抗H5亚型A型流感病毒血凝素单克隆抗体

摘要

本发明公开了即使在H5亚型的A型流感病毒发生某种程度的突变的情况下，也可以正确进行测定的H5亚型的A型流感病毒的免疫测定方法和用于该方法的试剂盒、以及可以用于该免疫测定的新型抗H5亚型A型流感病毒单克隆抗体。本发明的抗体或其抗原结合性片段与H5亚型A型流感病毒的血凝素发生抗原抗体反应，其对应表位不存在于受体亚结构域(其中，由其C末端11个氨基酸构成的区除外)中，因此对上述A型流感病毒不具有中和活性。

说明书

技术领域

本发明涉及抗H5亚型A型流感病毒血凝素单克隆抗体、以及使用该单克隆抗体的抗H5亚型A型流感病毒的免疫测定方法和免疫测定用试剂盒。

背景技术

流感病毒存在H5或H7亚型，以亚洲为中心给养鸡产业带来重大损失，但近年来确认禽流感病毒也会传染给人。特别是属于H5亚型的禽流感病毒，从2003年左右起，以亚洲为中心，有许多关于该病毒传染给人及其高死亡率的报道，由于人对上述病毒没有免疫力，所以全球范围都担心其爆发流行，人们正在研究其预防和流行时的对策。

为了预防禽流感病毒传染给人、或者至少是阻止其在人群中的大流行，特异性且快速地检测也会传染给人的禽流感病毒至关重要。一直以来，在快速检测检体中的病毒方面，广泛采用免疫测定法，特别是利用使用在液体流通的多孔性基体的一部分中固定有抗病毒抗体的固相的夹层法(Sandwich method)进行的免疫色谱法，在病院等医疗场所可以非常简便地在短时间内检测病毒，因此被广泛应用。检测人流感病毒的免疫色谱法用试剂盒也有出售。

为了利用免疫测定法检测也会传染给人的禽流感病毒，理所当然需要抗禽流感病毒的抗体。已知流感病毒的表面抗原由血凝素和称作神经氨酸苷酶的蛋白构成。作为血凝素(HA)，已知有抗原性不同的H1～H16这16种，而作为神经氨酸苷酶，已知有抗原性不同的N1～N9这9种。关于流感病毒的亚型(subtype)，通过以“H5N1”等方式记载上述血凝素和神经氨酸苷酶的种类来进行标记。迄今为止，确认由鸟传染给人的禽流感病毒基本上是血凝素为H5型的禽流感病毒。因此，作为用于检测由鸟传染给人的高病原性流感病毒的抗体，人们希望开发H5亚型流感病毒特异性抗体。

人们对H5亚型A型流感病毒的血凝素进行了充分研究，不仅其氨基酸序列、就连立体结构也已知(非专利文献1)。此外，还已知各种抗H5亚型A型流感病毒血凝素的单克隆抗体(非专利文献2～4)。另外，还已知利用使用两种抗血凝素单克隆抗体的夹层法来测定H5亚型A型流感病毒(非专利文献5、6)。

非专利文献1：Ya Ha等人，The EMBO Journal，21(5)，865-875，2002

非专利文献2：Nikolai V.K.等人，J.Gen.Virol.83，2497，2002

非专利文献3：James Stevens等人，SCIENCE第312卷，21APRIL 2006

非专利文献4：Zhi-Yong Yang等人，SCIENCE第317卷，10AUGUST2007

非专利文献5：Tsuda Y.等人，Microbiol.Immunol.51(9)，903，2007

非专利文献6：Qigai He等人，Clin.Vacc.Immnol.617，2007

发明内容

发明所要解决的课题

作为抗H5亚型A型流感病毒的血凝素的单克隆抗体，迄今为止主要研究作为抑制、阻止该病毒的传染性的抗体具有中和活性的中和抗体。为了开发抗该病毒的疫苗，必需要有中和抗体，上述非专利文献2～4中记载的单克隆抗体也是中和抗体。此外，非专利文献5和6中记载的用于免疫测定的单克隆抗体，有关该抗体的表位分析结果及中和活性则没有记载。

当然可以使用这样的公知中和抗体来构建H5亚型流感病毒的免疫测定系统。但本申请发明人等在使用中和抗体构建免疫测定系统时，发现存在有可能无法追踪该病毒的突变的问题。即，已知流感病毒由于逃出了宿主的免疫监视，所以在中和抗体识别表位常常发生突变，使用公知的中和抗体构建免疫测定系统时，发现失去了与已发生突变的病毒的反应性，结合亲和性降低，有可能无法检测病毒或者测定值较正确值大幅降低。考虑到病毒频繁地发生突变，人们希望即使发生少许突变也能够正确地免疫测定病毒。

因此，本发明的目的在于：提供即使在H5亚型A型流感病毒发生某种程度的突变的情况下，也可以正确进行测定的H5亚型A型流感病毒的免疫测定方法和用于该方法的试剂盒、以及可以用于该免疫测定的新型抗H5亚型A型流感病毒单克隆抗体。

解决课题的方法

已知在感染时，流感病毒首先与位于细胞表面的受体结合，之后被摄入细胞内部。因此，流感病毒为了在宿主内增殖，病毒就必需与位于细胞表面的受体结合，若妨碍其结合，则病毒无法增殖。公知的中和抗体在流感病毒的受体结合区中具有对应表位，并与病毒结合，以妨碍病毒与受体结合。另一方面，已知病毒在宿主的自然免疫力或通过给予疫苗等产生的中和抗体存在的环境下容易发生突变，使其免受其中和抗体引起的增殖抑制。突变本身也许会随机发生，但只有发生变异以使其免受中和抗体引起的增殖抑制的病毒可以充分增殖，所以在增殖的病毒中，结果具有这样的突变的病毒变多。将这种现象称作逃逸突变或逃避突变，这样的突变因中和抗体而变得容易发生，这被称作抗体压力或免疫压力等。本申请发明人等想到：即使在病毒发生某种程度的突变的情况下，也可以正确地免疫测定病毒的免疫测定法，该方法可以通过使用在不易突变的区、即中和抗体的对应表位所存在的区以外的区具有对应表位的单克隆抗体来构建，并进一步确定了这样的单克隆抗体的对应表位所存在的区，而且实际上提供了这样的单克隆抗体，从而完成了本发明。

