一种雷帕霉素眼用微乳注射剂及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种雷帕霉素眼用微乳注射剂及其制备方法和应用，该注射剂以雷帕霉素为活性成分加入药学上可接受的载体，每1000ml制剂中含有0.05-20g的雷帕霉素。该眼用微乳注射剂成本低、稳定性好，对眼部无明显刺激性及毒副作用，可用于治疗视网膜变性疾病，特别是用于治疗老年黄斑变性疾病具有显著的效果，本发明的疗效是在致病机制的突破发现基础上提出的，对此类别的疾病治疗具有深远的意义。

说明书

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种雷帕霉素眼用微乳注射剂及其制备方法和应用。

背景技术

致盲性眼病是WHO评定的第三大影响人类的疾病，而其中最重要的是视网膜变性疾病。视网膜变性是一大组以进行性感光细胞丧失为共同特征的疾病，其中又分由明显遗传缺陷引起的遗传性视网膜变性疾病和由多因素引发的复杂视网膜变性疾病。老年黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)是最常见的复杂视网膜变性疾病，特别是随着人口老龄化，其发病率不断提高仅在美国就有超过1000万患者。AMD可以由遗传相关因素，吸烟，氧化损伤和线粒体缺陷等年龄相关因素引发，患者由于视网膜黄斑区的感光细胞丧失而严重影响视力乃至失明。由于AMD发病机制多样复杂，临床表型多样复杂，并且感光细胞丧失具有不可逆性，因此目前无任何有效药物治疗。由此可见，找到一个AMD根本的通用的发病机制，并且开发针对性的药物来抑制感光细胞丧失过程是治疗此类疾病的最可能成功的手段。

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)对神经视网膜特别是感光细胞具有一系列功能。当在RPE内表达的基因发生突变(如：RPE65，LRAT等)时，会引起各种遗传性视网膜变性疾病。所有，RPE的正常功能对感光细胞的功能和数量具有至关重要的意义。同样，在绝大多数的AMD患者中，由氧化损伤和线粒体缺陷等引起的RPE损害是疾病的原发病变，而感光细胞的丢失是继发的。然而，在本研究之前，关于RPE对各种损害的原发分子病理反应和病变过程世界上鲜有报道。

Rapamycin又名sirolimus，中文译名为雷帕霉素或西罗莫司，目前，其口服片/剂虽已应用，但其临床应用完全是以抑制器官移植后的免疫排斥和治疗部分肿瘤为目的。由于眼球自身血-眼屏障和角膜屏障等解剖特点，全身用药达到有效血药浓度时，眼内药物浓度几近微量，无法达到有效的药物浓度和持续时间。新近的Rapamycin眼药膏的基础研究是针对角膜移植后的排斥反应，而根据眼球对药物的吸收原理，滴眼液给药或眼药膏给药可产生眼前部组织中(角膜、结膜、巩膜、房水、睫状体)的药物比眼后部组织(晶状体、玻璃体、视网膜)浓度高。因此，Rapamycin眼药膏是不可能被视网膜和RPE吸收，因此不可能治疗视网膜疾病。治疗眼后部组织疾病宜采用结膜下注射、玻璃体内注射、球后注射等。目前世界上不存在Rapamycin眼用微乳注射剂，也没有任何关于Rapamycin治疗老年黄斑变性和其它类型视网膜变性疾病的理论知识、报道抑或尝试。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效治疗视网膜变性疾病的雷帕霉素眼用微乳注射剂，并且该微乳注射剂成本低、稳定性好、毒副作用小。

本发明的另一目的是提供该雷帕霉素眼用微乳注射剂的制备方法。

本发明还有一个目的是提供该雷帕霉素眼用微乳注射剂在制备治疗视网膜变性疾病的药物中应用，特别是制备治疗复杂视网膜变性疾病的药物中应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种雷帕霉素眼用微乳注射剂，包括以雷帕霉素为活性成分加入药学上可接受的载体。该注射剂中，每1000ml制剂含有0.05-20g的雷帕霉素。所述的载体包括乳化剂、油相和助乳化剂等。

