起因于HPV的癌细胞的检测方法、组织是否为重度不典型增生以上阶段组织的判断方法及其所用引物对和试剂盒

摘要

本发明提供一种能够精确、简便地检测起因于HPV的癌细胞、判断组织是否为重度不典型增生以上阶段组织的引物对、方法及其试剂盒。所用引物对包括第一引物和第二引物，其中第一引物与HPVL1区或L2区中有CpG部位的碱基序列中由在CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与LCR或E6区中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种起因于HPV的癌细胞的检测方法、组织是否为重度不典型增生以上阶段组织的判断方法及其所用引物对和试剂盒。

背景技术：

人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，以下称“HPV”)是一种以双链闭环DNA为基因组的病毒，容易诱发增生性病变。HPV分类为100多种亚型。已知HPV的亚型的共同区域有编码非结构性蛋白质的E1区、E2区、E4区、E5区、E6区和E7区、编码外壳蛋白质的L1区和L2区以及LCR。

HPV的DNA从宫颈癌和宫颈部不典型增生的病变部位以及口腔癌和咽喉癌的组织检出。因此，感染HPV被认为是宫颈癌、口腔癌和咽喉癌的风险因素之一。多数情况下感染HPV的方式都是从感染开始一定时间后HPV从细胞自然消失的一过性感染。然而，HPV感染中有5～10％的感染为HPV不消失、引起宫颈癌的持续性感染。

在宫颈组织诊断中，宫颈部位不典型增生作为癌细胞产生的前期阶段，根据上皮内出现异型细胞的程度分为轻度、中度及重度三个阶段的不典型增生。从重度不典型增生再进一步恶化，宫颈部位不典型增生病变为癌细胞出现在上皮内的阶段。宫颈部位不典型增生还进一步进展为癌细胞局限于上皮内的“上皮内癌”以及癌细胞从上皮扩展到皮下组织的“微小浸润扁平上皮癌”和“浸润扁平上皮癌”。

轻度不典型增生或中度不典型增生的病变基本上都不进行治疗，只观察进展。然而放纵重度不典型增生的前驱病变不治疗，病变很可能会进展为浸润癌，因此对于诊断为重度不典型增生的受检者大多实施手术等治疗。因此，判断受检者病变是否为重度不典型增生或比此更严重的阶段对于决定受检者的治疗方法是十分重要的。

高等真核生物的染色体DNA中，构成DNA的碱基中胞嘧啶的第5位会被甲基化。高等真核生物中的DNA甲基化作为抑制基因信息表达的机构发挥其作用。近年来，有报告显示在基因组DNA中有无HPV甲基化与癌症的发病有着非常密切的关系。

比如，专利文献1中记载，当患者宫颈部位的细胞中所含HPV的E6区和LCR未甲基化时，宫颈癌细胞的存在会得到更强的显示。然而，未甲基化的E6区和LCR有时会从宫颈癌细胞以外的细胞中检测出来。因此，很难仅通过确认E6区和LCR的甲基化状态就从患者宫颈部位的细胞中精确地检测出起因于HPV的癌细胞。

非专利文献1中记载，在宫颈癌中，HPV-18的L1区虽然甲基化程度很高，但LCR和E6区却未甲基化。在此，非专利文献1是先决定用与HPV-18基因组DNA相应的亚硫酸氢盐处理后的核酸的碱基序列，再确认其甲基化状态。然而，这种通过决定碱基序列来确认DNA甲基化的方法费时且操作烦琐。很难从采自受检者的试样中简便地检测出起因于HPV的癌细胞。

非专利文献1：Tolga Turan et al.，病毒学(Virology)349(2006)175-183

专利文献1：特表2006-522607号公报

发明内容：

本发明的目的之一是提供一种精确、简便地检测出起因于HPV的癌细胞的方法。本发明的另一目的是提供一种能够精确、简便地判断组织是否为重度不典型增生以上阶段的组织。本发明还提供一种能够精确、简便地检测出起因于HPV的癌细胞和判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段的引物对。

即，本发明涉及

(1)一种起因于HPV的癌细胞检测方法，包括以下步骤：

(A)从受检者细胞中制备含有DNA的试样；

(B)使上述步骤(A)获得的试样中所含DNA中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基，获取转换试样；

(C)用上述步骤(B)获得的转换试样、第一引物和第二引物以由第一引物杂交部位到第二引物杂交部位之间连续的碱基序列构成的核酸为扩增对象进行核酸扩增反应，其中第一引物与HPV的L1区或L2区中有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交；及

