由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法

摘要

本发明涉及一种由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法，首先将被测小麦品种或品系的种子消毒后在培养皿中发芽，然后接种活化后的禾谷镰刀菌；将接种禾谷镰刀菌的小麦种子铺在灭过菌的湿纸巾中，包裹后在避光条件下保湿培养1～3天，然后在自然光照条件下自然生长11～13天，形成幼苗，在自然生长期间，当纸巾的表面包裹层出现干燥时，将纸巾的端缘置于蒸馏水中浸泡；最后对幼苗的根颈腐病进行鉴定，结果作为被测小麦品种或品系对禾谷镰刀菌引起的根颈腐病的病情指数。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物的病害抗性鉴定方法，尤其是一种由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法，属于植物保护技术领域。

背景技术

镰刀菌的多个小种可导致小麦赤霉病(Fusarium Head Blight，简称FHB)和根颈腐病(Crown Rot，简称CR)的发生，是影响小麦生产的主要致病菌之一。由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌等侵染小麦穗部而引起的小麦赤霉病，是温暖多雨和气候湿润地区小麦的重要病害，主要流行于加拿大、美国、南美洲、欧洲、非洲南部地区和中国，已成为一种世界性小麦病害。我国是全球小麦赤霉病受害面积最大的国家，长江中下游冬麦区和东北春麦区是赤霉病的主要发生地区，每年受害面积超过700万hm²，禾谷镰刀菌是导致目前小麦赤霉病流行的优势镰刀菌种，近年来受到全球环境变化的影响，赤霉病有向黄淮流域及其他地区蔓延的的趋势。

研究表明，许多引起小麦赤霉病的镰刀菌如黄色镰刀菌(F.culmorum)、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、锐顶镰刀菌(F.acuminatum)也能引起小麦根颈腐病，其中尤其以禾谷镰刀菌致病性最强，小麦根颈腐病在澳大利亚、欧洲、北美洲、南美洲、西亚、北非和南非等地区等小麦种植地区发病严重，可导致小麦植株矮小、分蘖减少、籽粒皱瘪甚至不结实而引起产量损失，已经受到当地小麦遗传育种和病理学者们的广泛关注(Mitter等，Plant Pathology，2006，55：433-441)。美国小麦根颈腐病主要发生于气候较温暖的爱达荷州、俄勒冈州、华盛顿州、科罗拉多州、怀俄明州以及德克萨斯州等西北太平洋各州。在澳大利亚，禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌(F.pseudograminearum)是引起小麦赤霉病和根颈腐病的主要致病菌，根颈腐病是是仅次于叶枯病的第二大病害，在昆士兰州、新南威尔士州、南澳、西澳尤为严重，普通小麦产量一般损失30％-70％，硬粒小麦(durum wheat)品种均不抗此病，每年由小麦根颈腐病引起的损失超过6000万澳元；在环境条件适宜的同一块田中，赤霉病和根颈腐病可以同时发生(Mitter等，Plant Pathology，2006，55：433-441)。在我国小麦赤霉病流行的部分地区，如长江中下游冬麦区，具备小麦根颈腐病发生的条件，已发现由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病植株。同时，近年来我国镰刀菌引起的小麦赤霉病有向黄淮冬麦区蔓延的趋势，发生的频率和严重度日趋加大，黄淮麦区小麦生育后期的气候条件有利于根颈腐病的发生，因此，应重视和加强由镰刀菌引起的小麦根颈腐病的相关研究。

筛选根颈腐病抗源，是进行根颈腐病抗性遗传研究和新品种选育的前提条件，而简便有效的小麦根颈腐病抗性鉴定技术体系的建立是进行抗病种质资源筛选和分子遗传研究的关键。目前，已报道的小麦禾谷镰刀菌根颈腐病抗性鉴定方法，主要分为人工接种和病圃自然接种。大多数人工接种方法，在种子或苗期进行接种，在成株期对发病情况进行评价。病圃自然接种是在成熟期进行病害评价。