即，本发明提供抗H5亚型A型流感病毒血凝素单克隆抗体或其抗原结合性片段，所述单克隆抗体与H5亚型A型流感病毒的血凝素发生抗原抗体反应，其对应表位不存在于受体亚结构域(其中，由其C末端11个氨基酸构成的区除外)中，不具有A型流感病毒的中和活性。此外，本发明提供H5亚型A型流感病毒的免疫测定方法，该方法包括：通过免疫测定来测定检体中的H5亚型A型流感病毒，所述免疫测定利用上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段与H5亚型A型流感病毒血凝素的抗原抗体反应。本发明还提供H5亚型A型流感病毒的免疫测定用试剂盒，该试剂盒中含有两种可以同时与H5亚型A型流感病毒血凝素结合的上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段。

发明效果

根据本发明，首次提供：即使在H5亚型A型流感病毒发生逃逸突变的情况下，结合亲和性也不发生变化的抗H5亚型A型流感病毒血凝素单克隆抗体。因此，通过使用本发明的单克隆抗体的免疫测定，就连发生了逃逸突变的H5亚型A型流感病毒也可以测定，可以快速测定对人也具有病原性的禽流感病毒。因此，认为本发明对于防止对人也具有致病性的禽流感病毒的流行具有重大贡献。

附图说明

图1是将两种H5亚型A型流感病毒株的血凝素的氨基酸序列进行排比，并与各亚结构域的分布和实施例中制作的3种单克隆抗体的对应表位一同显示的图。

图2是将两种H5亚型A型流感病毒株的血凝素的氨基酸序列进行排比后显示的图。

图3是显示H5亚型A型流感病毒株的血凝素的立体结构和实施例中制作的3种单克隆抗体的对应表位区的图。

图4是显示实施例中进行的、3种单克隆抗体的表位分析的中途结果的图。

图5是显示实施例中进行的、3种单克隆抗体的表位分析的中途结果的图。

图6是实施例中制作的、免疫测定器具(免疫色谱器具)的主要部分的模式截面图。

图7是实施例中制作的、免疫测定器具(免疫色谱器具)的模式平面图。

图8是实施例中制作的、免疫测定器具(免疫色谱器具)的模式截面图。

图9是实施例中制作的、其他免疫测定器具(免疫色谱器具)的主要部分的模式截面图。

图10是实施例中制作的、其他免疫测定器具(免疫色谱器具)的模式平面图。

具体实施方式

如上所述，本发明的单克隆抗体，其与H5亚型A型流感病毒血凝素发生抗原抗体反应，其对应表位位于受体亚结构域(其中，由其C末端11个氨基酸构成的区除外)以外的区。

H5亚型A型流感病毒血凝素(以下，有时简记作“H5HA”)的基因的核苷酸序列和其所编码的氨基酸序列的1个例子见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。需要说明的是，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列是公知的，以检索号(Accession No.)AB263192注册在GenBank中。

关于H5HA的基因核苷酸序列和氨基酸序列，除上述以外，还已知几个，例如，上述非专利文献1中记载的H5N3的HA的基因核苷酸序列和氨基酸序列，以检索号AF303057注册在GenBank中(氨基酸序列也以检索号Q9DLP3注册)(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)。与公知的任一种H5亚型HA发生抗原抗体反应的单克隆抗体也均包括在本发明的单克隆抗体的范围内，由于H5亚型HA间的同源性高，所以上述单克隆抗体通常与所有的H5亚型HA均发生抗原抗体反应。

图1显示将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列进行排比的图。图1中还记载了氨基酸序列中的各结构域(非专利文献1)。图2显示只对氨基酸序列进行排比的图。如图2充分显示的那样，两者的氨基酸序列的同源性非常高(约96.8％)、氨基酸数也相同，所以由对SEQ ID NO：4已知的各种结构域的分布(非专利文献1)，SEQ ID NO：2的氨基酸序列中各种结构域的分布也容易理解(图1)。在本说明书和权利要求书中，显示H5HA的氨基酸序列中的位置时，以SEQ ID NO：2的氨基酸序列为基准，但如上所述，由于H5A型流感病毒的HA间的氨基酸序列的同源性非常高，所以其他H5HA的氨基酸序列也可以容易地与SEQ ID NO：2的氨基酸序列进行排比，容易理解以SEQ ID NO：2的氨基酸序列为基准的位置在其氨基酸序列中相当于某位置。此外，“以SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准”，是指使用SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列作为显示其位置的基准，并不仅仅是指以具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的HA为免疫原制作的单克隆抗体。

由图1可知：以SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准，受体亚结构域为自N末端起第126号的氨基酸(以下，“记作126aa”)～278aa。本发明的单克隆抗体是其对应表位不存在于受体亚结构域(其中，由其C末端11个氨基酸构成的区除外)中的单克隆抗体。若抗体与受体亚结构域结合，则流感病毒无法与细胞表面的受体结合，无法侵入细胞内，其结果，无法在宿主内增殖。即，该抗体具有流感病毒的中和活性。但是，下述实施例中具体制作的单克隆抗体之一(IFH5-115)，虽然其对应表位的一部分存在于受体亚结构域的C末端11个氨基酸(268-278aa)的区中，但不具有中和活性，所以受体亚结构域的C末端区并不是病毒与受体结合所必须的区。因此，从本发明中规定的、不存在对应表位的区(基本是受体亚结构域)中除去受体亚结构域的C末端侧11个氨基酸。

本发明的单克隆抗体的对应表位，只要是上述受体亚结构域(其中，由其C末端16个氨基酸构成的区除外)以外的区即可，没有特别限定，但对应表位优选存在于下述区中的对应表位：

(1)41～60aa和312～322aa的区、

(2)61～80aa和290～300aa的区、或

(3)101～113aa和268～278aa的区。

其中，对应表位“存在于区中”，是指与使该区缺失的缺失突变体的结合活性丧失或者至少是显著降低，不仅该区内存在对应表位的情形，而且在与该区重复的区中存在对应表位的情形、当使该区缺失时结合活性丧失或至少显著降低的情况也包含在内。另外，上述(1)～(3)所规定的对应表位区分别由氨基酸序列上的位置距离远的2个区构成，但是这些的2个区在HA的立体结构中位置相邻(参照图3)。因此，例如在上述(1)的41～60aa和290～300aa的区中存在对应表位，是指立体结构中相邻的这些区的整体中存在对应区，当36～65aa和307～327aa的任一方缺失时，该单克隆抗体无法与该部分缺失HA结合。

对应表位存在于哪一区，这可以如下述实施例所具体记载的那样，原理上通过常规方法、即研究与缺失突变体的结合性来研究。即，利用基因工程学方法制作缺失各种区的各种突变体，测定这些的各缺失突变体与单克隆抗体的结合性是否因其缺失而丧失或显著降低，从而可以研究对应表位存在于哪一区。