(D)根据上述步骤(C)的核酸扩增反应结果，检测出起因于HPV的癌细胞；

(2)上述(1)所述检测方法，其特征在于：

所述步骤(A)包括：(a)混合含有表面活性剂的溶液和受检者细胞，获得混合物、

(b)将上述步骤(a)获得的混合物进行离心分离，沉淀不溶物，获得上清、及

(c)分取上述步骤(b)获得的上清；

(3)上述(2)所述检测方法，其特征在于：

所述步骤(A)在步骤(a)和步骤(b)之间还有步骤(a1)，在步骤(a1)，对步骤(a)获得的混合物进行物理处理，使DNA从细胞中游离，

在所述步骤(b)将上述步骤(a1)获得的产物进行离心分离，沉淀不溶物，获得上清；

(4)一种判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段的判断方法，包括以下步骤：

(A)从受检者组织制备含有DNA的试样；

(B)将上述步骤(A)获得的试样所含DNA中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基，获取转换试样；

(C)用上述步骤(B)获得的转换试样、第一引物和第二引物，以由第一引物杂交部位到第二引物杂交部位之间的连续的碱基序列构成的核酸为扩增对象进行核酸扩增反应，其中第一引物与HPV的L1区或L2区中有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交；及

(D)根据上述步骤(C)的核酸扩增反应结果判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段；

(5)上述(4)所述判断方法，其特征在于：组织是宫颈部位的组织；

(6)一种引物对，这种引物对用于通过核酸扩增反应扩增在由非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的HPV基因组DNA碱基序列构成的核酸中由第一引物杂交部位到第二引物杂交部位之间的连续的碱基序列构成的核酸，该引物对包括：

第一引物，与HPV的L1区或L2区中有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，

第二引物，与HPV的LCR或E6区中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交；

(7)上述(6)所述引物对，其特征在于：第一引物是一种与HPV的L1区中有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交的引物；

(8)上述(6)所述引物对，其特征在于：第二引物是一种与HPV的LCR中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交的引物；

(9)上述(6)所述引物对，其特征在于：其他碱基指尿嘧啶或胸腺嘧啶；

(10)上述(6)所述引物对，其特征在于：第一引物和第二引物均用于通过聚合酶链式反应法(PCR)、链置换反应法、连接酶链式反应法(LCR)或转录扩增法扩增核酸；

(11)一种起因于HPV的癌症诊断用试剂盒，包括上述(6)所述引物对以及将核酸中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的非甲基化胞嘧啶诱变剂；

(12)上述(11)所述诊断用试剂盒，其特征在于：非甲基化胞嘧啶诱变剂是亚硫酸氢盐；

(13)上述(11)所述诊断用试剂盒，其特征在于：起因于HPV的癌症为宫颈癌、口腔癌或咽喉癌；

(14)一种不典型增生阶段诊断用试剂盒，其包括上述(6)所述引物对和将核酸中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的非甲基化胞嘧啶诱变剂。

附图说明：

图1为HPV基因结构的简要说明图。

图2为植入SiHa细胞的HPV16的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的模式图。

图3为电泳图，显示了用实施例1、比较例1和比较例2的各引物对和由正常组织试样及癌组织试样制备的各分析用试样进行核酸扩增后的扩增产物的结果。

图4为植入C4-1细胞的HPV18的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的模式图。

图5为显示用实施例1的引物对和从手术摘取试样及活检试样制备的各分析用试样进行核酸扩增后扩增产物的结果的电泳图。

图6为显示来源于手术摘取试样的HPV18的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的模式图。

图7为显示来源于手术摘取试样的HPV58的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的模式图。

图8为显示来源于活检试样的HPV58的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的模式图。

具体实施方式：

本发明的引物对包括第一引物和第二引物，第一引物与HPV的L1区或L2区中有CpG部位的碱基序列(也称“第一碱基序列”)中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列(也称“第二碱基序列”)构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区中有CpG部位的碱基序列(也称“第三碱基序列”)中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列(也称“第四碱基序列”)构成的核酸杂交，此引物对用于通过核酸扩增反应扩增由与HPV的基因组DNA相应的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸中由第一引物杂交部位到第二引物杂交部位之间连续的碱基序列构成的的核酸。上述第二碱基序列是通过转换第一碱基序列构成的核酸而形成的核酸的碱基序列，除存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基外，均与第一碱基序列对应。上述第四碱基序列是转换由第三碱基序列构成的核酸后形成的核酸的碱基序列，除全部胞嘧啶转换为其他碱基外，均与第三碱基序列相对应。

本发明的引物对具有一大特征就是含有第一引物和第二引物，其中第一引物与HPV的L1区或L2区有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交。

起因于HPV的癌细胞中所含HPV基因组DNA的L2区或L1区的CpG部位的胞嘧啶被甲基化，且LCR或E6区中的CpG部位胞嘧啶未甲基化。因此，将本发明的引物对用于核酸扩增反应，可以特异性地扩增由与造成癌变的HPV的基因组DNA相应的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸。以此，使用本发明的引物对可以精确、简便地检测出起因于HPV的癌细胞。因此，使用本发明的引物对也可以精确、简便地诊断宫颈癌、口腔癌及咽喉癌。