Dodman等(Inoculation methods for assessing resistance in wheat to crown rot caused by Fusarium gramineum group 1，Australian Journal of Agricultural Research，1987，38：473-486)报道了小麦根颈腐病鉴定的三种方法，即种子接种、土壤接种和茎基部接种。种子接种方法的发病率和严重度均较低，同时该方法引起出苗率降低。土壤接种主要带菌土壤直接接种，或小麦出苗以后用带菌的籽粒洒在土壤表面或播种沟中，该方法的发病率和严重度都较高。茎基部接种主要有两种类型，一是将孢子液喷洒在植株茎基部，抗病品种的抗侵入性明显好于感病品种；二是将孢子液注射在茎基部，该方法抗病品种与感病品种的抗侵入性没有明显差异。Wallwork等(Resistance to crown rot in wheat identified through an improved method for screening adult plants.Australasian Plant Pathology，2004，33：1-7)报道了种子在带菌土壤中接种、成株期进行抗性鉴定方法(带菌土壤接种法)，该方法鉴定周期较长，所需的空间较大，在成熟期对病害进行评价。Mitter等(A high-throughput glasshouse bioassay to detect crown resistance in wheat germplasm.Plant Pathology，2006，55：433-441)报道了在苗期将孢子悬浮液滴在茎基部，接种后35天进行抗性鉴定的方法，将它称之为孢子悬浮液点滴接种法，该方法不易于操作，接种在植株基部的孢子悬浮液容易滑落。Li等(A simple method for the assessment for crown rot disease severity in wheat seedlings inoculated with Fusarium pseudograminearum.Journal of Phytopathology，2008，156(11-12)：751-754)报道了一种根颈腐病的土壤接种方法(发芽种子接种法)，将接种过的发芽种子种植于装有灭菌土壤的塑料钵中，在温室或人工气候室中生长，当植株出现萎蔫症状时进行浇水，接种后35天进行病害严重度评价。

Wallwork、Mitter和Li等报道的上述方法，均在苗期或种子进行接种，成株期进行抗性评价，Li等的接种方法比Mitter和Wallwork等的方法更容易操作。同时，Li等的方法发病的严重度比较高，病害严重度与田间成熟期病害表现相关性较好。这几种方法从接种到抗性评价所需的时间均较长(35天以上)，表现出来的抗性均为成株期抗性，同时需要土壤进行接种或生长，工作量较大。因此在根颈腐病抗性鉴定中，迫切需要开发、建立一套简便、有效、快速的小麦根颈腐病抗性苗期鉴定技术体系，在环境可控条件下，采用合适的接种方法、合理的病情评价标准研究品种之间的抗性差异，在较短的时间内对大批材料进行鉴定，为快速高效的根颈腐病抗病育种和遗传研究奠定基础。

针对由禾谷镰刀菌引起的根颈腐病在小麦苗期进行抗性鉴定，目前未见报导。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前由小麦禾谷镰刀菌引起小麦根颈腐病抗性鉴定存在的容易受到环境条件影响，基本上是通过种子、土壤、苗期接种，存在发病不充分、鉴定时间长、工作量大等一系列问题，提供一种针对由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法。

本发明的目的是这样实现的：一种由禾谷镰刀菌引起的小麦根颈腐病苗期抗性鉴定方法，其特征在于：首先将被测小麦品种或品系的种子消毒后在培养皿中发芽，然后接种活化后的禾谷镰刀菌；将接种禾谷镰刀菌的小麦种子铺在灭过菌的湿纸巾中，包裹后在避光条件下保湿培养1～3天，然后在自然光照条件下自然生长11～13天，形成幼苗，在自然生长期间，当纸巾的表面包裹层出现干燥时，将纸巾的端缘置于蒸馏水中浸泡；最后对幼苗的根颈腐病进行鉴定，结果作为被测小麦品种或品系由禾谷镰刀菌引起的根颈腐病的病情指数。

在本发明中：活化后的禾谷镰刀菌是指：将禾谷镰刀菌菌种置于PDA固体培养基上活化，培养后以血球计调节菌液浓度至1×10⁶个孢子/mL；种子消毒是指：将被测小麦品种或品系的种子用1％NaClO溶液中消毒2min后，再用无菌水冲洗3次；培养皿中发芽是指：在垫有两层湿滤纸的培养皿中于22℃温度条件下发芽；接种活化后的禾谷镰刀菌是指：当芽长达4～6mm时，在含有体积比为0.1％的Tween 20、浓度为1×10⁶个孢子/mL的禾谷镰刀菌悬浮液中接种2min。

