移栽成活率等)是发展我国檀香产业而不需要依赖国外资源的最有效办法。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的是提供一种檀香种胚苗茎段的离体快速繁殖方法，在檀香组织培养技术的研究过程中，通过以少量檀香种子为材料，无菌条件下分离种胚培养，获得无菌种胚苗；然后切取檀香种胚苗茎段，诱导腋芽成苗，多次继代扩大繁殖种苗数量；通过调节檀香的生理状态，促进檀香茎段基部形成层的产生，促进细胞分化，诱导生根，突破了檀香组织培养瓶颈技术；通过栽培附生植物，提高了檀香苗的移栽成活率，从而完成檀香组织培养的全部生产技术路线。本发明有效解决了檀香苗的生根率低的难题和檀香苗规模化生产问题，解决了檀香组织培养生产的瓶颈技术。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种檀香的种胚苗茎段离体快速繁殖方法，包括如下步骤：

(1)种胚成苗：将檀香种子置于果胶酶和纤维素酶溶液中进行酶解、杀菌处理，然后取出种子，无菌条件下分离种胚并进行培养，获得无菌种胚苗；

(2)茎段苗增殖：切取种胚苗茎段，诱导腋芽成苗，待腋芽长成5～6厘米高健壮小苗时，再以该成苗的茎段继续增殖，10～12代扩大繁殖茎段苗数量；1.5～2个月后新的茎段苗长成，茎段苗高7～8cm，10个以上的节(叶片)，这样不断地采用茎段增殖方式，2个月的增殖系数为5以上。

(3)利用AgNO₃溶液+IBA溶液调节檀香茎段苗的生理与诱导生根，促进茎段苗细胞分化和根系发生，以获得生根苗；

(4)生根苗先后经温室炼苗、室外移栽，得到成活的檀香苗。

所述步骤(1)中所述酶解、杀菌处理是将种子置于1％(质量百分比)果胶酶+3％(质量百分比)纤维素酶的酶液中水解后，再用8％(体积百分比)次氯酸钠对种子消毒10分钟，无菌水冲洗后吸干。

步骤(1)中所述无菌条件下分离种胚并进行培养，是先用无菌的手术刀片切开种壳，取出种胚，然后接种于MS+10～15％(体积百分比)椰子水的培养基上培养，其中培养条件为：白天光照10～12h，光强2000～2500lux，温度25±1℃，促进种胚形成健壮种胚苗。

步骤(2)中所述诱导腋芽成苗是将长成的种胚苗茎段按照2个节剪成一段，插入MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.5～1.5mg.L^-1+NAA(萘乙酸)0.1～1mg.L^-1的培养基上培养，培养条件为：光照3000Lux、光照时间12～14h、温度25±1℃。

步骤(3)中所述调节生理与诱导生根的具体步骤是切取苗高5厘米以上的檀香茎段苗，将其基部浸入2％～5％(质量百分比)AgNO₃溶液+500～1000ppmIBA(吲哚丁酸)溶液，时间为1～5min，再接入1/2MS(MS基本培养基的大量元素减半，其中大量元素指硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化钙)+IBA 0.2～1mg.L^-1的生根培养基上培养。通过AgNO₃+IBA调节檀香苗生理状态，防止茎段苗落叶，促进形成层分生组织的产生，促进根原基形成和根系的产生。培养30～35天后可以观察到，茎段基部明显增大，并出现褐色的木栓化组织；45～56天后，茎段苗在生根培养基上长出根系。而未经过AgNO₃+IBA附加处理的檀香茎段苗，接入生根培养基10天后出现严重落叶，30天后茎段苗落叶率70％以上，个别出现光杆现象；在茎段苗基部未发生膨大和木栓化现象。70天后统计，生根率为0％。

步骤(4)中所述温室炼苗是将生根苗置于自然光下锻炼，光照由4000Lux逐步增强，15天时增强至6000Lux，此时往培养基中加入自来水，24h后取出生根苗移栽。