存在于重度不典型增生以上阶段的病变部位的HPV基因组DNA，其L2区或L1区的CpG部位的胞嘧啶甲基化，且LCR或E6区中的CpG部位胞嘧啶未甲基化。因此，将本发明的引物对用于核酸扩增反应，可以特异性地扩增由与存在于重度不典型增生以上阶段的病变部位的HPV基因组DNA相应的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸。因此，使用本发明的引物对可以精确、简便地诊断不典型增生的阶段。而且，使用本发明的引物对可以精确、简便地判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段。

另外，本说明书中所谓起因于HPV的癌细胞指因感染HPV而癌变的细胞和有很高癌变风险的细胞。更具体而言，所谓起因于HPV的癌细胞指引起宫颈癌、口腔癌或咽喉癌症状的感染HPV细胞、宫颈癌细胞、口腔癌细胞或咽喉癌细胞。

在本说明书中，所谓“重度不典型增生以上阶段”指日本妇产科学会根据“宫颈癌处置规则1997”的分类，分类为“重度不典型增生”或比此更严重的阶段-“上皮内癌”、“微小浸润扁平上皮癌”或“浸润扁平上皮癌”的阶段。一旦判断组织病变为这些阶段的病变，受检者几乎都需要手术等治疗，因此，判断病变是否处于重度不典型增生以上阶段在临床上非常重要。另一方面，比“重度不典型增生”轻的病变分类为“上皮无异常”、“轻度不典型增生”或“中度不典型增生”。病变在此阶段，受检者几乎都不必实施特别的治疗，仅观察其进展。

在本说明书中，所谓“异常细胞”指异型细胞和癌细胞。在此，所谓“异型细胞”指虽然不是癌细胞，但确认有核肿大、核染质增量、核形不规则等核异常的细胞。

如上所述，起因于HPV的癌细胞有L2区或L1区的CpG部位的胞嘧啶被甲基化、LCR或E6区中的CpG部位胞嘧啶未甲基化的HPV基因组DNA。用使非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的非甲基化胞嘧啶诱变剂对上述起因于HPV的癌细胞中所含HPV基因组DNA进行处理时，L2区或L1区的CpG部位的胞嘧啶不转换为其他碱基，而LCR或E6区中的CpG部位胞嘧啶转换为其他碱基。因此，使用本发明的引物对，可以让用非甲基化胞嘧啶诱变剂处理的HPV基因组DNA中、L2区或L1区的CpG部位仍为由胞嘧啶和鸟嘌呤构成的二核苷酸碱基序列，仅对LCR或E6区中的CpG部位胞嘧啶转换为其他碱基的核酸通过核酸扩增反应进行扩增。

在本发明的引物对中，第一引物与HPV的L1区或L2区有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交。第二引物与HPV的LCR或E6区有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交。因此，使用本发明的引物对可以通过一次核酸扩增反应扩增经与癌变原因-HPV基因组DNA中的DNA相应的经非甲基化胞嘧啶诱变剂处理过的核酸，其中所述DNA为至少包括L2区或L1区的一部分及LCR或E6区的一部分的连续区DNA。

HPV是约8kb的环状DNA病毒。HPV有HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82等。

HPV基因组如图1所示，有编码非结构蛋白质的早期基因的开放阅读框(E1区、E2区、E4区、E5区、E6区及E7区)、编码外壳蛋白质的晚期基因的开放阅读框(L1区和L2区)以及LCR的基因区。E1区是参与病毒基因组复制的区域。E2区是参与病毒转录调节的区域。E5区、E6区及E7区参与癌变。E6区与癌抑制基因p53结合、编码促进p53分解的蛋白质。E7区与癌抑制基因Rb结合、编码使Rb失活的蛋白质。L1区和L2区参与外壳形成。LCR(Long control region，长调控区)参与调节病毒基因表达。

一般来说，HPV感染、侵入细胞，则HPV的基因组DNA其中的CpG部位中一定CpG部位的胞嘧啶被生物体内的DNA甲基化机构甲基化。其中，在宫颈癌细胞中的HPV中，如图2所示，L1区和L2区中CpG部位的胞嘧啶被甲基化，LCR和E6区CpG部位的胞嘧啶未甲基化。

表1为感染HPV细胞中所含HPV基因组DNA的L1区和L2区以及LCR和E6区的CpG部位的甲基化状态。在此，表1所示感染HPV细胞中感染HPV细胞2为起因于HPV的癌细胞。表1中，“○”表示CpG部位的胞嘧啶甲基化，“×”表示CpG部位的胞嘧啶未甲基化。

[表1]