在本发明中：将禾谷镰刀菌菌种置于PDA固体培养基上活化是指：将禾谷镰刀菌菌种置于1/4强度PDA固体培养基上活化；1/4强度PDA固体培养基是由10g马铃薯葡萄糖琼脂粉，15g琼脂粉，加入1L蒸馏水，121℃高压灭菌20min后形成的。

在本发明中：所述的将接种禾谷镰刀菌的小麦种子铺在灭过菌的湿纸巾中，包裹后在避光条件下保湿培养是指：将灭菌过的纸巾平铺在经过消毒处理塑料盘上，用蒸馏水使其湿润，将已经接种禾谷镰刀菌的10粒相同品种或品系的小麦种子呈直线形状铺在纸巾上，芽的生长方向一致且指向纸巾边缘，芽与纸巾边缘的距离为1.8～2.5cm，将纸巾沿种子的排列方向从一端向另一端卷起来，放入避光的泡沫盒中，加入蒸馏水使纸卷充分湿润，在22℃环境下进行保湿培养；所述的在自然光照条件下自然生长是指：在22℃、每天自然光照12h条件下生长，在自然生长期间，当纸巾的表面包裹层出现干燥时，将种子根际一端的纸巾的端缘置于蒸馏水中浸泡10s；所述的对幼苗的根颈腐病进行鉴定，是以每张纸巾的10粒被测种子为一个重复，每个品种或品系的被测小麦种子的鉴定至少基于平行试验的三个重复的检测结果。

在本发明中：对幼苗的根颈腐病进行鉴定中，按病害严重度将病级分为0-5级，其中：

0级为叶鞘无发病症状；

1级为第一叶鞘病斑长度小于1.0cm；

2级为第一叶鞘病斑长度1.0-2.0cm；

3级为第一叶鞘病斑长度大于2.0cm，幼苗未出现萎蔫病症；

4级为幼苗出现萎蔫病症；

5级为幼苗死亡；

病情指数＝[∑(病情级别×该级株数)/(调查总株数×最高病级)]×100；

以同品种或品系的被测小麦种子中平行试验的各重复的病情指数的平均值作为该小麦品种或品系的最终鉴定的病情指数；

病情指数的标准为7个级别：免疫的指数为0；高抗HR的指数为＜20；抗R的指数为20.01～40.0；中抗MR的指数为40.01～60.0；中感MS的指数为60.01～70.0；感S的指数为70.01～80.0；高感HS的指数为80.01～100.0。

本发明的优点在于：(1)鉴定周期短，从接种到病害评价，约为15天，相对于种子直接接种、发芽种子接种、土壤带菌接种、苗期点滴接种等方法(一般需35-60天)，大大缩短了试验周期，因而可以在一定的时间内，对大批小麦材料进行苗期抗性鉴定。(2)该方法从接种至病害评价均处于苗期阶段，是一种鉴定小麦根颈腐病苗期抗性的方法。(3)实验所需的空间小，接种后，在敞口的塑料盒或泡沫盒中继续生长，直至进行病害评价。(4)不需要土壤，减少因土壤灭菌和接种而带来的工作量。(5)在实验室、温室、人工气候室等环境条件下均可操作。(6)该方法获得的抗性鉴定结果与田间病圃鉴定结果的吻合度高。

附图说明

图1是将接种后的被测小麦种子在纸巾中排列包裹的照片；

图2是纸巾展开，观察幼苗发病情况的的照片。

具体实施方式

实施例1

被鉴定品种：选用从澳大利亚引进的17份小麦品种或品系，它们因禾谷镰刀菌引起根颈腐病的田间成株期抗病性均为已知的，抗病性的资料来源于澳大利亚昆士兰州2007年、2008年和2009年小麦品种介绍(网址为http://www.dpi.qld.gov.au/265121.htm)，以及文献Mitter等，Plant Pathology，2006，55：433-441；Li等，Journal of Phytopathology，2008，156(11-12)：751-754。

