黄瓜枯萎病菌在提高哈茨木霉菌株L产木霉素水平中的应用

摘要

本发明公开了黄瓜枯萎病菌在提高哈茨木霉菌株L产木霉素水平中的应用，属于微生物技术领域。该方法将灭活的黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末加入到哈茨木霉菌株L的培养基中进行发酵培养，然后对发酵液进行离心，采用气相色谱分析发酵液中木霉素的含量，显示添加灭活的黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末后发酵液中木霉素的浓度与对照相比提高了数倍。通过本发明为提高哈茨木霉菌株L产木霉素的发酵水平提供了一种可行的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及提高哈茨木霉菌产木霉素水平的方法。

背景技术

微生物发酵中效价往往是决定生产成本以及实现工业化生产的瓶颈所在。对菌株进行遗传改造、培养基及培养条件的优化等是提高产素水平的常用方法。近年来，真菌诱导子在植物细胞培养和微生物发酵生产次生产物的研究中得到广泛应用。真菌诱导子主要是真菌的细胞表面结构或分泌物，它们可以是真菌的菌丝体、菌丝体降解产物、发酵液、真菌分泌物等，主要包括：多糖、脱乙酰几丁质、β-1-3-葡聚糖、乙酰葡萄糖醛酸、糖蛋白、蛋白质、短肽、不饱和脂肪酸等。关于真菌诱导子在微生物发酵生产活性次生代谢产物的应用报道很少。研究组从枸骨中分离筛选到一株产木霉素(Trichodermin)的活性内生真菌-哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)，定名为哈茨木霉菌株(Trichoderma harzianum)L。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登记号CGMCC No.1780。木霉素对多种农作物病原真菌具有很强的抑制作用，在防治作物病害中具有广泛的应用前景。从自然界分离的野生型菌株往往产素水平较低，生产能力低下。

国外有关哈茨木霉菌发酵生产木霉素的文献甚少，BERTAGNOLLI等报道的哈茨木霉菌株Th008产木霉素的单位为0.324μg/mL(BERTAGNOLLI B L，DALY S and SINCLAIR J B.Antimycotic Compounds from the Plant Pathogen Rhizoctonia solani and its Antagonist Trichoderma harzianum.J.Phytopathology，1998，146，131-135.)。研究组分离到的哈茨木霉菌株L现有的产木霉素单位约为80mg/L，为了更大的发挥哈茨木霉菌株L和木霉素在生物防治上的应用，提高木霉素产率是关键技术。在前期的研究基础上，发现添加微生物诱导子能够有效地提高木霉素产率，通过本发明为提高木霉素的发酵水平提供了一种可行的方法。

发明内容

在研究提高哈茨木霉菌株L产素水平的试验中，生物活性测定表明灭活的黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)菌丝体的加入能够提高哈茨木霉菌株L发酵液的抑菌效果。采用气相色谱分析发酵液中木霉素的含量，显示添加灭活的黄瓜枯萎病菌菌丝体后发酵液中木霉素的浓度与对照相比提高了数倍。

本发明通过在哈茨木霉菌株L培养液中添加灭活的黄瓜枯萎病菌菌丝体，提高发酵液中木霉素的浓度。该发明为哈茨木霉菌株L的产素水平提高提供了一种可靠的方法。

本发明的目的是针对野生型菌株哈茨木霉菌株L产素水平低的不足，提供一种提高其产素水平的方法；本发明的另一目的是提供利用该菌株代谢产物木霉素制备微生物农药的方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种提高哈茨木霉菌株L发酵液中木霉素含量的方法按以下步骤进行：

(1)黄瓜枯萎病菌的培养

黄瓜枯萎病菌，从浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所购买。培养基为马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基(配方为：称取200g去皮的马铃薯，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，加葡萄糖20g，溶化后补足水至1L)，300mL三角瓶装PD液体培养基60mL，用接种钩挑取少许黄瓜枯萎病菌菌丝于灭菌的培养瓶中，置26℃～28℃摇床，200r/min，振荡培养6天，发酵液经5000r/min离心10min，收集菌丝体，在-53℃、0.5mbar条件下真空冷冻干燥15h，灭活的菌丝体在无菌条件下用研钵研磨至粉末状，备用；