如上所述，宫颈癌细胞内的HPV中，L1区和L2区中的CpG部位检出DNA甲基化。但是，如表1所示，在感染HPV细胞中，非起因于HPV的癌细胞L1区或L2区的DNA有时也甲基化。因此，当检测起因于HPV的癌细胞时，如果仅以L1区或L2区的甲基化为指标，有时很难区分起因于HPV的癌细胞和其他感染HPV细胞。即，当检测起因于HPV的癌细胞时，如果仅以L1区或L2区的甲基化为指标，则可能不仅检出表1所示起因于HPV的癌细胞-感染HPV细胞2，还检出感染HPV细胞1。

在宫颈癌细胞内的HPV，LCR及E6区的CpG部位为非甲基化状态。但是，在感染HPV细胞中非起因于HPV的癌细胞有时也有LCR或E6区的CpG部位为非甲基化状态。因此，检测起因于HPV的癌细胞时，如果仅以LCR或E6区的非甲基化状态为指标，则有时很难区分起因于HPV的癌细胞和其他感染HPV细胞。即，检测起因于HPV的癌细胞时，如果仅以LCR或E6区的非甲基化状态为指标，则可能不仅检出表1所示起因于HPV的癌细胞-感染HPV细胞2，还检出感染HPV细胞4。

然而，本发明的引物对可以通过核酸扩增反应特异性地扩增与表1所示感染HPV细胞2中所含HPV基因组DNA相应的经非甲基化胞嘧啶诱变剂处理的核酸。因此，使用本发明的引物对有着可以从表1所示感染HPV细胞1～4中特异性地检出起因于HPV的癌细胞-感染HPV细胞2的卓越效果。

另一方面，即使在重度不典型增生以上阶段的组织内的HPV中，也是L1区和L2区中CpG部位的胞嘧啶甲基化，LCR和E6区CpG部位的胞嘧啶未甲基化。因此，使用本发明引物对，所表现出的卓越效果是可以特异性地检出重度不典型增生以上阶段的组织的HPV的DNA。

在本说明书中，所谓“引物杂交”指引物在严格的条件下与核酸杂交。引物与核酸杂交的状态是在适于进行核酸扩增反应的状态下与核酸中的互补序列退火的状态。在此，所谓严格的条件指进行多聚核苷酸杂交时该行业人员普遍使用的条件。上述严格的条件只要是本发明的引物对能与与HPV基因组DNA相应的经非甲基化胞嘧啶诱变剂处理的核酸中有靶碱基序列的核酸杂交即可，无特别限定。杂交时的严格性(stringency)已知是温度、盐浓度、引物链长、引物的核苷酸序列的GC含量以及杂交缓冲液中离液(chaotropic)剂浓度的函数。作为严格的条件比如可以使用Sambrook，J.等(1998)分子克隆：实验手册[Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.))，ColdSpringHarborLaboratory Press，New York]记载的条件等。

另外，“其他碱基”如有尿嘧啶、胸腺嘧啶。比如，当使用亚硫酸氢盐作为非甲基化胞嘧啶诱变剂时，非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶。在使用本发明的引物对进行核酸扩增反应时，此尿嘧啶转化为胸腺嘧啶。

第一引物和第二引物都是利用核酸扩增法扩增核酸的引物。具体而言，第一引物和第二引物最好是通过聚合酶链式反应法(PCR)、链置换反应法、连接酶链式反应法(LCR)或转录扩增法扩增核酸的引物。以此，如果以经非甲基化胞嘧啶诱变剂处理的、从受检者细胞中抽取的DNA为模型，用本发明的引物对进行核酸扩增反应，就可以简便地从扩增反应结果中确认有起因于HPV的癌细胞的受检者和重度不典型增生以上阶段的组织。

聚合酶链式反应法可以按惯用的方法实施。链置换反应法比如可以列举出LAMP法、ICAN(注册商标)法和SMAP法等。作为转录扩增法如有TAS法等。

本发明的引物对可以根据所用核酸扩增法的种类，按公认的方法制作。更具体地说，首先是L1区或L2区的碱基序列和LCR或E6区的碱基序列，预测经非甲基化胞嘧啶诱变剂处理后的碱基序列。然后，用市场销售的引物设计软件等从预测的碱基序列设计本发明引物对的各引物的碱基序列，通过合成各引物，即可制作本发明的引物对。用于聚合酶链式反应法-实时PCR的引物对的各引物的设计软件，如有GENETYX和primer3等。用于链替代反应法-LAMP法的引物对的各引物的设计软件，如有Primer Explorer等。

使用本发明的引物对，如前所述，可以检出起因于HPV的癌细胞，因此可以诊断起因于HPV的癌症。因此，本发明还包括诊断起因于HPV的癌症的试剂盒(以下也称“诊断用试剂盒1”)。

本发明的诊断用试剂盒1含有上述引物对和使核酸中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的非甲基化胞嘧啶诱变剂。

非甲基化胞嘧啶诱变剂只要能使核酸中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基即可，比如可以是亚硫酸氢盐等。上述亚硫酸氢盐有亚硫酸氢钠等。