本发明的单克隆抗体还不具有其通过抗原抗体反应所结合的A型流感病毒的中和活性。如上所述，本发明的单克隆抗体，其对应表位位于受体亚结构域(C末端侧11个氨基酸的区除外)以外的区，由于该构成要件，大体上中和活性丧失，但对应表位存在于受体亚结构域(C末端侧11个氨基酸的区除外)以外的区时、例如通过立体障碍性地妨碍受体亚结构域与受体的结合而发挥中和活性的情形也包含在内。单克隆抗体是否具有中和活性，这可以如下述实施例所具体记载的那样，使H5亚型A型流感病毒与其单克隆抗体的混合物与细胞作用，之后培养细胞，研究是否产生对细胞的细胞毒，从而加以研究。

并且，优选本发明的单克隆抗体与A型流感病毒的其他HA亚型(即H1～H4和H6～H15)实质上不发生交叉反应。通过与其他HA亚型实质上不发生交叉反应，可以只将确认由鸟传染给人的H5亚型A型流感病毒与其他流感病毒区别测定。此处，“实质上不发生交叉反应”，是指不发生可以检测的程度的交叉反应，或者虽然可以检测到交叉反应，但其程度微弱，可以和与H5HA的抗原抗体反应明确区别开来。例如，在下述实施例中，虽然利用使用两种本发明的抗H5HA单克隆抗体作为固相化抗体和标记抗体的免疫色谱法研究与各种亚型的HA的交叉反应，但按照这样的方法，当在检测区检测不到标记时，可以判定实质上没有发生交叉反应。需要说明的是，下述实施例中使用的、H1～H4和H6～H15的基因的核苷酸序列和氨基酸序列分别见SEQ IDNO：5～SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：34。是否存在与其他HA亚型的交叉反应，这可以使用它们来研究。

本发明还提供：上述本发明的单克隆抗体的抗原结合性片段。这里的“抗原结合性片段”是指，例如免疫球蛋白的Fab片段或F(ab’)₂片段这样的、维持该抗体与对应抗原的结合性(抗原抗体反应性)的抗体片段。众所周知，这样的抗原结合性片段也可用于免疫测定。如公知的那样，Fab片段或F(ab’)₂片段可以通过用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶这样的蛋白分解酶处理单克隆抗体而得到。需要说明的是，抗原结合性片段并不限于Fab片段或F(ab’)₂片段，可以是维持与对应抗原的结合性的任何片段，还可以是利用基因工程学方法制备的片段。例如，还可以使用通过基因工程学方法使单链可变区(scFv：single chainfragment of variable region)在大肠杆菌内表达的抗体。scFv的制作方法也众所周知，提取如上制作的杂交瘤的mRNA，制备单链cDNA，使用免疫球蛋白H链和L链的特异性引物进行PCR，扩增免疫球蛋白H链基因和L链基因，将它们通过接头连接，赋予适当的限制酶切位点，之后导入质粒载体中，用其转化大肠杆菌，从大肠杆菌中回收scFv，从而可以制作scFv。本发明中所说的“抗原结合性片段”也包含这样的scFv。

本发明的单克隆抗体可如下得到：利用以H5亚型A型流感病毒作为免疫原的常规方法，制备抗H5亚型A型流感病毒单克隆抗体，筛选与HA具有结合性的单克隆抗体，再筛选对H5亚型A型流感病毒不具有中和活性的单克隆抗体，分析所筛选的单克隆抗体的对应表位，选择本发明中规定的、满足表位的上述要件的单克隆抗体，从而可以得到本发明的单克隆抗体。单克隆抗体本身可以通过周知的杂交瘤法来制作，在下述实施例中也有具体记载。此外，关于A型流感病毒的中和活性，可以利用下述方法进行研究：使该病毒与单克隆抗体的混合物与细胞作用，研究细胞是否被抑制。该方法在下述实施例中也有具体记载。并且，对应表位分析可以利用下述方法来进行：制作H5HA的各种缺失突变体，研究它们与单克隆抗体的结合性。该方法在下述实施例中也有具体记载。

本发明还提供H5亚型A型流感病毒的免疫测定方法，该方法包括：通过免疫测定来测定检体中的H5亚型A型流感病毒，所述免疫测定利用上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段与H5亚型A型流感病毒血凝素的抗原抗体反应。需要说明的是，在本发明中，“测定”一词包含检测、定量、半定量。

在该领域中免疫测定方法本身众所周知，本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段也可用于周知的任一种免疫测定方法。即，根据反应形式进行分类，有夹层法、竞争法、凝集法等；根据标记进行分类，有酶免疫分析、放射免疫分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析等；这些方法均包含在本发明所说的“免疫测定”中，在本发明的免疫测定方法中可以采用。另外，各免疫测定所必需的试剂类也是周知的，除了所用的单克隆抗体或其抗原结合性片段具有特征以外，可以使用通常的免疫测定用试剂盒进行免疫测定。即，本发明还提供用于实施本发明的测定方法的测定试剂盒，该试剂盒中含有上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段。

在免疫测定方法中，利用使用两种能够同时与H5亚型A型流感病毒血凝素结合的本发明的单克隆抗体或其抗原结合性片段的夹层法进行的免疫测定方法，对高灵敏度且迅速的病毒测定有利。在夹层法中，通常所用的两种单克隆抗体中，一种固定在珠粒或微量培养板的孔、或免疫色谱法的多孔性基质这样的固相上，另一种用酶标记、荧光标记、化学发光标记等进行标记，在固相化抗体与标记抗体之间夹层有作为测定对象的病毒抗原，测定与固相结合的标记。想要检测H5亚型A型流感病毒时，通过检测与固相结合的标记，可以检测该病毒。想要定量该病毒时，使用不同的各种已知量的标准检体，通过该免疫测定系统测定标记，以标记量与病毒量的相关关系作图，先制作标准曲线，对未知检体进行相同的操作，测定标记量，将测定值代入标准曲线中，从而可以定量测定病毒。需要说明的是，上述夹层法本身众所周知。

在本发明的夹层法中，使用两种可以同时与单一的H5HA分子结合的本发明的抗H5HA单克隆抗体。此时，若使用上述对应表位以SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为基准存在于以下(1)、(2)或(3)区的3种单克隆抗体中的两种来进行，则可以进行灵敏度和特异性特别优异的免疫测定，因此优选。

(1)41～60aa和312～322aa区、

(2)61～80aa和290～300aa区、或

(3)101～113aa和268～278aa区。

定量检体中的H5亚型A型流感病毒时，可以优选采用ELISA等以微量培养板的孔或珠粒为固相的夹层法。另一方面，想要在医疗现场迅速、简便地检测检体中的H5亚型A型流感病毒时，优选采用免疫色谱法(经常简记作“免疫色谱”)。免疫色谱法本身及其中使用的器具(以下，有时称作“免疫色谱器具”)众所周知，在下述实施例中也有具体记载。

