一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法

摘要

本发明提供了一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法，在无菌厌氧条件下，利用厌氧菌，以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、Na

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用微生物厌氧发酵制氢的方法，尤其是一种利用高效厌氧菌制氢的方法。

背景技术

氢气作为新一代绿色能源，具有清洁、高效、可再生等特点，假如能够产业化生产，未来必定能够代替石油、天然气等化石能源，减轻对环境的压力。

此外，氢能不是一次能源，需要从含氢的化合物中制取。目前全世界90%以上的氢来自化石燃烧，其余为水电解制氢。不论是哪种制氢方法都要直接或间接消耗大量的化石能源。化石燃料储量有限，且趋于枯竭，同时，化石燃料燃烧时生成的温室气体，有毒气体等其他有机化合物，造成了严重的环境污染并使得全球气候发生变化。生物制氢以其原料来源丰富、价格低廉等特点越来越收到人们的关注，一旦规模化生产，将会是最有潜力的一种制氢方法。

生物制氢最先是在1966年由lewis提出的，然后20世纪70年代经历的石油危机使全球认识到了生物制氢的实用性和迫切性。直到90年代，当世界面临着能源与环境的双重压力时，生物制氢被再度提上了议事日程。生物制氢包括光合生物制氢和厌氧发酵制氢两种途径。后者具有产氢率高、产氢速率快、产氢持续稳定、反应装置的设计操作简单、原料来源广泛且成本低等特点，更易于实现规模化生产，因而成为生物制氢研究的主要方向。厌氧发酵制氢菌种包括专性厌氧菌和兼性厌氧菌，其中，专性厌氧菌的培养、运输及工业化条件苛刻，而兼性厌氧菌具有广泛的适应性，但兼性厌氧菌产氢效率没有专性厌氧菌高，在适当条件下合理培养，可以克服其缺点，专性厌氧菌将会是生物制氢工业化更理想的细菌。目前，专性厌氧菌种类比较少，缺乏新型菌种，产氢效率偏低，并且制氢条件待进一步优化。

通过专利检索，目前已有专利主要是对发酵底物、发酵装置和提高产氢效率的研究，如一种污泥与有机垃圾混合生物制氢的方法（申请号：200710032658.0 周少奇等），光合微生物制氢反应器（申请号：200620032282.4），生物发酵制氢装置（申请号：00231651.X 沈建权），一种利用CO₂使藻类快速增殖直接用于生物制氢的方法 （200710010804.X）和高效发酵法生物制氢膨胀床设备（申请号：03260012.7 任南琪等）等，而对于发酵菌种特别是高效产氢菌种的筛选研究相对薄弱，仅有一种生物制氢方法及其专用菌（申请号：200910088408.8邢新会等），但该方法所用菌种是通过基因导入后的重组菌，操作较复杂，且发酵条件要求严格厌氧，不易推广。所以，对于新型专性厌氧新型菌种的筛选以及制氢工艺条件的探索优化十分必要。

 

发明内容

本发明主要包括一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法，该方法是在严格厌氧条件下，使用巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）JCM1408^T，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方式，24小时后即可开始产氢过程。

本发明所筛选的专性厌氧菌具体为梭菌属(Clostridium Winogradsky,1895)的巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）JCM1408^T，购自日本生物技术研究所微生物菌种保藏中心（Marine Biotechnology Institute Culture Collection, Marine Biotechnology Institution，MBIC)。

本发明的技术方案为：一种利用专性厌氧巴氏梭菌发酵制氢的方法，在无菌厌氧条件下，利用厌氧菌，以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、Na₂HPO₄ 、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水、刃天青指示和蒸馏水组成的混合物为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方式进行制氢，所述的专性厌氧菌为巴氏梭菌JCM1408^T。

培养基的组成为：蛋白胨10.0～15.0g、牛肉膏2.0～3.0 g、酵母提取物5.0～10.0g、Na₂HPO₄  3.0～4.0g、L-半胱氨酸0.2～0.5g、L-半胱氨酸盐酸盐一水0.2～0.5g、0.2％wt的刃天青指示剂1mL、马血清40~60ml和蒸馏水1L。

所述的发酵底物葡萄糖的浓度为5.0～20.0g/L

具体步骤为：无菌厌氧环境下，将培养基用磷酸盐缓冲液调pH为5.5～6.5，水浴加热瓶内培养基，同时从瓶口充氮气5分钟，待液相变为无色，最后封上瓶盖，115℃高温灭菌，烘干后将巴氏梭菌的菌株接种至装有培养基的瓶中，在37～40℃条件下静置培养至OD₆₀₀值为1.402后作为接种物，然后将接种物与培养基按体积比1：10~40的比例接种于发酵瓶中的培养基中得到发酵液；于37～40℃条件下进行恒温振荡培养，连续产氢。该条件下产氢效率高，对发酵环境条件要求低，具有广阔的应用前景。