上述雷帕霉素眼用微乳注射剂，每1000ml制剂优选原料配方为：

雷帕霉素0.05～20g，油相1.2～48.0ml，乳化剂55.0～200.0ml，助乳化剂51.0～150.0ml，注射用水至1000ml。

上述雷帕霉素眼用微乳注射剂，每1000ml制剂进一步优选原料配方为：

雷帕霉素0.5～4g，油相4.0～25.0ml，乳化剂60.0～98.0ml，助乳化剂55.0～90.0ml，注射用水至1000ml。

每1000ml制剂最优选的原料配方为：

雷帕霉素0.85～1.15g，油相8.0～12.0ml，乳化剂70.0～90.0ml，助乳化剂58.0～70.0ml，注射用水至1000ml。

所述的乳化剂优选吐温-80，助乳化剂优选聚乙二醇-400，油相优选为大豆油。

上述眼用微乳注射剂的PH范围为4～9，优选6.5～7.5。渗透压为0.7～1.5％氯化钠溶液的渗透压，优选0.8～1.0％氯化钠溶液的渗透压。该微乳注射剂粒径范围100μm，优选为＜10μm。PH值范围可通过盐酸、氢氧化钠、醋酸等常规PH调节剂调节，渗透压可通过甘油、氯化钠等常规等渗调节剂调节。

上述雷帕霉素眼用微乳注射剂的制备方法包括以下步骤：

a)根据配方取雷帕霉素，加入油相、乳化剂，充分研磨至粉末溶解，混合均匀；

b)取助乳化剂，加入助乳化剂5～15倍重量的灭菌注射用水，煮沸使溶解，搅拌混匀；

c)将搅匀的“b)”步骤溶液倒入“a)”步骤所述混合液中，快速搅拌、定容，混匀后经微孔滤膜过滤，分装，即得。

所述的雷帕霉素眼用微乳注射剂在制备治疗视网膜变性疾病的药物中应用。所述的视网膜变性疾病可为遗传性视网膜变性疾病或复杂视网膜变性疾病。所述的复杂视网膜变性疾病为老年黄斑变性(AMD)疾病。

本发明建立了两个AMD动物模型来进行相应的研究：

1.通过遗传基因修饰方法，建立原发RPE线粒体缺陷的小鼠模型(MT-KO)，这一模型可以模拟由于RPE内线粒体功能缺陷引发的AMD病变。这一模型的设计方案是将控制线粒体DNA复制和转录的重要基因Tfam基因^[1]从小鼠RPE细胞的基因组中敲除，使得RPE细胞具有原发的线粒体缺陷。具体实验动物制作方法应用了“loxp”和“cre”系统模式。“loxp”是一个23个碱基的序列，可以被cre蛋白重组酶识别后切断。本研究中的MT-KO小鼠是通过将tfam靶基因修饰鼠(tfam^loxp/loxp)和BEST1-Cre转基因鼠杂交而来。tfam靶基因修饰鼠以前已被广泛应用^[2]，其中tfam基因的6和7号外显子被两个loxp序列包夹^[1]。BEST1-Cre转基因鼠的制作方法是：首先制作出人类BEST1基因的驱动子(BEST1基因的-538至+38核苷酸序列)和cre重组蛋白基因共同组成的DNA构建。其次，将BEST1-creDNA构建显微注射到B6小鼠的受精卵细胞中。最后，将此受精卵细胞植入代孕鼠子宫孕育而来。经过杂交tfam靶基因修饰鼠和BEST1-Cre转基因鼠后，最终的MT-KO小鼠具有+/BEST1-cre；tfam^loxp/loxp基因型。由于BEST1基因的驱动子可以诱导cre蛋白重组酶特异性的表达在RPE中，cre蛋白重组酶识别了RPE细胞中tfam基因的loxp序列，从而将tfam基因的6和7号外显子切除，进而使得tfam基因丧失表达。由于tfam基因是控制线粒体DNA复制和转录的重要基因，这样小鼠的RPE细胞呈现严重的线粒体功能缺陷。我们通过定量PCR的方法证明MT-KO小鼠RPE细胞中一系列线粒体编码的基因表达严重降低，包括MT-ATP6，MT-ND4和MT-ND6基因。同时，我们通过酶学染色方法证明线粒体中重要功能复合体(complex IV)的酶学活性消失。电镜进一步显示MT-KO小鼠RPE细胞中线粒体肿胀、形态严重改变。这些结果证明成功的建立了RPE线粒体缺陷的小鼠模型(MT-KO)。