在本发明的诊断用试剂盒1中，上述引物对溶解在适于保持核酸稳定的缓冲液等溶剂中，封入适于保持核酸稳定的容器中后再提供。非甲基化胞嘧啶诱变剂溶解在适于溶解此非甲基化胞嘧啶诱变剂的溶剂中，封入适当的容器内后再提供。

能够适用于本发明的诊断用试剂盒1的、起因于HPV的癌症如有宫颈癌、口腔癌、咽喉癌等。

使用上述本发明的引物对如上所述，可以检出起因于HPV的癌细胞。本发明还包括起因于HPV的癌细胞的检测方法。

本发明的癌细胞检测方法包括以下步骤：

(A)从受检者细胞中制备含有DNA的试样、

(B)将上述步骤(A)获得的试样中所含DNA中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基，获取转换试样、

(C)用上述步骤(B)获得的转换试样、第一引物和第二引物，以由第一引物杂交部位到第二引物杂交部位之间连续的碱基序列构成的核酸为扩增对象进行核酸扩增反应，其中第一引物与HPV的L1区或L2区有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转变为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转变为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交、及

(D)根据上述步骤(C)的核酸扩增反应结果，检测起因于HPV的癌细胞。

本发明的癌细胞检测方法可以通过上述起因于HPV的癌症的诊断用试剂盒简便地实施。

在本发明的癌细胞检测方法中，首先是从受检者细胞制备含有DNA的试样[步骤(A)]。

在上述步骤(A)中，从受检者细胞制备含有DNA试样可用公认的方法进行。上述含有DNA试样的制备比如可以按如下步骤进行：(a)混合含有表面活性剂的溶液和受检者细胞，获取混合物；

(b)将上述步骤(a)获得的混合物进行离心分离，沉淀不溶物，获得上清、及

(c)分取上述步骤(b)获得的上清。

在上述步骤(A)通过进行此步骤(a)～(c)从受检者细胞抽取DNA，即可制备含有DNA的试样。

上述步骤(A)在步骤(a)和步骤(b)之间还可以包含步骤(a1)，即对步骤(a)获得的混合物进行物理处理，使DNA从细胞中游离。此时，在上述步骤(b)将上述步骤(a1)获得的产物进行离心分离，沉淀不溶物，获得上清。

作为表面活性剂比如可列举出十二烷基硫酸钠(SDS)、十四烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十四烷基磺酸钠、胆酸钠(CHO)、脱氧胆酸钠(DOC)、牛磺胆酸钠和牛磺脱氧胆酸钠等，特别以十二烷基硫酸钠(SDS)为宜。进行物理处理的方法采用物理地粉碎细胞的公认的方法即可，比如用均化器粉碎细胞的方法和用搅拌机震荡粉碎细胞的方法等。制备含有DNA的试样也可以使用市场出售的提取DNA的试剂盒。

提取的DNA可以溶于水或缓冲液以DNA溶液的形式使用。溶解DNA的水和缓冲液最好能保持溶解的DNA的稳定性。这种溶解DNA的水和缓冲液可以是不含核酸的PCR级的水或TE溶液(10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mM EDTA)等。

受检者的细胞只要是HPV能感染的细胞或HPV能潜伏的细胞都可。对于受检者的细胞没有特别限制。比如可以是粘膜细胞、皮肤细胞等。粘膜如可以是泌尿生殖器器官、消化器官和呼吸器官等管腔脏器的内腔面粘膜。更具体地说，粘膜可以是宫颈部的粘膜、口腔咽喉部的粘膜等。在受检者的细胞中，最好是宫颈部的细胞、口腔咽喉部的细胞。本发明的检测方法可以通过使用宫颈部的细胞和口腔咽喉部的细胞作为受检者的细胞检测起因于引起宫颈癌、口腔癌和咽喉癌的HPV的癌细胞。宫颈部的细胞是可以从受检者宫颈部(比如宫颈部粘膜等)采集的细胞。口腔咽喉部的细胞是可以从受检者的口腔咽喉部(如口腔咽喉部粘膜等)采集的细胞。

接着，使上述步骤(A)获得的试样中所含DNA中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基[步骤(B)]。

非甲基化胞嘧啶向其他碱基的转换可以通过上述非甲基化胞嘧啶诱变剂进行。当使用亚硫酸氢盐作为非甲基化胞嘧啶诱变剂时，如上所述，甲基化胞嘧啶不变，非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶。上述亚硫酸氢盐如有亚硫酸氢钠等。当使用亚硫酸氢盐-亚硫酸氢钠作为非甲基化胞嘧啶诱变剂时，可以在含有DNA的试样中添加10M亚硫酸氢钠溶液，在适当温度条件下培养获得的混合物来进行非甲基化胞嘧啶向其他碱基的转换。