(2)哈茨木霉菌株L液体发酵

哈茨木霉菌株L为从枸骨中分离的内生真菌(石一珺，申屠旭萍，俞晓平.1株枸骨内生真菌菌株的分类鉴定及其代谢产物的生防作用研究.植物病理学报，2009，39(4)：362-367)。发酵培养基配方：其组分与含量(每升培养基中所含的质量)为黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末60mg，蛋白胨30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麸皮5g、MnCl₂ 0.01g、KH₂PO₄ 0.1g、MgSO₄ 0.05g；对照中不添加灭活的黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末，其余组分与含量同发酵培养基配方；300mL三角瓶装发酵培养基60mL，用无菌的吸管吸取1mL哈茨木霉菌株L孢子悬液(1×10⁶个/mL)于灭菌的培养瓶中，置28℃摇床，180r/min，振荡培养96h，发酵液经5000rmin离心10min，上清液用于木霉素含量的测定；

(3)木霉素的检测

方法：采用气相色谱法测定，色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱(以5％苯基甲基硅氧烷为固定液，30m×320μm×0.25μm)；检测器：氢火焰离子检测器(FID)；检测器温度270℃；进样口温度250℃；柱温度：程序升温，初始温度100℃，保持5min，以10℃·min^-1升温至260℃保持5min；载气：氮气；流速1.5mL·min^-1。

本发明的有益效果：

一是本发明通过在哈茨木霉菌株L培养液中添加灭活的黄瓜枯萎病菌菌丝体，提高发酵液中木霉素的浓度，这为哈茨木霉菌株L的产素水平提高提供了一种可靠的方法；

二是本发明提供了制备防治作物真菌病害的微生物源农药的活性成分木霉素，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提高木霉素产素水平的方法作进一步描述。

实施例1：

黄瓜枯萎病菌的培养：从浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所购买。培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)，300mL三角瓶装PD液体培养基60mL，用接种钩挑取少许黄瓜枯萎病菌菌丝于灭菌的培养瓶中，置26℃～28℃摇床，200r/min，振荡培养6天，发酵液经5000r/min离心10min，收集菌丝体，在-53℃、0.5mbar条件下真空冷冻干燥15h，灭活的菌丝体在无菌条件下用研钵研磨至粉末状，备用；

哈茨木霉菌株L液体发酵：哈茨木霉菌株L为从枸骨中分离的内生真菌，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登记号CGMCC No.1780。发酵培养基配方：其组分与含量(每升培养基中所含的质量)为黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末60mg，蛋白胨30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麸皮5g、MnCl₂ 0.01g、KH₂PO₄ 0.1g、MgSO₄ 0.05g；对照中不添加灭活的黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末，其余组分与含量同发酵培养基配方；300mL三角瓶装发酵培养基60mL，用无菌的吸管吸取1mL哈茨木霉菌株L孢子悬液(1×10⁶个/mL)于灭菌的培养瓶中，置28℃摇床，180r/min，振荡培养96h，发酵液经5000r/min离心10min，上清液用于木霉素含量的测定；

木霉素的检测：采用气相色谱法测定，色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱(以5％苯基甲基硅氧烷为固定液，30m×320μm×0.25μm)；检测器：氢火焰离子检测器(FID)；检测器温度270℃；进样口温度250℃；柱温度：程序升温，初始温度100℃，保持5min，以10℃·min^-1升温至260℃保持5min；载气：氮气；流速1.5mL·min^-1；

结果表明：添加黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末后，哈次木霉菌L发酵液中木霉素的含量与对照相比提高了4倍(从0.082g/L升高至0.328g/L)。