2.建立了RPE的氧化损伤小鼠模型(RPE-OD)，这一模型是针对由于RPE氧化损伤的原因引发的AMD病变。NaIO₃是一种氧化剂，将NaIO₃注射到血液循环中可以特异性的损伤RPE细胞^[3]。由于大剂量的NaIO₃(30-50mg/kg)可以引起RPE细胞的快速丢失，我们因此对B6小鼠注射了少量的NaIO₃从而模拟AMD患者中RPE细胞的缓慢病程。具体制作方法是通过尾部静脉1次性注射NaIO₃，15mg/kg稀释于1X的磷酸盐缓冲液中(PBS)，通过免疫荧光染色方法检测小鼠RPE细胞中DNA氧化损害标记物8-OHDG。结果显示RPE-OD小鼠模型呈现RPE的特异性氧化损伤改变。

进而对MT-KO和RPE-OD进行了深入的病变观察和发表机制研究。具体试验方法为显微光镜和电镜的组织学检查；免疫蛋白电泳和免疫荧光染色的生化检查；视网膜电流图(ERG)的电生理功能检查。在MT-KO模型中我们发现，RPE细胞在线粒体功能缺陷的情况下早期呈现去分化改变。主要表现为丧失细胞正常形态，异常肥厚，和失去RPE细胞特有功能蛋白表达(见图1)。而晚期呈现出细胞萎缩，色素异常分布和玻璃体小疣等典型AMD改变(见图1)^[4]。而感光细胞从RPE早期的去分化改变时就开始丧失形态和正常电生理功能，而晚期呈现大量的感光细胞丢失(见图2)。这些结果说明，早期的RPE去分化过程是影响感光细胞的原发机制。在此基础上，我进一步探索了引发RPE去分化过程的细胞分子信号的机制。免疫蛋白电泳结果显示AKT/mTOR细胞通路的异常激活以及它下游的P70S6K/S6通路相应活化是RPE去分化的根本机制(见图3)。mTOR细胞通路活化虽然保持了RPE细胞在严重损害情况下(如线粒体功能严重缺陷)的活性，但却引发了RPE细胞异常增长(蛋白和磷脂合成增加，见图3)及相应的类似AMD的眼底改变(见图3)，从而丧失了正常的形态和功能，并进一步导致了感光细胞丧失。在RPE-OD小鼠模型的研究中我们发现，AKT/mTOR细胞通路的异常激活同样是引发氧化损伤RPE细胞的去分化和感光细胞丢失的重要机制(见图4)。因此，我们的研究揭示了一个RPE细胞对不同类型损害的原发分子病理反应，从而从根本上发现了一个通用的基本的AMD发病机制。