对侧流式的免疫色谱法简单说明如下。在由硝基纤维素膜这样的多孔性材料构成的、通常为带状的基质上包括：将第1抗H5HA单克隆抗体固相化的检测区带；以及位于其上游(后述的展开液流动方向的上流侧)、滴注标记的第2抗H5HA单克隆抗体的标记试剂区带。在标记试剂区带添加检体，并且标记抗体必需从标记试剂区带流出、并流入基质内，所以通常标记试剂区带由滴注标记抗体的多孔性衬垫构成。在基质的上游端设有贮藏展开液的展开液槽。并且，通常在上述检测区带的下游，由展开确认部和展开液吸收区带构成，所述展开确认部用于确认标记抗体是否展开、并固相化有抗标记抗体；所述展开液吸收区带位于上述展开确认部的下游，设有用于吸收流来的展开液的多孔性吸收衬垫。并且，当标记为酶标记时，在标记试剂区带的上游设有滴注标记酶的底物的底物区带。

使用时，在标记试剂区带添加检体，展开液槽破裂，展开液向基质的上端部展开。展开液利用基质的毛细现象流向下游。展开液通过底物区带时，底物被洗脱到展开液中，含有底物的展开液向前流动。展开液通过标记试剂区带时，标记抗体和检体被洗脱到展开液中，含有底物、标记抗体和检体的展开液向前流动。检体中含有H5亚型A型流感病毒时，该病毒的HA与标记抗体通过抗原抗体反应结合。它们的混合物流动至检测区带时，在检测区带中固相化抗体与该病毒的HA通过抗原抗体反应结合。其结果，经由该病毒的HA，标记抗体被固定在检测区带。因此，通过测定固定在检测区带的标记，可以检测该病毒。检体中不含有H5亚型A型流感病毒时，固相化抗体上没有结合任何物质，所以标记抗体不会被固定在检测区带，进一步流向下游。因此，在检测区带检测不到标记。在检测区带下游的展开液确认部，抗标记抗体被固相化，所以标记抗体被固定在展开液确认部。在展开液确认部检测到标记时，确认展开液顺利地流动至此。展开液进一步被其下游的吸收衬垫吸收。

作为适用于本发明的免疫测定方法的检体，只要是想要检测是否含有H5亚型A型流感病毒的检体即可，可以是任何物质，可以是血液(包括全血、血浆、血清)、唾液、痰等体液或粘膜的擦拭液(ぬぐい液)、器具或设备的擦拭液等，但并不限于这些。

以下，根据实施例来更具体地说明本发明。但本发明并不限于下述实施例。

实施例

参考例1免疫用和ELISA/蛋白质印迹法(WB)用H5亚型A型流感病毒(H5N1)抗原的制备

将弱毒流感病毒株A/duck(鸭)/Hokkaido(北海道)/Vac-1/04(H5N1)(Genbank检索号：AB259712、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50)感染发育鸡胚浆尿液(鶏卵漿尿液)以27000rpm的转速于4℃下超速离心1.5小时，以小丸(pellet)的形式回收病毒。小丸用PBS溶解后，通过蔗糖梯度离心法回收含有病毒的馏分(fraction)。再次进行超速离心，除去蔗糖，得到纯化病毒溶液。纯化病毒用福尔马林或TritonX-100(商品名)灭活，作为免疫、ELISA和WB用抗原。福尔马林处理如下进行：向纯化病毒溶液中加入福尔马林，使终浓度达到0.2％，在4℃下静置1周。TritonX-100(商品名)处理通过向纯化病毒溶液中加入3倍量的细胞提取用缓冲液(0.05M Tris-HCl、pH8.0、0.6M KCl、0.5％TritonX-100(商品名))来进行。确认病毒灭活时，将灭活处理的病毒接种在10日龄发育鸡胚中，培养2天，之后通过病毒感染发育鸡胚浆尿液的红细胞凝集(HA)试验确认不到HA效价，从而确认病毒灭活。

参考例2特异性确认(IF、WB)用H5亚型A型流感病毒(H5N1)抗原的制备

用于已建立的抗体的特异性确认的病毒感染Madin-Darby犬肾(Madin-Darby canine kidney，MDCK)细胞(获取自北海道大学)及其细胞提取液的制作如下进行。就荧光抗体法(IF)用抗原而言，在腔室玻片上培养MDCK细胞直至铺满成整片状(フルシ一ト)，之后用添加有胰蛋白酶的MEM(未添加血清)稀释各流感病毒至最佳浓度，接种在细胞中，在CO₂培养箱中35℃下培养16小时，之后用冷丙酮固定细胞，作为特异性确认用IF用玻片。

就WB用抗原而言，在培养皿中培养MCDK细胞直至铺满成整片状，在与IF用抗原制作同样最优化的病毒溶液中加入含有胰蛋白酶的无血清MEM，将所得病毒溶液加入到细胞中，在35℃下培养16小时，培养结束后，向培养皿中加入细胞溶解缓冲液溶解细胞，以14000rpm的转速离心5分钟，将该上清作为特异性确认用WB用抗原。

实施例1A型流感病毒(H5)血凝素特异性单克隆抗体的确立

使用参考例1中制作的纯化灭活流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)对小鼠进行免疫，将同一只小鼠的后肢淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合来制作。即，使用经弗氏完全佐剂乳化的纯化灭活流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)，以50～100μg/小鼠对BALB/C小鼠的足垫给药，进行初次免疫，2～3周后，使用不含佐剂的纯化灭活流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)，以50～100μg/小鼠进行加强免疫。抗体效价的确认通过使用包被有TritonX100处理纯化流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)抗原的96孔ELISA板的固相ELISA、以及利用同一抗原进行的WB来进行。对于确认到抗体效价上升的小鼠，使用纯化灭活流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)，以25～50μg对足垫给药，进行免疫，3～4天后，由小鼠下肢淋巴结制备淋巴细胞。将之前用RPMI-1640培养基培养的小鼠骨髓瘤细胞(P3U1)与脾细胞以1∶2～1∶5的比例混合，使用聚乙二醇(PEG；ベ一リンガ一社制)进行细胞融合。融合的细胞悬浮于HAT培养基中，之后分别注入96孔培养板中，在37℃的CO₂培养箱中培养。