实施例2：

黄瓜枯萎病菌的培养：同实施例1；

哈茨木霉菌株L液体发酵：哈茨木霉菌株L为从枸骨中分离的内生真菌，发酵培养基配方：其组分与含量(每升培养基中所含的质量)为黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末90mg，蛋白胨30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麸皮5g、MnCl₂ 0.01g、KH₂PO₄ 0.1g、MgSO₄ 0.05g；对照中不添加灭活的黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末，其余组分与含量同发酵培养基配方；300mL三角瓶装发酵培养基60mL，用无菌的吸管吸取1mL哈茨木霉菌株L孢子悬液(1×10⁶个/mL)于灭菌的培养瓶中，置28℃摇床，180r/min，振荡培养96h，发酵液经5000r/min离心10min，上清液用于木霉素含量的测定；

木霉素的检测：同实施例1；

结果表明：添加黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末后，哈次木霉菌L发酵液中木霉素的含量与对照相比提高了4.2倍(从0.082g/L升高至0.344g/L)。

实施例3：

黄瓜枯萎病菌的培养：同实施例1；

哈茨木霉菌株L液体发酵：哈茨木霉菌株L为从枸骨中分离的内生真菌，发酵培养基配方：其组分与含量(每升培养基中所含的质量)为黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末90mg(在哈茨木霉菌液体发酵24小时后添加)，蛋白胨30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麸皮5g、MnCl₂ 0.01g、KH₂PO₄ 0.1g、MgSO₄ 0.05g；对照中不添加灭活的黄瓜枯萎病菌菌丝体粉末，其余组分与含量同发酵培养基配方；300mL三角瓶装发酵培养基60mL，用无菌的吸管吸取1mL哈茨木霉菌株L孢子悬液(1×10⁶个/mL)于灭菌的培养瓶中，置28℃摇床，180r/min，振荡培养108h，发酵液经5000r/min离心10min，上清液用于木霉素含量的测定；

木霉素的检测：同实施例1；

结果表明：添加黄瓜枯萎病菌菌丝体后，哈茨木霉菌株L发酵液中木霉素的含量与对照相比提高了4.25倍(从0.082g/L升高至0.349g/L)。

实施例4：

番茄灰霉病菌的培养：番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)从浙江省农业科院植物保护与微生物研究所购买。培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)，300mL三角瓶装PD液体培养基60mL，用接种钩挑取少许黄瓜枯萎病菌菌丝于灭菌的培养瓶中，置26℃～28℃摇床，200r/min，振荡培养6天，发酵液经5000r/min离心10min，收集菌丝体，在-53℃、0.5mbar条件下真空冷冻干燥15h，灭活的菌丝体在无菌条件下用研钵研磨至粉末状，备用；

哈茨木霉菌株L液体发酵：哈茨木霉菌株L为从枸骨中分离的内生真菌，发酵培养基配方：其组分与含量(每升培养基中所含的质量)为番茄灰霉病菌菌丝体粉末60mg，蛋白胨30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麸皮5g、MnCl₂ 0.01g、KH₂PO₄ 0.1g、MgSO₄ 0.05g；对照中不添加番茄灰霉病菌菌丝体粉末，其余组分与含量同发酵培养基配方；300mL三角瓶装发酵培养基60mL，用无菌的吸管吸取1mL哈茨木霉菌株L孢子悬液(1×10⁶个/mL)于灭菌的培养瓶中，置28℃摇床，180r/min，振荡培养96h，发酵液经5000r/min离心10min，上清液用于木霉素含量的测定；

木霉素的检测：采用气相色谱法测定，色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱(以5％苯基甲基硅氧烷为固定液，30m×320μm×0.25μm)；检测器：氢火焰离子检测器(FID)；检测器温度270℃；进样口温度250℃；柱温度：程序升温，初始温度100℃，保持5min，以10℃·min^-1升温至260℃保持5min；载气：氮气；流速1.5mL·min^-1；

结果表明：添加番茄灰霉病菌菌丝体粉末后，哈茨木霉菌株L发酵液中木霉素的含量(0.0825g/L升)与对照(0.0820g/L升)相比基本没有提高。