有益效果：

首先，筛选出一种新型发酵制氢菌种，此菌种为专性厌氧菌，具有生长迅速，产氢效率高等优点；

其次，确定了发酵工艺条件，确定发酵底物为浓度是5.0～20.0g/L的葡萄糖，培养基配制为：蛋白胨10.0～15.0g，牛肉膏2.0～3.0 g，酵母提取物5.0～10.0g，Na₂HPO₄  3.0～4.0g，L-半胱氨酸0.2～0.5g，L-半胱氨酸盐酸盐一水0.2～0.5g，刃天青指示剂(0.2％)1mL，马血清40～60 mL /L，蒸馏水1L；培养基用磷酸盐缓冲液调pH为5.5～6.5，水浴加热瓶中液体并充氮气5分钟，试管内保持厌氧环境，发酵和接种都在厌氧箱内操作，采用分批发酵的方式；于37～40℃条件下静置培养24小时作为接种物，然后按接于发酵瓶中，37～40℃条件下进行恒温振荡培养，可以连续产氢。此外，巴氏梭菌在发酵罐内批量培养，产氢量明显高与小样培养，产氢比率达到1.7mol H₂ /mol 葡萄糖。

 

附图说明

图1为本发明的制氢装置示意图。

其中，1为氮气冲洗口和液体取样口，2为气体取样口，3为气体收集管，4为水准瓶。

图2为葡萄糖的质量浓度对气体总产量的影响。

图3为葡萄糖的质量浓度对细胞成长的影响。

图4为初始pH对氢气总产量的影响。

图5为初始pH对细胞成长的影响。

 

具体实施方式

菌种的扩大培养：

实施例1：确定菌种扩大培养的基础培养基

培养基组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏2.4 g/L，酵母提取物5.0g/L，Na₂HPO₄  4g/L，L-半胱氨酸0.2 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐一水0.5 g/L，马血清40～60 mL /L，蒸馏水1000mL。此外，另添加刃天青指示剂(0．2％)1mL/L。调节pH= 6.5，每100mL培养液装入250mL盐水瓶(带瓶塞，能密闭)，水浴加热瓶内液体，同时从瓶口吹入氮气，待液相变为无色(瓶内为无氧环境)，封上瓶盖。120℃高温灭菌25min，于60℃烘箱中烘干后，将菌株Clostridium pasteurianum接种至装有培养基的瓶中（无菌厌氧操作），于37℃下静置培养24～48h。

在培养过程中，用756 紫外可见分光光度计在600 nm处定时测定样品的吸光度值，48h细菌生长OD值为1.402。

实验结果表明：细菌总生长时间为45h，最终OD₆₀₀值为1.402，细菌繁殖迅速，厌氧条件控制的好，适合细菌生长。

菌种的发酵产氢：

实施例2：菌种发酵基底物浓度配置的选择确定

发酵用培养基的组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏2.4 g/L，酵母提取物5.0g/L，Na₂HPO₄  4g/L，L-半胱氨酸0.2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐一水0.5g/L，马血清40～60 mL /L，刃天青(0．2％)1mL/L, 葡萄糖5~20g/L；调节初始pH=5.5~6.5；配制培养基过程中，利用加热煮沸驱逐液相溶解氧和利用氮气吹脱瓶内气相空气的方式，保证严格厌氧于115℃高温灭菌25min；无菌厌氧操作下，将之前培养的Clostridium pasteurianum OD₆₀₀值为1.402的接种物高浓度菌液与培养基按表1中的接种量接种于200ml发酵瓶中的培养基中，在37℃的厌氧箱内静置培养，具体试验因素和水平见表1：

表1

pH值：5.05.56.06.5底物浓度(g/L)：5101520接种量（V/V）：1：401：201：10—水平编号：1234

将接种好的发酵液，总量为220mL，封闭后取出厌氧箱，于温度为37℃、170r/min的摇床振荡培养并连氢气接收集装置。在培养过程中，收集气体并实时记录气体产量。 

实验结果表明：巴氏梭菌产气总持续时间约24个小时，底物浓度对巴氏梭菌气体总产量和细胞生长的影响见图2，3。最大产气量480mL，氢气量302mL，氢气比率63%，适合于发酵过程中应用。葡萄糖浓度对巴氏梭菌气体总产量和细胞生长的非常显著，当葡萄糖质量浓度为20g/L时，气体总产量最少，仅为255mL/L，此时巴氏梭菌的细胞干重也只有0.38g。在葡萄糖质量浓度为10g/L时，气体总产量达到最大值480mL/L，细胞干重达到最大值0.73g/L，但是在低于或是高于该浓度时，气体总产量和细胞干重都呈现了下降趋势。