产生抗体的筛选通过上述所示的固相ELISA来进行。即，将TritonX-100(商品名)处理纯化流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)抗原以1μg/ml的浓度、按50μl/孔分别注入96孔ELISA板(ヌンク社制)中，在4℃下放置一夜，使其吸附。将孔用1％脱脂乳封闭后，用清洗缓冲液(含0.05％Tween20的PBS)清洗3次，加入50μl进行了细胞融合的板中的培养上清，在37℃下反应1小时。同样，用清洗缓冲液清洗3次，之后加入POD标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DACO社制)，再于37℃下反应1小时。用清洗缓冲液清洗4次后加入底物ABTS，选择可见显色的孔。接下来，将所选择的孔的细胞移入48孔或24孔培养板中，在37℃的CO₂培养箱中培养，之后通过WB确认与血凝素反应。WB如下进行：对TritonX-100(商品名)处理纯化流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)抗原进行SDS-PAGE后，转移到硝基纤维素膜上，使用所制作的膜，按照常规方法来进行。通过WB确认与血凝素反应的孔的细胞通过极限稀释法形成单一克隆，确立产生以下所示的与抗流感(H5N1)血凝素反应的单克隆抗体的各种杂交瘤。

为了除去表位发生交叉的克隆，通过抑制试验首先除去竞争的单克隆抗体，只选择互相不竞争的单克隆抗体。该抑制试验具体如下进行。与Mab的筛选一样，制作吸附有纯化流感病毒的96孔ELISA板，向各孔中同时加入数倍高浓度的抑制用Mab和等量的碱性磷酸酶标记Mab，在37℃下反应1小时。清洗后加入底物pNPP，确认各Mab是否抑制标记Mab与固相的反应。将所选择的14种单克隆抗体进行各种组合，利用后述方法实际制作用作后述免疫色谱器具(イムノクロマト器具)的固相抗体和标记抗体的免疫色谱器具，使用所制作的免疫色谱器具，实际检测检体中的A型流感病毒，确立给予优异的灵敏度和特异性(如下所述，不与其他HA亚型进行交叉反应)的3种单克隆抗体IFH5-115、IFH5-136、IFH5-26和分别产生上述单克隆抗体的3种杂交瘤IFH5-115、IFH5-136、IFH5-26(以下，有时将单克隆抗体IFH5-115、IFH5-136、IFH5-26分别称作单克隆抗体115(或Mab115)、单克隆抗体136(或Mab136)和单克隆抗体26(或Mab26))。需要说明的是，如下所述，这些单克隆抗体不具有对A型流感病毒的中和活性。

实施例2通过IF和WB确认单克隆抗体的反应特异性

IF法如下进行。即，向参考例2中制作的特异性确认用IF用玻片上添加单克隆抗体的培养上清或腹水(用含有1％BSA的PBST稀释)，在室温下反应1小时，之后用PBS清洗，使之与荧光色素标记抗小鼠IgG(用含有1％BSA的PBST稀释1000倍)在室温下反应30分钟。用PBS清洗后，用甘油密封，在荧光显微镜下观察。使用参考例2制作的抗原，按照常规方法进行WB。

虽然在任一种方法中均确认到单克隆抗体IFH5-115、IFH5-136、IFH5-26与弱毒型H5N1流感HA反应，但这些单克隆抗体与其他亚株的HA或强毒型H5N1的反应根据方法而不同。因此，对于这些单克隆抗体要通过实际的测定系统(EL)来确认。

实施例3抗流感H5N1型病毒单克隆抗体的对应表位分析

3-1N末端缺失质粒的制作

为了确定Mab 26、115和136的N末端侧的识别位点，通过PCR法扩增包含564个氨基酸的流感H5N1株A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)的HA(SEQ ID NO：2)中1～564aa(A片段)、1～514aa(B片段)、21～514aa(C片段)、101～500aa(D片段)、151～500aa(E片段)和201～500aa(F片段)这6个片段。在各引物中预先附加BamHI、XbaI位点。扩增片段用QIAGEN社的PCR纯化试剂盒进行纯化，插入到在表达用质粒pW6A的NdeI-EcoRI位点插入有GST的表达用质粒pWG6A的BamHI、XbaI位点，制作质粒pWGInf.H5N1-N-A、pWGInf.H5N1-N-B、pWGInf.H5N 1-N-C、pWGInf.H5N1-N-D、pWGInf.H5N1-N-E和pWGInf.H5N1-N-F。使用它们来转化大肠杆菌BL21(DE3)(从Brookhaven National Laboratory获取)，得到氨苄青霉素抗性的转化体大肠杆菌BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-A、BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-B、BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-C、BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-D、BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-E和BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-F。3-2重组蛋白(GST+Inf.H5N1-N-A、GST+Inf.H5N1-N-B、GST+Inf.H5N1-N-C、GST+Inf.H5N1-N-D、GST+Inf.H5N1-N-E和GST+Inf.H5N1-N-F)的表达和蛋白质印迹法

将3-1中制作的转化体在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中、于37℃下培养。通过预培养使在600nm处OD达到0.6～0.8，之后添加1mM的IPTG，进行表达诱导，再培养3小时。将1.5ml量的菌体培养液以5,000rpm的转速离心2分钟，收集菌体，悬浮于100μl缓冲液(10mM Tris-盐酸、pH8.0、0.1M氯化钠、1mM EDTA)中，通过15分钟的超声破碎，将菌体完全粉碎。以此作为菌体试样。

向8μl菌体试样中加入4μl 3倍浓度的SDS聚丙烯酰胺缓冲液(0.15M Tris-盐酸、pH6.8、6％SDS、24％甘油、6mM EDTA、2％2-巯基乙醇、0.03％溴酚蓝)，充分搅拌，之后在100℃下加热处理，供给电泳。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使用e-PAGEL 12.5％凝胶浓度(商品名、ATTO社制)，按照常规方法进行。电泳后转移到PVDF膜(ATTO社制)上，用1％BSA在4℃下封闭一夜。除去封闭液，用PBS-Tween(商品名)清洗，之后加入调整至2μg/ml的浓度的单克隆抗体26、115和136，在室温下反应60分钟。用PBS-Tween(商品名)充分清洗后，与利用反应用液稀释至5000倍的过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白兔多克隆抗体(ダコ社制)反应，清洗后，使用ECL蛋白质印迹法检测系统(GE Healthcare Biosciences社制)，对即显胶片(富士film社制)曝光1～15分钟，检测信号。其结果见图4。单克隆抗体26和115与A、B和C片段反应，不与D片段反应。单克隆抗体136与A、B、C和D片段反应，不与E片段反应。因此，判明单克隆抗体26和115识别21～100aa区、而单克隆抗体136识别101～150aa区。