鉴定过程：

禾谷镰刀菌悬浮液的获得方法：禾谷镰刀菌为F15，由江苏省农科院植物保护所提供[禾谷镰刀菌菌种F15已在文献上发表(任丽娟等，小麦抗纹枯病和赤霉病QTL定位研究，麦类作物学报，2007，27(3)：416-420)]。将禾谷镰刀菌菌种F15在超净工作台上于1/4强度PDA固体培养基上活化培养(1/4强度PDA固体培养基配置方法为：10g马铃薯葡萄糖琼脂粉，15g琼脂粉，加入1L蒸馏水，121℃高压灭菌20min)，在22℃、光照时间12h条件下，培养7天后将菌丝涂于相同强度PDA培养基上，继续在22℃、光照时间12h条件下培养10天，刮去培养基表面菌丝，再继续培养7天后，在超净台上用蒸馏水洗涤、三层无菌纱布过滤，以血球计调节菌液浓度至1×10⁶个孢子/mL。

小麦种子经1％NaClO溶液消毒清洗后，在垫有两层湿滤纸的培养皿中于22℃下发芽，当芽长达5mm左右时，在含有0.1％(体积比)Tween 20、浓度为1×10⁶个孢子/mL的禾谷镰刀菌悬浮液中接种2min。

将灭菌过的纸巾(24cm×24cm)平铺在经过消毒处理的正方形塑料盘上，用适量蒸馏水使其湿润，将10粒接种的小麦种子呈直线形状铺在纸巾上，芽的生长方向一致且指向纸巾边缘，芽与纸巾边缘的距离为2cm，将纸巾沿种子的排列方向从一端向另一端卷起来(见图1)，放入避光的泡沫盒中，每个品种重复三次。每个重复随机放入避光的泡沫盒中，加入蒸馏水使纸卷充分湿润，在22℃、避光条件保湿培养48h，然后在22℃、光照时间12h条件下生长，当纸卷外层出现干燥时，将纸巾另一端在蒸馏水中浸10s，接种后14天将纸巾展开(图2)按单株进行病害等级鉴定。

鉴定中，按病害严重度将病级分为0-5级：0级为叶鞘无发病症状；1级为第一叶鞘病斑长度小于1.0cm；2级为第一叶鞘病斑长度1.0-2.0cm；3级为第一叶鞘病斑长度大于2.0cm，幼苗未出现萎蔫病症；4级为幼苗出现萎蔫病症；5级为幼苗死亡。

根据病害评价等级计算病情指数：病情指数＝[∑(病情级别×该级株数)/(调查总株数×最高病级)]×100％，计算获得3个重复的平均病情指数。根据抗病性病情指数的标准：免疫的指数为0，高抗(HR)的指数为＜20，抗(R)的指数为20.01～40.0，中抗(MR)的指数为40.01～60.0，中感(MS)的指数为60.01～70.0，感(S)的指数为70.01～80.0，高感(HS)的指数为80.01～100.0。

从表1可以看出，17份小麦材料在根颈腐病抗性方面覆盖面较大，其中，2份品种抗性达抗(R)水平，3份品种抗性为中抗(MR)，4份品种为中感(MS)，6份品种为感(S)，2份品种为高感(HS)。

通过表1的比对，可见本方法的抗性鉴定结果与公众已知的，采用传统方法在田间成株期抗性鉴定结果具有较高的吻合度。

表1 17份小麦品种苗期抗性接种鉴定结果以及成株期抗性

实施例2

采用实施例1的鉴定步骤，选择41个未知小麦品种或品系，为了便于对41个小麦品种或品系予以区别，鉴定中分别编号依序定义为JS-1～JS-41。

为了检验该方法的可重复性，将41个小麦品种或品系分别在不同时间设计了2次独立的鉴定，每次鉴定中包括3个重复，每次鉴定结果是基于3个重复的平均值。2次试验的平均病情指数及抗性评价列于表2，将2次试验结果进行相关性分析，两次病情指数的相关系数为0.91，说明这种苗期抗性鉴定方法的可重复性较高。

表2 41个小麦品种或品系2次试验苗期抗性接种鉴定结果

以上各实施例不是对本发明的具体限制。