步骤(4)中所述室外移栽是将檀香生根苗与青蒿种于同一栽培基质中，青蒿作为该苗的附生植物。

所述栽培基质为泥炭土、河沙、蛭石以体积比3∶2∶1的比例混合，调节栽培基质的pH＝5.5～5.8。

所述室外移栽的条件：遮荫保持光照3000～4000Lux，7～10天后，根据檀香苗恢复生长情况，逐步增强光照，30天后增加至全日光照。

所述室外移栽是先将青蒿播种于栽培基质中，待青蒿成活后，再将檀香生根苗植入种有青蒿的栽培基质中，该移栽方法更有利于提高檀香苗的移栽成活率。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

(1)使用种胚材料少，繁殖系数高，2个月繁殖系数为5以上，一个种胚经过一年繁殖，约生产出5⁶棵(15625棵)茎段苗，较高繁殖系数使后续的檀香产业化生产成为可能。

(2)通过使用AgNO₃溶液+高浓度的IBA溶液，使种胚苗生理状况发生改变，抑制了生根过程中种苗落叶现象(落叶是檀香种胚苗生根过程中常见现象，落叶表明檀香苗生理状态异常，不能正常生根)，刺激发生形成层分生组织(同时也伴随基部膨大和木栓化组织产生)，诱导了茎段苗生根，生根率达到83％以上，突破了种胚苗组织培养的瓶颈技术，使组织培养技术能够有效应用于檀香苗生产。

(3)移栽成活率高，先栽培青蒿作为檀香的附生植物，后栽培檀香苗，使檀香苗移栽成活率达到95％以上，而直接移栽的成活率低于3％。由此可见，以青蒿作为檀香苗的附生植物，对于提高檀香苗的移栽成活率起了至关重要的作用。

(4)完成了由檀香种胚苗、茎段苗增殖、高效生根到室外移栽等关键技术，完成了培养基配方优化(参见下表1、2)，实现了檀香组织培养高效生产技术，达到了檀香苗规模化生产。

表1培养基配方及效果列表

表2本发明的檀香组织培育技术的与现有的檀香组织培养技术对照表

附图说明

图1是檀香组织培养的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

檀香种胚苗茎段的离体快速繁殖方法如图1，包括如下步骤：

(1)种胚成苗：取少量成熟的檀香果实(购自广东南药基地)，清水洗净，用0.1％HgCl₂浸泡消毒10分钟，将檀香果实取出，用无菌水冲洗后无菌滤纸吸干。用手术刀片将檀香果实切开，取出种子。置于50毫升1％果胶酶(sigma公司，美国产)+50毫升3％纤维素酶R-10(Onoznka，日本产)酶液中(pH5.0)30℃条件下水解24h，取出种子，无菌水冲洗吸干，再用8％次氯酸钠消毒10分钟，无菌水冲洗后吸干。用无菌的手术刀片切开种壳，取出种胚，置于MS+10％椰子水的培养基上。在白天光照12h、光强2000～2500lux，昼夜温度25±1℃的培养室内培养。6天后种胚转绿，12天后伸出胚芽，增强光照至4000lux，35天后形成健壮小苗，约5～6厘米高，5～6片叶小苗。

(2)茎段苗增殖：将长成的种胚苗按照2个节剪成一段，插入培养基为MS+6-BA 0.5mg.L^-1+NAA 0.1mg.L^-1的培养基上，置于光照3000lux、光照时间14h、温度25±1℃的培养室内培养。10天后腋芽100％萌发，50％茎段上下位两节位腋芽均萌发，45天后，腋芽长成平均5.6cm高的健壮小苗，平均7个以上的节；2个月苗平均苗高7.8cm，平均10个以上的节。再以长成的茎段苗增殖，2个月茎段苗增殖系数达到5以上。