然后，用上述步骤(B)获得的转换试样、第一引物和第二引物以由第一引物杂交部位到第二引物杂交部位之间连续的碱基序列构成的核酸为扩增对象进行核酸扩增反应，其中第一引物与HPV的L1区或L2区有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转变为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转变为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交[步骤(C)]。因为本发明的检测方法在步骤(C)用上述转换试样、上述第一引物和第二引物进行核酸扩增反应，所以可以特异性地扩增与致癌的HPV的基因组DNA相对应的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的核酸。因此，使用本发明的检测方法可以精确地检测出起因于HPV的癌细胞。

核酸扩增反应可以通过上述聚合酶链式反应法、链置换反应法、连接酶链式反应法或转录扩增法进行。在这些方法中，最好是聚合酶链式反应法。

在使用上述引物对进行的核酸扩增反应中，当含经上述非甲基化胞嘧啶诱变剂处理过后的DNA的试样中有L2区或L1区CpG部位的胞嘧啶甲基化、且LCR或E6区CpG部位的胞嘧啶未甲基化的HPV的基因组DNA时，可以获得扩增产物。即当含受检者细胞DNA的试样中有表1的感染HPV细胞2所示HPV的基因组DNA存在时，可以获得扩增产物。另一方面，如果含受检者细胞的DNA试样中没有表1所示感染HPV细胞1、3、4所示HPV的基因组DNA存在，则得不到扩增产物。

其后，根据步骤(C)的核酸扩增反应结果，检测出起因于HPV的癌细胞[步骤(D)]。如果核酸扩增反应有扩增产物，则判断受检者有起因于HPV的癌细胞。即，上述扩增产物的存在可以成为受检者有持续感染的HPV的指标。而如果核酸扩增反应没有扩增产物，则判断受检者没有起因于HPV的癌细胞。此时，不存在上述扩增产物可以作为受检者未感染HPV或即使感染HPV也是一过性感染的指标。如此，本发明的检测方法可以通过确认扩增产物的存在简便地检测出起因于HPV的癌细胞。

另外，核酸扩增反应是否有扩增产物可以通过公认的方法确认。作为此类方法如有琼脂糖凝胶电泳法、使标记探针与扩增产物杂交进行检测的方法、用能与双链DNA结合的嵌入剂(如SYBRGreen等)检测荧光的方法以及检测核酸扩增中产生的副产物的浑浊的方法等。

使用本发明的引物对可以判断从受检者获得的组织是否处于重度不典型增生以上阶段，也可以诊断不典型增生的阶段。因此，本发明还包括诊断不典型增生阶段用试剂盒(以下也称“诊断用试剂盒2”)。

本发明的诊断用试剂盒2包含上述引物对和上述非甲基化胞嘧啶诱变剂。在本发明的诊断用试剂盒2中，上述引物对和上述非甲基化胞嘧啶诱变剂以与上述诊断用试剂盒1同样的形态提供。

适用于本发明的诊断用试剂盒2的受检者组织，只要含有HPV可感染的细胞或HPV可潜伏的细胞即可。比如从宫颈部和口腔咽喉部采集的组织，最好其能适用于采自宫颈部的组织的不典型增生的诊断。

使用本发明的引物对如前所述还可以判断受检者的组织是否处于重度不典型增生以上阶段。本发明还包括判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段的判断方法。

本发明的判断方法包括以下步骤：

(A)从受检者组织制备含有DNA的试样；

(B)将上述步骤(A)获得的试样所含DNA中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基，获取转换试样。

(C)用上述步骤(B)获得的转换试样、第一引物和第二引物，以由第一引物杂交部位到第二引物杂交部位之间连续的碱基序列构成的核酸为扩增对象进行核酸扩增反应，其中第一引物与HPV的L1区或L2区有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转变为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转变为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交；及

(D)根据上述步骤(C)的核酸扩增反应结果判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段。

本发明的判断方法首先是从受检者组织制备含DNA的试样的[步骤(A)]。

本判断方法的步骤(A)中，从受检者组织制备含有DNA的试样可以用公认的方法等进行。通过与上述检测起因于HPV的癌细胞的检测方法中从受检者细胞制备含DNA试样的步骤(A)相同的操作也能够从受检者的组织制备含有DNA的试样。

受检者的组织只要含有HPV可感染的细胞或HPV可潜伏的细胞即可。具体而言，受检者的组织可以是从受检者宫颈部和口腔咽喉部采集的组织。

本发明的判断方法中步骤(B)和步骤(C)可以以与上述起因于HPV的癌细胞的检测方法中的步骤(B)和步骤(C)相同的操作进行。在本发明的判断方法中，因为在步骤(C)用上述步骤(B)获得的转换试样和上述第一、第二引物进行核酸扩增反应，所以可以特异性地扩增与处于重度不典型增生以上阶段的病变部位的HPV的基因组DNA相对应的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的核酸。因此，使用本发明的检测方法可以精确地判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段。

