一种芒属植物南荻体胚组培快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种芒属植物南荻体胚组培快速繁殖方法，其步骤是：A、幼穗选取：选取处于颍花原基形成期的幼穗；B、用初代诱导培养基诱导：剪成小段，用7酒精消毒，然后用氯化汞浸泡，无菌水冲洗，将其接种在幼穗的初代诱导培养基上，初代诱导，获得胚性愈伤；C、用生苗培养基继代培养：所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗；D、用生根诱导培养基生根诱导：所生幼苗在在生根诱导培养基上诱导生根；E、驯化移栽：在温室内，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，移栽到苗圃中，照明，光照，获得了的南荻幼苗。方法易行，操作简便，且分化出愈率和成苗率很高，成活率高，适用于南荻种苗的产业化生产以及为后续转基因奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及南荻（Triarrhena lutariorqmia L．L.liu）基于胚性愈伤的组培快繁技术领域，更具体涉及一种芒属植物南荻体胚组培快速繁殖方法，它适应于以南荻幼穗为外植体通过愈伤诱导途径获得幼苗，以及增值、生根、驯化与移栽。

背景技术

   国内关于芒属植物的组培快繁技术，在20世纪90年代就有相关报道，他们分别采用了幼叶、下胚轴、幼根，幼穗作为外植体进行芒属植物的快繁技术，但其岀愈率和分化率都各不相同，以幼穗的繁殖效率最高，但未获得胚性愈伤。另外，在2005年也有关于芒属植物组培快繁技术的报道，利用了茎秆扦插技术得到了幼苗，但是这也是利用的器官发生途径，也没得到胚性愈伤。而本研究是利用幼穗为外植体得到了胚性愈伤，再继续诱导分化、成苗并移栽。因此，本研究不仅达到了快速高效的繁殖南荻的目的，同时为南荻的转基因操作提供了可靠的组培体系。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种芒属植物南荻体胚组培快速繁殖方法，方法易行，操作简便，且分化出愈率和成苗率很高，本方法胚性愈伤出愈率较高，愈伤再诱导生苗率较高，组培苗驯化移栽后，成活率高，适用于南荻种苗产业化生产的快速扩繁，也适用于南荻的转基因操作。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

南获（Triarrhena lutariorqmia L．L.lju）是中国特有的和本科植物，原产于中国长江流域、伴生于芦苇丛中的高大草本植物，植物学分类归属禾本科、芒属。南荻种中有多个变种和变型，主要分布在河流、湖泊、沿海滩涂水陆过度地带，在洞庭湖医自然群落面积很大，植物群落密度高，形如一片片竹林，适应水涨水落生境，具有水土保持、固堤防洪，净化水体、空气，维护自然生态系统等作用。它具有C4植物高光效、生长快速、耐湿耐早的特性。大面积人工栽培可成为工农业原料生产基地和旅游观光景点；建立人工生境湿地，在园林绿地或湿地可作观赏植物少量种植。另外，南获茎秆是重要的造纸原料，其茎秆纤维细胞含量为43％～65％，平均长度约3m，最长纤维达6．8 m，长宽比值平均为182.5，中部为209.4,产量和质量均优于芦苇、麻类、毛竹、杨树和柳树，是一种非常优质的造纸原料。本发明基于上述南荻的优良特性和巨大的应用价值，开发出一种获得南荻无菌幼苗的快繁体系，在此基础上可以培育出更加优良的南荻品种，为改善南荻的品质和丰富其种质资源打下基础。