本发明应用雷帕霉素治疗AMD动物模型的研究成果：

我们在原发RPE线粒体缺陷的小鼠模型MT-KO和RPE的氧化损伤小鼠模型RPE-OD两个动物模型中都应用了腹腔注射rapamycin(注射剂量为3mg/kg，制备方法同实施例1，每天1次)以评价其疗效。MT-KO小鼠在注射Rapamycin两个月之后，RPE的去分化过程得到根本的改善，其中包括RPE65，Keratin18，LRAT，RLBP1等RPE重要功能蛋白表达取得了显著提高(RPE65和Keratin18接近正常水平)，RPE细胞形态接近正常，光感受器细胞数目显著提高并且视网膜电生理功能也得到了显著提高，见图5。同样，在RPE-OD小鼠中，Rapamycin注射了5-17天之后，得到与MT-KO小鼠同样的治疗效果。mTOR通路的异常活化是AMD发病的一个重要机制，本发明显著抑制了mTOR基因的活性。基于这些结果，开发Rapamycin眼用注射剂来治疗AMD患者是具有坚实的理论基础的并且可取得巨大成功的。同时由于Rapamycin还提高了RPE65(～2.2倍)，LRAT(～2.1倍)，RLBP1(～2倍)等RPE重要功能蛋白表达(见图4B和图5A。这两个柱形图具体显示了雷帕霉素在两个模型中提高的一系列蛋白的具体数值。)，而这些蛋白变异又是一大批遗传性视网膜变性的根本原因，因此本发明Rapamycin眼用注射剂还可以用于治疗改善遗传性视网膜变性疾病的症状。

安全性评估：

Rapamycin不溶于水，是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的大环内酯类(macrocyclic lactone)抗免疫药。Rapamycin口服片和口服液用来抑制器官移植后的免疫排斥(特别是肾脏移植)已获美国FDA许可(1999)。口服1mg/m²/天(起始计量3mg/m²/天)被证明是安全的。Rapamycin口服片在我国临床也已开始应用，被认为是一种低毒性的免疫抑制药物。本研究中，我们对30对正常小鼠(注射组和对照组)进行了长达4个月的腹腔皮下注射(每天一次，注射剂量为3mg/kg，按实施例1方法制备得到)，未发现任何具备组织和粘膜的不良影响或病理改变。对注射组小鼠的视网膜的生化表达检查结果显示，一系列重要生化表达产物均未发现改变，详见图6。进一步的视网膜电流图的检查也显示，注射组小鼠具有正常的视网膜电生理功能，详见图6。此外，我们还将上述同样的眼用Rapamycin微乳注射剂(按实施例1方法制备得到)注射于兔眼眶内(0.5ml眼球后注射)，并在兔眼中进行了安全性评估。在每周3次，共一个月的测试后，结果发现本发明雷帕霉素球后注射微乳注射剂未引起任何眼部的病理改变。上述研究结果说明，本发明雷帕霉素球后注射微乳注射剂无明显刺激及毒副作用，是安全有效的。

Rapamycin水溶性较差，但是通过本发明配方及方法得到微乳注射剂在纳米尺度上的带药粒子表面积激增，粒子的官能团密度和吸附性能力加大，达到吸附平衡的时间缩短，粒子胶体稳定性提高，使之具有较高的靶向和缓释给药能力，并减少毒副作用。并且，本发明制备方法简单、质量可控，适于工业化生产。

与现有技术比较本发明开发Rapamycin眼用微乳注射剂的有益效果：

本发明是在一系列科学实验数据基础上提出的Rapamycin眼用微乳注射剂，该注射剂可采用结膜下注射、玻璃体内注射、球后注射等注射方式治疗视网膜变性疾病，特别是用于治疗老年黄斑变性疾病具有显著的效果，本发明的疗效是在致病机制的突破发现基础上提出的，对此大类的疾病治疗具有重要深远的意义。并且该注射剂包裹率较高、成本低、稳定性好(按照2005版《中国药典》，在湿度为60±10％的环境中，温度为25℃左右放置6个月后，检测其热原、澄明度、PH值、无菌检查均未发生明显改变，证明其质量是稳定的。)，对眼部无明显刺激性及毒副作用。