3-3N末端缺失质粒的制作

接下来，通过PCR法扩增进一步细分流感H5N1的21～400氨基酸片段而得到的片段N1(21～400aa)、N2(41～400aa)、N3(61～400aa)、N4(81～400aa)、N5(101～400aa)、N6(114～400aa)、N7(127～400aa)和N8(139～400aa)。将扩增片段用QIAGEN社的PCR纯化试剂盒进行纯化，插入昆虫细胞表达用质粒pBac-EGTs-6A(改变Invitrogen社制pFastBacl载体)的BamHI-XbaI位点，制作质粒pBacInf.H5N1-N1、pBacInf.H5N1-N2、pBacInf.H5N1-N3、pBacInf.H5N1-N4、pBacInf.H5N1-N5、pBacInf.H5N1-N6、pBacInf.H5N1-N7和pBacInf.H5N1-N8。将它们转化成Bacmid制作用大肠杆菌DH10Bac，制作Bacmid-Inf.H5N1-N1、Bacmid-Inf.H5N1-N2、Bacmid-Inf.H5N1-N3、Bacmid-Inf.H5N1-N4、Bacmid-Inf.H5N1-N5、Bacmid-Inf.H5N1-N6、Bacmid-Inf.H5N1-N7和Bacmid-Inf.H5N1-N8。3-4重组蛋白(Inf.H5N1-N1、Inf.H5N1-N2、Inf.H5N1-N3、Inf.H5N1-N4、Inf.H5N1-N5、Inf.H5N1-N6、Inf.H5N1-N7和Inf.H5N1-N8)的表达

将3-3中制作的8种BacmidDNA转染到昆虫细胞Sf-21(Invitrogen社制)中，制作重组病毒P1-N1、P1-N2、P1-N3、P1-N4、P1-N5、P1-N6、P1-N7和P1-N8。用它们的P1的一部分感染Sf21细胞，在27℃下培养4天，之后以3000rpm的转速离心20分钟，回收培养上清。将其作为ELISA的试样。

采用将与139～400氨基酸区反应的单克隆抗体254固相化的ELISA法。即，将单克隆抗体254稀释至2μg/mL的浓度，向微量培养板组件(Nunc社制)的各孔中分别注入50μL，在4℃下培养一夜，将其固相化。接下来，用含有0.1％Tween20(商品名)的PBS(PBS-Tween(商品名))清洗各孔，之后加入100μL用PBS稀释的1％牛血清白蛋白(BSA)，在37℃下封闭1小时。除去封闭液后，加入50μl生物素化单克隆抗体26、115和126，在37℃下反应1小时。用PBS-Tween(商品名)充分清洗后，向各孔中分别加入50μl利用反应用液稀释2,000倍的碱性磷酸酶标记链霉亲和素(DAKO社制)，在37℃下反应1小时。反应后，用PBS-Tween(商品名)充分清洗，向各孔中分别加入50μl对硝基苯基磷酸，在室温下反应30分钟，之后向各孔中分别加入50μl反应停止液，波长405nm处测定显色水平(吸光度)。如表1所示，可以推定：单克隆抗体26在61～80氨基酸区存在表位，单克隆抗体115在41～60氨基酸区存在表位，单克隆抗体136在101～113氨基酸区存在表位。

[表1]

3-5C末端缺失质粒的制作

为了确定单克隆抗体26、115和136的C末端侧的识别位点，通过PCR法扩增包含564个氨基酸的流感H5N1株A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)的HA(SEQ ID NO：2)的21～400aa(A片段)、21～333aa(B片段)、21～266aa(C片段)、21～200aa(D片段)和21～133aa(E片段)这5个片段。预先在各引物中附加BamHI、XbaI位点。将扩增片段用QIAGEN社的PCR纯化试剂盒纯化，插入在表达用质粒pW6A的NdeI-EcoRI位点插入有GST的表达用质粒pWG6A的BamHI、XbaI位点，制作质粒pWGInf.H5N1-C-A、pWGInf.H5N1-C-B、pWGInf.H5N1-C-C、pWGInf.H5N1-C-D和pWGInf.H5N1-C-E。使用这些质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(由Brookhaven National Laboratory获取)，得到氨苄青霉素抗性的转化体大肠杆菌BL21(DE3)pWGInf.H5N1-C-A、BL21(DE3)pWGInf.H5N1-C-B、BL21(DE3)pWGInf.H5N1-C-C、BL21(DE3)pWGInf.H5N1-C-D、BL21(DE3)pWGInf.H5N1-C-E。3-6重组蛋白(GST+Inf.H5N1-C-A、GST+Inf.H5N1-C-B、GST+Inf.H5N1-C-C、GST+Inf.H5N1-C-D和GST+Inf.H5N1-C-E)的表达和蛋白质印迹法

在2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃下培养3-5中制作的转化体。通过预培养使600nm处的OD达到0.6～0.8后，添加1mM的IPTG，进行表达诱导，再培养3小时。将1.5ml量的菌体培养液以5,000rpm的转速离心2分钟，集合菌体，悬浮于100μl缓冲液(10mMTris-盐酸、pH8.0、0.1M氯化钠、1mM EDTA)中，通过15分钟的超声破碎，将菌体完全破碎。将其作为菌体试样。

向8μl菌体试样中加入4μl 3倍浓度的SDS聚丙烯酰胺缓冲液(0.15M Tris-盐酸、pH6.8、6％SDS、24％甘油、6mM EDTA、2％2-巯基乙醇、0.03％溴酚蓝)，充分搅拌，之后在100℃下加热处理，供给电泳。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使用e-PAGEL 12.5％凝胶浓度(商品名、ATTO社制)，按照常规方法进行。电泳后，转移到PVDF膜(ATTO社制)上，用1％BSA在4℃下封闭一夜。除去封闭液，用PBS-Tween(商品名)清洗，之后加入调整至2μg/ml的浓度的单克隆抗体26、115和136，在室温下反应60分钟。用PBS-Tween(商品名)充分清洗，之后与用反应用液稀释至5000倍的过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白兔多克隆抗体(ダコ社制)反应，清洗，之后使用ECL蛋白质印迹法检测系统(GE Healthcare Biosciences社制)，对即显胶片(富士film社制)曝光1～15分钟，检测信号。其结果见图5。单克隆抗体26、115和136与A和B片段反应，不与C片段反应。因此，判明单克隆抗体26、115和136识别267～333氨基酸区。

3-7C末端缺失质粒的制作

接下来，通过PCR法扩增进一步细分流感H5N1的267～333aa片段而得到的片段C1(41～333aa)、C2(41～322aa)、C3(41～311aa)、C4(41～300aa)、C5(41～289aa)、C6(41～278aa)和C7(41～267aa)。将扩增片段用QIAGEN社的PCR纯化试剂盒纯化，插入昆虫细胞表达用质粒pBac-EGTs-6A(改变Invitrogen社制pFastBacl载体)的BamHI-XbaI位点，制作质粒pBacInf.H5N1-C1、pBacInf.H5N1-C2、pBacInf.H5N1-C3、pBacInf.H5N 1-C4、pBacInf.H5N1-C5、pBacInf.H5N1-C6和pBacInf.H5N1-C7。将它们转化成Bacmid制作用大肠杆菌DH10Bac，制作Bacmid-Inf.H5N1-C1、Bacmid-Inf.H5N1-C2、Bacmid-Inf.H5N1-C3、Bacmid-Inf.H5N1-C4、Bacmid-Inf.H5N1-C5、Bacmid-Inf.H5N1-C6和Bacmid-Inf.H5N1-C7。