这是因为：当葡萄糖底物浓度低时，它不能够提供给巴氏梭菌充足的营养物质，从而使其生长受到了限制，而葡萄糖浓度较高时，巴氏梭菌对其不能完全充分地利用，残留的葡萄糖在反应瓶里堆积，使发酵液的pH降低，反而对巴氏梭菌产生了抑制作用，使其产氢和生长都受到了影响作用。

实施例3：最佳发酵pH确定

初始pH值对巴氏梭菌气体总产量和细胞生长的影响见表4，5。在葡萄糖浓度为10g/L的条件下，巴氏梭菌的气体总产量随着初始pH的变化呈现波动状态。当初始pH在5.0~6.0范围内，气体总产量和细胞干重都随初始pH的增加而增加，当初始pH为6.0时气体总产量达到最大值480mL/L，细胞干重达到最大值0.72g/L；当初始pH继续增加时，气体总产量和细胞干重都随着初始pH的增加而减小。这说明在葡萄糖质量浓度为10g/L的条件下，初始pH为6.0是巴氏梭菌最适产气的生长条件，低于或高于这个值都会对巴氏梭菌产生抑制作用。

 

实施例4：最佳接种比例的确定

接种比例对巴氏梭菌气体总产量和细胞生长的影响见表2：

表2

  接种量：1：401：201：10—产气量263485210—细菌干重0.3750.8360.348—

    在葡萄糖浓度为10g/L的条件下，初始pH为6.0，巴氏梭菌接种量为1：20的气体总产量达到最大值485mL/L，细胞干重达到最大值0.836g/L；当接种量增加或减小时，气体总产量和细胞干重都减小。这说明在其他条件相同的情况下，接种量对巴氏梭菌生长和营养物质争夺产生的抑制作用最小，最适合发酵产氢。

JCM1408^T巴氏梭菌为专性厌氧产氢菌:

实施例5：新型巴氏梭菌发酵产氢

发酵培养基组分为：蛋白胨10g/L，牛肉膏2.4 g/L，酵母提取物5.0g/L，Na₂HPO₄  4g/L，L-半胱氨酸0.2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐一水0.5g/L，刃天青(0．2％)1mL/L，马血清40~60ml, 葡萄糖10g/L；调节初始pH=6.0；在发酵罐中装入8L培养基，利用加热煮沸驱逐液相溶解氧和利用氮气吹脱瓶内气相空气的方式，保证严格厌氧于115℃高温灭菌25min； 

(1)方案一：将JCM1408^T巴氏梭菌高浓度菌液以1：20比例接种于8L发酵培养基（无菌厌氧操作），在37℃的恒温条件下搅拌培养，并连气体收集装置。

(2)方案二：将LMG3285^T巴氏梭菌 (购于比利时根特大学微生物遗传实验室) 以1：20比例接种于8L发酵培养基（无菌厌氧操作），在37℃的恒温条件下搅拌培养，并连气体收集装置。

在培养条件和产氢工艺相同的条件下，只是菌不同，收集方案一和方案二的气体总量。最终方案一氢气总产量为16.8L，方案二中氢气总产量为13.4L。因此结果证明同属的丁酸梭菌虽然都能发酵产氢，但是本所筛选的菌种JCM1408^T巴氏梭菌发酵制氢效率更高，产率可达到1.7mol H₂/ mol 葡萄糖。

综上所述，巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）JCM1391作为专性厌氧产氢菌种，可用于发酵底物为葡萄糖的发酵制氢过程中，通过试验发现，其发酵制氢的一般工艺条件是①细菌的厌氧操作技术是：利用加热煮沸驱逐液相溶解氧和利用氮气吹脱瓶内气相空气的方式，保证严格厌氧；②菌种接种时机为基础培养基与发酵底物共存时；③培养基配制为：蛋白胨10.0～15.0g，牛肉膏2.0～3.0 g，酵母提取物5.0～10.0g，Na₂HPO₄  3.0～4.0g，L-半胱氨酸0.2～0.5g，L-半胱氨酸盐酸盐一水0.2～0.5g，刃天青指示剂(0.2％)1mL，马血清40～60 mL /L，蒸馏水1L；④发酵底物葡萄糖的浓度为10.0g/L；⑤发酵温度为37～40℃；⑥发酵初始pH为6.0～6.5；⑦在震荡或搅拌条件下使发酵液产氢。