(3)调节生理与诱导生根：将苗高5厘米以上的檀香茎段苗基部浸入2％AgNO₃+500ppm的IBA溶液1min，再接入1/2MS+IBA 0.2mg.L^-1的生根培养基上培养，光照3000lux、光照时间14h，培养室温度25±1℃。35天后苗基部明显膨大，出现黄褐色的木栓化现象，45天后有根产生，55天后根伸长5cm以上，70天后有侧根产生。70天经过统计，接入的100个茎段苗，生根率(生根苗棵数/接入的茎段苗数×100％)为86％，平均根数2.2条，根长约5～6cm(根在培养基中弯曲生长，不便测量)；侧根发生率(发生侧根的棵数/发生根的茎段苗数×100％)为100％，平均侧根数为3.5条。

(4)温室炼苗与室外移栽成株：70天后将檀香生根苗进行炼苗，光强调节采用不同遮光率的荫网进行调节。光照由第一天的4000lux逐步增强，每5天增强光照1000lux，15天后增强至6000Lux。在培养基上加入自来水少许，24小时后取出檀香生根苗进行移栽。与此同时，在檀香生根苗进入温室炼苗前10天，在营养钵中播种青蒿种子(购自上海景青生物有限公司)，采用青蒿作为檀香生根苗栽培的附生植物，栽培基质为泥炭土∶河沙∶蛭石＝3∶2∶1(体积比)混合，栽培基质的pH＝5.5，每个营养钵内均匀种植4～5棵青蒿。青蒿成苗后，将炼苗后的檀香生根苗栽种于青蒿之间。浇透水后，再次用95％的荫网进行遮光，保持空气湿度在85～95％之间，2～3天往栽培基质撒少量水以保持土壤湿润；12天后，可见移栽的檀香苗长出新叶，早晨新叶尖挂有小水珠，再换用70％荫网进行遮光，降低湿度至60～75％，并开始施用2000倍(质量百分比)花宝1号(从广州大汉园艺有限公司购进)营养液，1次/周；22天后增强光照，采用70％荫网在中午时段(11:00～15:00点)进行遮光，其它时间段采用完全自然光照，此时施用1500倍花宝1号营养液，1次/周。30天后转入全自然光照下栽培。在光照增强过程中，根据土壤情况，每1～2天浇透水一次。通过上述炼苗与移栽步骤，2个月统计，移栽100株，成活96株，成活率(成活棵数/移栽棵数×100％)为96％。

实施例2

檀香种胚苗茎段的离体快速繁殖方法如图1，包括如下步骤：

(1)种胚成苗：同实施例1。

(2)茎段苗增殖：将长成的种胚苗按照2个节剪成一段，插入培养基为MS+6-BA1.5mg.L^-1+NAA 1mg.L^-1的培养基上。置于光照3000lux、光照时间14h、温度24℃的培养室内培养。8天后，100％的茎段萌发腋芽，其中35％的茎段上下位两节位腋芽均萌发。45天后，腋芽长成平均6.2cm高的健壮小苗，平均7.8个节(叶片)；2个月平均苗高8.1cm，平均11.2个节(叶片)。再以长成的新茎段增殖，2个月的增殖系数为5.5以上。

(3)调节生理与诱导生根：将苗高5厘米以上的檀香茎段试管苗剪下，将其基部浸入5％AgNO₃+1000ppmIBA溶液2min，然后接入1/2MS+IBA0.2mg.L^-1的生根培养基上。30天后苗基部明显膨大，出现黄褐色的木栓化现象，45天后有根产生，65天后根伸长5.5cm以上，并伴随有侧根产生。70天经过统计，接入的100个茎段苗，生根率为83％，平均根数2.5条，根长约6～7cm(根在培养基中弯曲生长，不便测量)；侧根发生率为100％，平均侧根数为3.3条。