本发明的内容包括以南荻幼穗为外植体诱导胚性愈伤的初代培养基，生苗继代培养基，以及幼苗的生根诱导培养基。

一种芒属植物南荻体胚组培快速繁殖方法，其步骤是：

（1）                     幼穗选取：选取处于颍花原基形成期的幼穗，幼穗内种子尚未形成，中轴也比较软，还没形成基本的分支。 

（2）                     用初代诱导培养基诱导：将其剪成2-3厘米小段，先用75%（体积比，以下相同）酒精消毒25-35s，然后用0.1%（质量体积比，以下相同）氯化汞浸泡（3-5）分钟，再用无菌水冲洗2-4次，将其接种在幼穗的初代诱导培养基（初代诱导培养基是指为获得无性繁殖系所采用的接种外植体的培养基）上。经过（30-35）天的初代诱导，获得胚性愈伤。培养条件为24-28℃，每天光照14-16个小时（采用人工光源照射），光强为2000LX。初代诱导培养基为以下配方选其一：A：MS培养基附加激动素KT1-2mg/L，2，4二氯苯氧乙酸2,4-D1-5mg/L，蔗糖30g/L, PhytagelR 3g/L或B：MS培养基附加激动素KT1-4mg/L,2，4二氯苯氧乙酸2,4-D1-3mg/L，6水氯化镁MgCl₂·6H₂O800mg/L,蔗糖30g/L， PhytagelR 3g/L。采用这两种培养基中的任何一种培养基都能诱导出状态良好的胚性愈伤组织，生长10天左右在幼穗基部开始岀愈，开始愈伤为透明状白色，随着培养时间的增长在愈伤的表面逐渐长出白色或淡黄色愈伤，且有少部分愈伤上面有紫色小点。

（3）                     用生苗培养基继代培养：所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗，（30-35）天继代一次，增殖系数为2-3。培养条件为24-28℃，每天光照14-16个小时（采用人工光源照射），光强为2000LX。所述的生苗培养基配方为以下配方选其一：A：MS培养基附加激动素KT1-2mg/L，2，4二氯苯氧乙酸2,4-D1-3mg/L，蔗糖30g/L， PhytagelR 3g/L或B：MS培养基附加激动素KT1-2mg/L，2，4二氯苯氧乙酸2,4-D01-2mg/L， 6水氯化镁MgCl₂·6H₂O800mg/L，蔗糖30g/L， PhytagelR 3g/L。将胚型愈伤转到其中任何一种生苗培养基之后2-4天，愈伤开始转绿，6-8天开始分化出芽，9-11天即可形成小幼苗。

（4）                     用生根诱导培养基生根诱导：所生幼苗在在生根诱导培养基上诱导生根，培养（25-30）天，生根率达40%以上。培养条件为24-28℃，每天光照14-16个小时（采用人工光源照射），光强为2000LX。生根诱导培养基为以下配方选其一：A：1/2 MS培养基附加激动素KT1-3mg/L，2，4二氯苯氧乙酸2,4-D0.5-2mg/L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L或B：MS培养基附加激动素KT1-3mg/L，2，4二氯苯氧乙酸2,4-D0.5-2mg/L，蔗糖30g/L，活性炭3-8g/L，PhytagelR3g/L。将长到10-15厘米的幼苗转到任意一种生根培养基上，大概5天左右幼苗就会分化出大量白色或黄色的根，且根系发达。

（5）                     驯化移栽：在温室内，将生长健壮的、株高在5-6厘米的组培苗移栽到由沙子组成的驯化苗圃中驯化。每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15－20d后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。温室条件为15℃-25℃，照明使用卤光，光照14-16个小时（采用人工光源照射）个小时，光照强度为2000LX。获得了大量健壮的南荻幼苗。

本发明建立基于胚性愈伤的南荻组培快繁体系，增值率比较高（2-3倍），增值稳定，根系健壮，移栽成活率较高，是适于商业扩繁南荻的成熟技术。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明与现有技术相比，消毒方法简单，且效率高，初代污染率几乎为零。