3-8重组蛋白(Inf.H5N1-C1、Inf.H5N1-C2、Inf.H5N1-C3、Inf.H5N1-C4、Inf.H5N1-C5、Inf.H5N1-C6和Inf.H5N1-C7)的表达

将3-7中制作的7种BacmidDNA转染到昆虫细胞Sf-21(Invitrogen社制)中，制作重组病毒P1-C1、P1-C2、P1-C3、P1-C4、P1-C5、P1-C6和P1-C7。用它们的P1的一部分感染Sf21细胞，在27℃下培养4天，之后以3000rpm的转速离心20分钟，回收培养上清。将其作为酶联免疫吸附测定(ELISA法)的试样。

采用将与41～333aa区反应的单克隆抗体270固相化的ELISA法。即，将单克隆抗体270稀释至2μg/ml的浓度，向微量培养板组件(Nunc社制)的各孔中分别加入50μl，在4℃下培养一夜，将其固相化。接下来，用含有0.1％Tween 20(商品名)的PBS(PBS-Tween)(商品名)清洗各孔，之后加入100μl用PBS稀释的1％牛血清白蛋白(BSA)，在37℃下封闭1小时。除去封闭液，之后加入50μl生物素化单克隆抗体26、115和126，在37℃下反应1小时。用PBS-Tween(商品名)充分清洗，之后向各孔中分别加入50μl利用反应用液稀释2000倍的碱性磷酸酶标记链霉亲和素(DAKO社制)，在37℃下反应1小时。反应后，用PBS-Tween(商品名)充分清洗，向各孔中分别加入50μl对硝基苯基磷酸，在室温下反应30分钟，之后向各孔中分别加入50μl反应停止液，在波长405nm处测定显色水平。如表2所示，可以推定：单克隆抗体26在290～300氨基酸区存在表位，单克隆抗体115在312～322氨基酸区存在表位，单克隆抗体136在268～278氨基酸区存在表位。

[表2]

汇总3-1～3-8，由此推定：单克隆抗体26识别61～80aa和290～300aa区，单克隆抗体115识别41～60aa和312～322aa区，单克隆抗体136识别101～113aa和268～278aa区，即、这些单克隆抗体识别高级结构(参照图3)。

实施例4中和抗体活性测定

就单克隆抗体IFH5-115、IFH5-136、IFH5-26对H5亚型A型流感病毒是否具有中和抗体活性进行试验。流感病毒使用A/dk/Hokkaido/84/02(H5N3)和A/PR/8/34(H1N1)。各单克隆抗体用Eagle’s MEM培养基稀释2n，将50μL各抗体稀释液添加到96孔板中。稀释A/dk/Hokkaido/84/02(H5N3)和A/PR/8/34(H1N1)以达到200TCID₅₀/25μL，向各抗体稀释孔中添加25μL该病毒稀释液(蛋白浓度：0～160μg/25μL)。在室温下培养1小时(病毒-抗体混合液)。另一方面，预先用含有10％胎牛血清的Eagle’s MEM培养基将MDCK细胞培养至融合(confluent)，除去培养上清，向用Eagle’s MEM培养基清洗了1次的MDCK培养-48孔板中添加75μL上述病毒-抗体混合液，在35℃下培养1小时。接下来，向各孔中添加150μL含有0.0005％胰蛋白酶的Eagle’s MEM培养基，在35℃、5％二氧化碳存在下开始培养。在培养的第3天，在显微镜下确认由病毒的细胞毒的中和抗体活性产生的阻碍，确认是否存在中和活性。当产生细胞毒时，观察到由病毒感染引起的细胞融合所导致的细胞圆形化。但未产生细胞毒时，可以判断单克隆抗体具有该病毒的中和活性。

作为本测定系统的对照，以未添加抗体的孔作为病毒活性对照，并使用具有中和活性的A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(SEQ ID NO：2)的鸡抗血清作为中和抗体对照。试验结果见表3～表6。

用作中和抗体对照的鸡抗血清(对A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(SEQ ID NO：2)进行免疫得到的血清)，相对于A/dk/Hokkaido/84/02(H5N3)和A/PR/8/34(H1N1)稀释至64倍，仍确认到中和抗体活性，而单克隆抗体IFH5-115、IFH5-136、IFH5-26没有显示出中和活性。

[表3]

病毒：A/dk/Hokkaido/84/02(H5N3)10^2TCID50/25uL(孔)

CPE

[表4]

病毒：A/PR/8/34(H1N1)10^2TCID50/25uL(孔)

CPE

[表5]

CPE

[表6]

CPE

实施例5流感A型H5免疫测定(免疫色谱)器具1的制作

如图6所示，在宽5mm、长50mm的硝基纤维素膜(ミリポア社制)的距离基质2的展开液吸收区带5侧末端15mm的位置，在硝基纤维素膜上滴注(点着)0.7μl含抗流感A型H5特异性抗体(IFH5-26)的水溶液，使之干燥，制成检测区带6。进一步在距离基质2的展开液吸收区带5侧末端12mm的位置滴注抗碱性磷酸酶抗体(兔)，使之干燥，制成展开确认部10。然后，在基质上滴注5μl将IFH5-115抗体用碱性磷酸酶标记的碱性磷酸酶标记抗流感A型H5特异性抗体(ALP-IFH5-115，10μg/ml)，使之干燥，制成包含酶标记试剂衬垫(pad)4的标记试剂区带。

对于展开液衬垫3，在宽6mm、长20mm的滤纸(ミリポア社制)上滴注作为底物的100μg 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)成宽6.0mm的线状，使之干燥，制成底物区带7。将上述基质2、展开液衬垫3、酶标记试剂衬垫4和吸收衬垫5(宽10mm、长15mm、厚1mm的滤纸(ワツトマン社制))固定在具有展开液槽11的塑料箱上，制造图7和图8所示的流感A型H5免疫测定器具1。