附图说明

图1为MT-KO(RPE特异性线粒体缺陷小鼠模型)的RPE细胞改变以及与AMD病变的相似性实验结果图。

图中，(A，B)，对照组小鼠(A)和MT-KO小鼠(B)的RPE进行Phalloidin染色(标记细胞边界和骨架)显示，MT-KO小鼠的RPE细胞(B)失去了正常的多边形形状。(C-F)，组织学光镜检查，MT-KO小鼠的RPE细胞从3个月起开始增厚(D)，并且随年龄增长愈加肥厚从而丧失了上皮形态(E，F)。(G)，蛋白免疫电泳分析结果显示，一系列REP细胞的重要功能蛋白(RPR65，Keratin18，LRAT，RLBP1和MERTK)在MT-KO小鼠的RPE细胞中严重降低。^*，P＜0.05；^**，P＜0.01；^***，P＜0.001。(H-J)，MT-KO小鼠的RPE在晚期(11个月)出现了色素异常分布(H)、萎缩(H)和玻璃体小疣沉积(J，箭头)。这一系列改变与AMD患者的临床改变一致。

图2为MT-KO小鼠模型的光感受细胞的变性过程。

图中，(A，B)，对照组小鼠(A)和MT-KO小鼠(B)的眼冰冻切片进行PNA(标记光感受器视锥细胞)和RPE65(标记RPE)的免疫荧光染色显示，MT-KO小鼠的视锥细胞从4个月就失去了正常的形态(B)。(C)ERG检查显示5个月的MT-KO小鼠已经严重丧失了暗视野(scotopic a和b波)和明视野(photopic b波)的ERG反应(黑色菱形线)，丧失了正常的光感受器功能。(D)组织切片显示MT-KO小鼠随年龄逐步丧失了光感受器细胞(黑框内)，在晚期数目减少尤为明显。这些结果说明RPE的去分化改变首先在前期引起了光感受器功能和形态的改变，而在晚期才引起了光感受器细胞数目的减少。因此，发现早期RPE的去分化的细胞信号机制是找到治疗AMD病方法的根本。

图3为MT-KO小鼠RPE细胞中AKT/mTOP通路的异常激活引起类似AMD的改变实验结果图。

图中，(A，B)，3个月的MT-KO小鼠的P-AKT^Ser473，p-mTOR^ser2448(A)，和p-P70SK6^Thr389，p-S6^Ser235/236(B)的磷酸化水平显著提高。这证明AKT/mTOR和P70S6K/S6通路被异常激活。(B)，MT-KO小鼠PRE细胞中的蛋白含量随年龄显著增加。(C)Red Oil染色显示MT-KO小鼠PRE细胞中的有大量的紫红色中性磷脂沉积。(D)，上述的生化改变造成了MT-KO小鼠眼底大量白色物质沉积，与AMD患者眼底一致。

图4为RPE-OD小鼠PRE细胞中mTOR通路的异常激活引起的视网膜变性，以及Rapamycin治疗的效果图。

图中，(A)，RPE-OD小鼠(NalO₃注射后5天)RPE中的p-mTOR^ser2448，p-P70SK6^Thr389，和p-S6^Ser235/236的磷酸化水平显著提高，证明了mTOR/P70S6K/S6通路被异常激活。(B)，同样时间内，一系列RPE细胞的重要功能蛋白(RPE65，Keratin18，LRAT，RLBP1和MERTK)在RPE-OD小鼠的RPE细胞中严重降低(浅灰色)，然而Rapamycin治疗使得这些蛋白增加了～2倍，趋近于正常水平(黑色)。(C)，组织切片显示PRE-OD小鼠(NalO₃注射后17天)只残存少量正常视网膜(双箭头区)，而其余视网膜有明显的RPE变性和感官细胞丧失(放大图)。Rapamycin治疗使得正常视网膜区显著增加(双箭头区)，RPE和感官细胞趋近正常(放大图)。(D)，定量分析证明Rapamycin治疗使得RPE-OD小鼠总光感受器数增加1倍，视锥细胞数增加2倍。(E)，相应的，ERG检查显示Rapamycin治疗显著增加了RPE-OD小鼠暗视野(scotopic a和b波)和明视野(photopic b波)的反应(深灰色方块线)。