然后，本发明的判断方法根据在核酸扩增步骤的核酸扩增反应结果判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段[步骤(D)]。如果核酸扩增反应有扩增产物，则判断受检者的组织处于重度不典型增生以上阶段。反之，如果核酸扩增反应没有扩增产物，则判断受检者的组织非重度不典型增生以上阶段的组织。如此，本发明的判断方法可以通过确认有无扩增产物，以有无扩增产物为指标判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段。

下面，根据实施例详细说明本发明，但本发明绝不限定于此实施例。

实施例

(实施例1)

在来源于HPV16基因组被植入到染色体中的宫颈癌的细胞株SiHa细胞的基因组DNA1μg中加入300μL的0.3M氢氧化钠溶液，37℃下培养10分钟。再加入10M亚硫酸氢盐溶液(10M亚硫酸氢钠水溶液)300μL，80℃培养40分钟，以此对上述基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。用DNA提纯试剂盒[QIAGEN公司，商品名：Qiaquick PCR purification kit]提纯亚硫酸氢盐处理后的溶液中所含DNA。在提纯的DNA中添加氢氧化钠，使其最终浓度达到0.3M，室温培养5分钟。再用核酸提纯用离心柱(通用电气医疗集团制，商品名：MicroSpin S-300 HR Columns)提纯所得产物，获得分析用试样。

在分析用试样2μL中添加PCR用试剂[宝生物(takara-bio)株式会社制，商品名：TaKaRa EX Taq(注册商标)Hot Start Version]所含试剂(×10缓冲液)2.5μL、DNA聚合酶[商品名：TaKaRa EX Taq HS(5U/μL)]0.125μL和2.5mM dNTP混合物2μL、上游引物水溶液(10μM)1μL、下游引物水溶液(10μM)1μL和水16.38μL，制备PCR用反应液。

所用上游引物和下游引物构成的引物对及PCR热循环模式(Thermal Profile)见表2。

[表2]

表2中，PCR热循环模式(1)为95℃4.5分钟保温后，以95℃30秒、60℃30秒和72℃40秒为一周期，进行40周期的反应的条件。表2中，PCR热循环模式(2)为95℃4.5分钟保温后，以95℃30秒、53℃15秒和72℃30秒为一周期，进行40周期的反应的条件。

使用上述PCR用反应液在与引物对的种类相应的PCR条件下进行PCR。

将PCR后的扩增产物装入TA克隆试剂盒(英杰生命技术有限公司(invitrogen)制，商品名：TA cloning kit)中的载体。用获得的构建物形质转换大肠杆菌(TOP10)。将形质转换的大肠杆菌用LB寒天培养基[组分：1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(w/v)酵母取提物、1％(w/v)氯化钠、1.5％(w/v)寒天]37℃培养一晚。取获得的大肠杆菌集落植入LB液体培养基，37℃培养一晚。用质粒抽提试剂盒(西格玛奥德里奇(sigma-Aldrich)公司制，商品名：GenElute Plasmid Miniprep Kit)从所得大肠杆菌提纯质粒。通过BigDye terminator Cycle Sequencing测序法用基因分析系统[应用生物系统(Applied Biosystems)公司制，商品名：ABI Prism 3100]确定导入所得质粒中的上述扩增产物的碱基序列。

当CpG部位的胞嘧啶甲基化时(甲基化CpG部位)，上述CpG部位在所决定的碱基序列中以“CG”出现。而CpG部位的胞嘧啶未甲基化时(非甲基化CpG部位)，上述CpG部位在决定的碱基序列中以“TG”出现。因此，根据已确定的扩增产物的碱基序列，分析HPV16的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的局部存在。其结果如图2所示。图2为植入SiHa细胞的HPV16的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的模式图。图中黑圆点表示甲基化CpG部位，白圆点表示非甲基化CpG部位。图中，CpG部位栏的数值表示GenBank NC_001526(序列号：9)中的基因组位置。

从图2所示结果得知，植入SiHa细胞的基因组DNA的HPV16(植入型HPV16)的碱基序列中，L1区的CpG部位和L2区的CpG部位胞嘧啶分别被甲基化。与此相对，LCR的CpG部位和E6区的CpG部位各自胞嘧啶几乎未甲基化。因此，从图2所示结果得知：根据有无HPV16的基因组DNA的L1区的CpG部位和L2区的CpG部位胞嘧啶被甲基化、LCR的CpG部位和E6区的CpG部位胞嘧啶未甲基化，可以检测出是否有引起宫颈癌的植入型HPV16。

(试验例1)

将确认感染HPV16的宫颈部组织中在病理学上未发生不典型增生的正常组织和癌组织分别切成厚度20μm的薄片，获得正常组织试样和癌组织试样。在所得各组织试样中添加含有1％(w/v)SDS和0.1M氢氧化钠的溶液500μL。取所得混合物100℃保温20分钟。取保温后的混合物4℃下离心分离，回收上清。