(4)温室炼苗与室外移栽成株：70天后将生根的试管苗在温室中炼苗，炼苗方法同实施例1。在试管苗移栽时，将青蒿与檀香试管苗同时栽培，栽培基质为泥炭土∶河沙∶蛭石(3∶2∶1，pH5.8)。用95％的荫网进行遮光，保持空气湿度在85～95％之间，15天后，50株(占60％)的檀香苗长出新叶，再换用70％荫网进行遮光，降低湿度至60～75％，并开始施用2000倍花宝1号营养液，1次/周。22天后增强光照，采用70％荫网在中午时段(11:00～15:00点)进行遮光，其它时间段全自然光照，此时施用1500倍花宝1号营养液，1次/周。30天后转入全自然光照下栽培。浇水方法同实例1。通过上述炼苗与移栽步骤，2个月统计，移栽83株，成活72株，成活率为86.7％。本次移栽说明青蒿对檀香试管苗移栽成活有密切关系。

实施例3

檀香种胚苗茎段的离体快速繁殖方法如图1，包括如下步骤：

(1)种胚成苗：同实施例1。

(2)茎段苗增殖：将长成的种胚苗按照2个节剪成一段，插入培养基为MS+6-BA 1.0mg.L^-1+NAA 0.5mg.L^-1的培养基上。置于光照3000lux、光照时间14h、温度26℃的培养室内培养，10天后100％茎段萌发腋芽，65％茎段上下两节位均萌发腋芽，45天后，腋芽长成平均5.0cm高的健壮小苗，平均6.5个节(叶片)；2个月苗平均苗高7.3cm，平均9.5个节(叶片)。由于萌发的腋芽数量增加，再以新长成的茎段增殖，2个月的增殖系数为6以上。

(3)调节生理与诱导生根：剪下苗高5厘米以上的檀香试管苗茎段，将试管苗基部浸入3％AgNO₃+750ppm的IBA溶液3min，然后接入1/2MS+IBA0.5mg.L^-1的生根培养基上。32天后苗基部明显膨大，出现黄褐色的木栓化现象，53天后有根产生，65天后根伸长5cm以上，同时有侧根产生。70天统计，接入的100个茎段苗，生根率为85％，平均根数2.4条，根长约5～6cm(根在培养基中弯曲生长，不便测量)；侧根发生率为100％，平均侧根数为3.3条。

(4)温室炼苗与室外移栽成株：70天后将生根的试管苗在温室中炼苗，炼苗与移栽管理方法同实施例1。移栽85株，2个月统计成活81株，移栽成活率为95.3％。

实施例4

檀香种胚苗茎段的离体快速繁殖方法如图1，包括如下步骤：

(1)种胚成苗：同实施例1。

(2)茎段苗增殖：同实施例1。

(3)调节生理与诱导生根：剪下苗高5厘米以上的檀香试管苗茎段，将试管苗基部浸入5％AgNO₃+1000ppmIBA溶液5min，然后接入1/2MS+IBA1mg.L^-1的生根培养基上。35天后苗基部明显膨大，出现黄褐色的木栓化现象，56天后有根产生，68天后根伸长5cm以上，70天后有侧根产生。经过统计，接入的100个茎段苗，生根率(生根苗棵数/接入的茎段苗数×100％)为85％，平均根数2.2条，根长约5～6cm(根在培养基中弯曲生长，不便测量)；侧根发生率(发生侧根的棵数/发生根的茎段苗数×100％)为100％，平均侧根数为3.5条。

(4)温室炼苗与室外移栽成株：炼苗方法同实施例1，炼苗15天后，打开瓶盖，加入自来水，24小时后取出生根苗进行室外移栽，移栽管理方法与实施例1相同(以青蒿作为檀香苗的附生植物)。移栽87株，2个月统计成活83株，移栽成活率为95.4％。

实施例5

本实施例与实施例2的不同之处在于，步骤(4)采用了与实施例1相同的移栽管理方法(在青蒿成活后，再将炼苗后的带根檀香种胚苗栽种于青蒿营养钵中的情况)。移栽90株，2个月统计成活86株，移栽成活率为95.6％。

本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。