图5为Rapamycin治疗MT-KO小鼠效果图。

图中，(A)，Rapamycin治疗使得4个月的MT-KO小鼠RPE中一系列重要功能蛋白(RPE65，Keratin18，LRAT和RLBP1)趋近于正常水平(灰色柱)。与未治疗的MT-KO小鼠相比(黑色柱)增加了～2倍；(B)，同时，正常的RPE区域显著增加；(C)，组织切片显示Rapamycin治疗的MT-KO小数的RPE(右)与安慰剂处理的MT-KO小鼠的RPE(左)形态上显著好转。(D)，定量分析证明Rapamycin治疗使得MT-KO小鼠视锥细胞数显著增加。(E)，相应的，ERG检验显示Rapamycin治疗显著增加了MT-KO小鼠暗视野(scotopic a和b波)的反应(灰色方块曲线)。

图6为Rapamycin在正常小鼠中的安全评估图。

图中，(A)，Rapamycin注射4个月后的小鼠的视网膜组织结构(右)与未注射小鼠(左)相比无任何异常改变。(B)，免疫蛋白电泳证明Rapamycin注射4个月不影响RPE中重要功能蛋白表达。(C)，ERG检查也证明Rapamycin治疗本身对视网膜电生理无影响。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的阐述：

实施例1

由天津新美科技公司提供Rapamycin原药

处方：Rapamycin(雷帕霉素)            1.00g；

      大豆油                         10.0ml；

      吐温-80                        80.0ml；

      聚乙二醇-400                   64.0ml；

      无菌注射用水                   适量；

制备总量：1000ml，测得PH值为7，渗透压：0.9％氯化钠溶液的渗透压。

工艺：

精密称取Rapamycin，置于乳钵中，加入大豆油，吐温-80，充分研磨至粉末溶解，混合均匀；另量取PEG-400加至800ml灭菌注射用水中，煮沸使溶解，搅拌混匀后，倒入上述混合液中，快速搅拌，灭菌注射用水定容至1000ml，混匀后经0.45μm微孔滤膜过滤，无菌分装，即得。

实施例2

由天津新美科技公司提供Rapamycin原药

处方：Rapamycin(雷帕霉素)          1.15g；

      大豆油                       8.0ml；

      吐温-80                      90.0ml；

      聚乙二醇-400                 70.0ml；

      无菌注射用水                 适量；

制备总量：1000ml，测得PH值为6.5，渗透压：0.8％氯化钠溶液的渗透压。

工艺：

精密称取Rapamycin，置于乳钵中，加入大豆油，吐温-80，充分研磨至粉末溶解，混合均匀；另量取PEG-400加至700ml灭菌注射用水中，煮沸使溶解，搅拌混匀后，倒入上述混合液中，快速搅拌，灭菌注射用水定容至1000ml，混匀后经0.45μm微孔滤膜过滤，无菌分装，即得。

实施例3

由天津新美科技公司提供Rapamycin原药

处方：Rapamycin(雷帕霉素)          0.85g；

      大豆油                       12.0ml；

      吐温-80                      70.0ml；

      聚乙二醇-400   58.0ml；

      无菌注射用水   适量；

制备量：1000ml，测得PH值为7.5，渗透压：1.0％氯化钠溶液的渗透压。

工艺：

精密称取Rapamycin，置于乳钵中，加入大豆油，吐温-80，充分研磨至粉末溶解，混合均匀；另量取PEG-400加至800ml灭菌注射用水中，煮沸使溶解，搅拌混匀后，倒入上述混合液中，快速搅拌，灭菌注射用水定容至1000ml，混匀后经0.45μm微孔滤膜过滤，无菌分装，即得。