实施例6流感A型H5免疫测定器具2的制作

与实施例5之图6一样，在宽5mm、长50mm的硝基纤维素膜(ミリポア社制)的距离基质2的展开液吸收区带5侧末端15mm的位置，在硝基纤维素膜上滴注0.7μL含抗流感A型H5特异性抗体(IFH5-136)的水溶液，使之干燥，制成检测区带6。进一步在距离基质2的展开液吸收区带5侧末端12mm的位置滴注抗碱性磷酸酶抗体(兔)，使之干燥，制作展开液确认部10。然后，在基质上滴注5μL将IFH5-115抗体用碱性磷酸酶标记的碱性磷酸酶标记抗流感A型H5特异性抗体(ALP-IFH5-115，10μg/mL)，使之干燥，制作包含酶标记试剂衬垫4的标记试剂区带。

与实施例5一样，进一步制作滴注底物并干燥的展开液衬垫3，将上述基质2、酶标记试剂衬垫4和吸收衬垫5一同固定在具有展开液槽11的塑料箱上，制造与上述图6和图7相同的流感A型H5免疫测定器具2。

实施例7流感A型H5免疫测定器具3的制作

与实施例5之图6一样，在宽5mm、长50mm的硝基纤维素膜(ミリポア社制)的距离基质2的展开液吸收区带5侧末端15mm的位置，在硝基纤维素膜上滴注0.7μL含抗流感A型H5特异性抗体(IFH5-136)的水溶液，使之干燥，制成检测区带6。进一步在距离基质2的展开液吸收区带5侧末端12mm的位置滴注抗碱性磷酸酶抗体(兔)，使之干燥，制成展开液确认部10。然后，在基质上滴注5μL将IFH5-26抗体用碱性磷酸酶标记的碱性磷酸酶标记抗流感A型H5特异性抗体(ALP-IFH5-26，10μg/mL)，使之干燥，制作包含酶标记试剂衬垫4的标记试剂区带。

与实施例5一样，进一步制作滴注底物并干燥的展开液衬垫3，将上述基质2、酶标记试剂衬垫4和吸收衬垫5一同固定在具有展开液槽11的塑料箱上，制造与上述图6和图7相同的流感A型H5免疫测定器具3。

实施例8使用免疫测定器具1、2和3测定流感A型的各亚型

使用上述实施例5、6和7中制造的流感A型H5免疫测定(免疫色谱)器具1、2和3(本发明测定器具)，并使用各种流感A型病毒亚型检体，进行免疫测定器具与流感A病毒亚型(H1-15)的反应特异性试验。所用的流感A型病毒亚型检体使用用孵化鸡胚培养各病毒后回收的红细胞凝集效价(HA效价)已知的浆尿液(参照表4)。各浆尿液用试样稀释液(含表面活性剂的Tris缓冲液(pH8.0))稀释10倍，将其中的30μL滴加在检体滴注区带8中(表3)，之后对设在变形部材上的压入部12的下方加压使之变形，通过设在变形部材上的突起部13将展开液衬垫3插入展开液槽11中，向展开液衬垫3供应展开液，开始测定。测定开始15分钟后，根据对象试剂区带10的显色确认展开液的展开，之后目视测定检测区带6的显色。其结果见表7。由此确认：本免疫测定器具均可特异性地检测流感A型病毒H5亚型，而不与其他流感A型病毒亚型(H1-4和H6-15)反应。

进一步就免疫测定器具与流感A型病毒H5亚株的特异性和检测灵敏度进行试验。作为流感A型病毒H5亚株，使用用孵化鸡胚培养各病毒后回收的红细胞凝集效价(HA效价)已知的浆尿液(参照表7)。各浆尿液用试样稀释液(含表面活性剂的Tris缓冲液(pH8.0))连续稀释，将其中的30μL滴加在检体添加区带8中，之后对设在变形部材上的压入部12的下方加压使之变形，通过设在变形部材上的突起部13将展开液衬垫3插入展开液槽11中，向展开液衬垫3供应展开液，开始测定。测定开始15分钟后，根据展开确认部10的显色确认展开液的展开，之后目视测定检测区带6的显色。其结果见表8。检测灵敏度以连续稀释各浆尿液得到的稀释液的可以检测的最高稀释倍数表示。本免疫测定器具均可检测所试验的流感A型病毒H5亚株。

实施例9用于同时测定流感A型和流感AH5的免疫测定器具4的制作

如图9所示，在宽5mm、长50mm的硝基纤维素膜(ミリポア社制)的距离基质2的展开液吸收区带5侧末端16mm和13.5mm的位置，在硝基纤维素膜上分别滴注0.7μL含有参考例2制造的抗H5亚型A型流感病毒血凝素H5特异性抗体(IFH5-26)和抗流感A型病毒抗体(FVA2-11)(文献：Gui-Rong BAI等人：Improvement of a RapidDiagnosis Kit to Detect Either Influenza A or B Virus Infection.J.Vet.Med.Sci.68(1)；1-6，2006)的水溶液，使之干燥，制成检测区带6a和6b。进一步在距离基质2的展开液吸收区带5侧末端11mm的位置，滴注抗碱性磷酸酶抗体(兔)，使之干燥，制作展开确认部10。然后，在基质上滴注5μL参考例1制造的碱性磷酸酶标记抗流感A型病毒抗体(5μg/mL)与碱性磷酸酶标记抗流感A型H5特异性抗体(ALP-IFH5-115(10μg/mL)的混合水溶液，使之干燥，制成包含酶标记试剂衬垫4的标记试剂区带。

展开液衬垫3如下制作：在宽6mm、长20mm的滤纸(ミリポア社制)上，滴注作为底物的100μg 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)成宽6.0mm的线状，使之干燥，即可。将上述基质2、展开液衬垫3、酶标记试剂衬垫4和吸收衬垫5(宽10mm、长15mm、厚1mm的滤纸(ワツトマン社制))固定在具有展开液槽11的塑料箱上，制造图10和图8所示的流感A型病毒和A型H5病毒同时免疫测定器具4。

实施例10利用同时免疫测定器具4测定流感A型的各亚型

在实施例9制造的流感A型病毒和A型H5病毒同时免疫测定器具4(本发明测定器具)的检体添加区带8中添加各30μL表7或表8记载的流感A型病毒的亚型试样(试样稀释液使用含表面活性剂的Tris缓冲液(pH8.0))，之后对设在变形部材上的压入部12的下方加压使之变形，通过设在变形部材上的突起部13将展开液衬垫3插入展开液槽11中，向展开液衬垫3中供应展开液，开始测定。测定开始15分钟后，根据展开确认部10的显色确认展开液的展开，之后目视测定检测区带6a和6b的显色。

用孵化鸡胚培养流感A亚型H1～H15，使用所得的浆尿液进行试验，结果如下：对于H5株，见到检测区带6a和6b这两条线显色；而对于H5以外的H1～H4、H6～H15，只见到检测区带6b(A型共通检测线)显色。使用非感染的浆尿液时，检测区带6a和6b没有显色。