2、本发明得到的愈伤繁殖率高，约为1000%。

3、本发明一次得到了组培快繁和转基因下游技术体系，为后续转基因工作打下基础。

附图说明

图1为一种南荻愈伤示意图。

此图为南荻诱导的愈伤图，从图中可以看出，愈伤表面有白色或者淡黄色愈伤，基部愈伤稍有水渍状。

图2为一种南荻幼苗示意图。

此图为南荻胚型愈伤转在分化培养基上长出的幼苗。

图3为一种南荻驯化移栽示意图。

此图为南荻幼苗的训话移栽到沙土中的图片。

具体实施方式

实施例1：

一种芒属植物南荻体胚组培快速繁殖方法，其步骤是：

1、幼穗选取：选取处于颍花原基形成期的幼穗，幼穗内种子尚未形成，中轴也比较软，还没形成基本的分支。 

2、初代诱导（诱导初代培养基）：将其剪成2或3厘米小段，先用75%酒精消毒25或28或30或33或35s，然后用0.1%氯化汞浸泡5分钟，再用无菌水冲洗三次，将其接种在幼穗的初代诱导培养基上。经过30天的初代诱导，获得胚性愈伤。培养条件为25℃，每天光照16个小时（采用人工光源照射），光强为2000LX。诱导初代培养基为：A：MS培养基附加激动素KT1-2mg/L，2，4二氯苯氧乙酸2,4-D1-5mg/L，蔗糖30g/L, PhytagelR 3g/L。生长10天左右在幼穗基部开始岀愈，开始愈伤为透明状白色，随着培养时间的增长在愈伤的表面逐渐长出白色或淡黄色愈伤，且有少部分愈伤上面有紫色小点。

3、            生苗继代培养（生苗培养基）：所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗，30天继代一次，增殖系数为2-3。培养条件为25℃，每天光照16个小时（采用人工光源照射），光强为2000LX。生苗培养基配方为：A：MS培养基附加激动素KT1-2mg/L，2，4二氯苯氧乙酸2,4-D1-3mg/L，蔗糖30g/L， PhytagelR 3g/L。将长势良好的胚型愈伤转到生苗培养基之后3天左右，愈伤开始转绿，7天左右开始分化出芽，10天左右即可形成5厘米左右小幼苗，30天左右长至15厘米左右。

4、            生根诱导（生根诱导培养基）：所生幼苗在在生根诱导培养基上诱导生根，培养30天，生根率达40%以上。培养条件为25℃，每天光照16个小时（采用人工光源照射），光强为2000LX。生根诱导培养基为：A：1/2 MS培养基附加激动素KT1-3mg/L，2，4二氯苯氧乙酸2,4-D0.5-2mg/L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L。将长到10-15厘米的幼苗转到生根培养基上，大概5天左右幼苗就会分化出大量白色或黄色的根，且根系发达。

5、驯化移栽：在温室内，将生长健壮的、株高在5-6厘米的组培苗移栽到由沙子组成的驯化苗圃中驯化。每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约 15 d后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。温室条件为20℃，照明使用卤光，光照16小时，光照强度为2000LX。

本发明解决技术问题的方案分以下步骤完成：

（1）幼穗选取：选取处于花序原基期的幼穗，幼穗内种子尚未形成，中轴也比较软，还没形成基本的分支。 

（2）初代诱导：将其剪成2-3厘米小段，先用75%酒精消毒30s，然后用0.1%氯化汞浸泡5分钟，再用无菌水冲洗三次，将其接种在幼穗的初代诱导培养基上。经过30天的初代诱导，获得胚性愈伤。培养条件为26±2℃，每天光照16个小时，光强为2000LX。

（3）生苗继代培养：所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗，30天继代一次，增殖系数为2-3。培养条件为26±2℃，每天光照16个小时，光强为2000LX。

（4）生根诱导：所生幼苗在在生根诱导培养基上诱导生根，培养30天，生根率达40%以上。培养条件为26±2℃，每天光照16个小时，光强为2000LX。

（5）驯化移栽：在温室内，将生长健壮的、株高在5-6厘米的组培苗移栽到由沙子组成的驯化苗圃中驯化。每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15－20d后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。温室条件为15℃-25℃，照明使用卤光，光照16小时，光照强度为2000LX。