实施例4

由天津新美科技公司提供Rapamycin原药

处方：Rapamycin(雷帕霉素)   0.05g；

      大豆油                1.2ml；

      吐温-80               55.0ml；

      聚乙二醇-400          51.0ml；

      无菌注射用水          适量；

制备量：1000ml，氢氧化钠调节PH值为9，甘油调节渗透压：1.5％氯化钠溶液的渗透压。

工艺：

精密称取Rapamycin，置于乳钵中，加入大豆油，吐温-80，充分研磨至粉末溶解，混合均匀；另量取PEG-400加至300ml灭菌注射用水中，煮沸使溶解，搅拌混匀后，倒入上述混合液中，快速搅拌，灭菌注射用水定容至1000ml，混匀后经0.45μm微孔滤膜过滤，无菌分装，即得。

实施例5

由天津新美科技公司提供Rapamycin原药

处方：Rapamycin(雷帕霉素)   10g；

      大豆油                20.0ml；

      吐温-80               180.0ml；

      聚乙二醇-400          130.0ml；

      无菌注射用水          适量；

制备量：1000ml，盐酸调节PH值为4，氯化钠调节渗透压：0.7％氯化钠溶液的渗透压。

工艺：

精密称取Rapamycin，置于乳钵中，加入大豆油，吐温-80，充分研磨至粉末溶解，混合均匀；另量取PEG-400加至650ml灭菌注射用水中，煮沸使溶解，搅拌混匀后，倒入上述混合液中，快速搅拌，定容至1000ml，混匀后经0.45μm微孔滤膜过滤，无菌分装，即得。

实施例6

由天津新美科技公司提供Rapamycin原药

处方：Rapamycin(雷帕霉素)   20.00g；

      大豆油                48.0ml；

      吐温-80               130.0ml；

      聚乙二醇-400          100.0ml；

      无菌注射用水          适量；

制备量：1000ml，盐酸调节PH值为7，甘油调节渗透压：0.9％氯化钠溶液的渗透压。

工艺：

精密称取Rapamycin，置于乳钵中，加入大豆油，吐温-80，充分研磨至粉末溶解，混合均匀；另量取PEG-400加至650ml灭菌注射用水中，煮沸使溶解，搅拌混匀后，倒入上述混合液中，快速搅拌，灭菌注射用水定容至1000ml，混匀后经0.45μm微孔滤膜过滤，无菌分装，即得。

实施例7

由天津新美科技公司提供Rapamycin原药

处方：Rapamycin(雷帕霉素)   4g；

      大豆油                25ml；

      吐温-80               98.0ml；

      聚乙二醇-400          90.0ml；

      无菌注射用水          适量；

制备量：1000ml，氢氧化钠调节PH值为7，甘油调节渗透压：0.9％氯化钠溶液的渗透压。

工艺：

精密称取Rapamycin，置于乳钵中，加入大豆油，吐温-80，充分研磨至粉末溶解，混合均匀；量取PEG-400加至500ml灭菌注射用水中，煮沸使溶解，搅拌混匀后，倒入上述混合液中，快速搅拌，定容至1000ml，混匀后经0.45μm微孔滤膜过滤，无菌分装，即得。

实施例8

由天津新美科技公司提供Rapamycin原药

处方：Rapamycin(雷帕霉素)   0.5g；

      大豆油                6ml；

      吐温-80               60.0ml；

      聚乙二醇-400          55.0ml；

      无菌注射用水          适量；

制备量：1000ml，氢氧化钠调节PH值为7，甘油调节渗透压：0.9％氯化钠溶液的渗透压。

工艺：

精密称取Rapamycin，置于乳钵中，加入大豆油，吐温-80，充分研磨至粉末溶解，混合均匀；量取PEG-400加至820ml灭菌注射用水中，煮沸使溶解，搅拌混匀后，倒入上述混合液中，快速搅拌，定容至1000ml，混匀后经0.45μm微孔滤膜过滤，无菌分装，即得。

参考文献

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