在所得上清中添加上述亚硫酸氢盐溶液500μL。将所得混合物80℃培养40分钟，进行亚硫酸氢盐处理。经亚硫酸氢盐处理后的溶液中所含核酸用核酸提纯试剂盒[QIAGEN公司，商品名：QIAquick PCR Purification kit]提纯。在所得核酸中添加氢氧化钠至最终浓度0.3M。然后，所得混合物室温下培养5分钟。用核酸提纯用离心柱(通用电气医疗集团制，商品名：MicroSpin S-300 HR Columns)纯化所得产物，获得分析用试样。

取分析用试样4μL，添加PCR用试剂(罗氏(Roche)公司制，商品名：Fast Start Taq DNA polymerase)所含试剂(商品名：×10缓冲液)2μL、DNA聚合酶[商品名：Fast Start Taq DNA polymerase(5U/μL)]0.16μL和2.5mM dNTP混合物1.6μL、上游引物水溶液(10μM)0.8μL、下游引物水溶液(10μM)0.8μL和水10.64μL，制备PCR用反应液。

所用由上游引物和下游引物构成的引物对及PCR热循环模式(Thermal Profile)见表3。

[表3]

表3中，实施例1的引物对由上游引物16L1/LCR-F和下游引物16L1/LCR-R构成。上述16L1/LCR-F在HPV16基因组DNA相应的经亚硫酸氢盐处理的核酸中，与一定含有甲基化CpG部位的L1区相应部分杂交。上述16L1/LCR-R在HPV16基因组DNA相应的经亚硫酸氢盐处理的核酸中，与一定含有未甲基化CpG部位的LCR相应部分杂交。当分析用试样中含有用亚硫酸氢盐处理HPV16的基因组DNA而获得的核酸时，用实施例1的引物对进行PCR就会产生扩增产物，其中HPV16的基因组DNA的L1区CpG部位的胞嘧啶甲基化，且LCR的CpG部位的胞嘧啶未甲基化。

表3中，比较例1的引物对由上游引物16L1Me1-F和下游引物16L1Me1-R构成。上述16L1Me1-F和16L1Me1-R分别在与HPV16基因组DNA相应的经亚硫酸氢盐处理的核酸中，与含有CpG部位的L1区的甲基化的一定相应部分杂交。即，当分析用试样中含有用亚硫酸氢盐处理HPV16基因组DNA所得的核酸时，用比较例1的引物对进行PCR，就会产生扩增产物，其中所述HPV16基因组DNA的L1区CpG部位胞嘧啶甲基化。

表3中，比较例2的引物对由上游引物16LCRUnMe1-F和下游引物16LCRUnMe1-R构成。上述16LCRUnMe1-F和16LCRUnMe1-R分别在与HPV16基因组DNA相应的经亚硫酸氢盐处理的核酸中，与含有非甲基化CpG部位的LCR相应的一定部分杂交。即，当分析用试样中含有用亚硫酸氢盐处理HPV16基因组DNA所得的核酸时，用比较例2的引物对进行PCR，就会产生扩增产物，其中，所述HPV16基因组DNA的LCR的CpG部位胞嘧啶未甲基化。

表3中，PCR热循环模式(3)为95℃4.5分钟保温后，以95℃30秒、60℃15秒和72℃30秒为一周期，进行45周期的反应的条件。PCR热循环模式(4)为95℃4.5分钟保温后，以95℃30秒、63℃15秒和72℃30秒为一周期，进行45周期的反应的条件。PCR热循环模式(5)为95℃4.5分钟保温后，以95℃30秒、56℃15秒和72℃30秒为一周期，进行45周期的反应的条件。

用上述PCR用反应液在与引物对种类相应的PCR条件下进行PCR，确认有无扩增产物。其结果如图3所示。图3为电泳图，显示了用实施例1、比较例1和比较例2的各引物对和由正常组织试样及癌组织试样制备的各分析用试样进行核酸扩增后扩增产物的结果。图3的图板(a)～(c)的条带1表示从正常组织试样获得核酸时的扩增产物，条带2表示从癌组织试样获得核酸时的扩增产物。图3的图板(a)显示的是使用比较例1引物对时的结果，图板(b)显示的是使用实施例1引物对时的结果，图板(c)显示的是使用比较例2引物对时的结果。图板(d)～(f)将与要扩增的核酸相对应的HPV16基因组DNA中基因区的甲基化和非甲基化状态模式化并进行了显示。在图板(d)～(f)中，黑圆点和白圆点分别模式性地表示存在甲基化胞嘧啶和存在非甲基化胞嘧啶。

正如从图3的图板(a)所示结果所看出的，使用比较例1的引物对时，在条带1和条带2均检出扩增产物。即，在比较例1的引物对中，从正常组织和宫颈癌组织制备的分析试样中都能获得扩增产物。由此结果可以知道，仅检测甲基化的L1区(CpG部位的胞嘧啶甲基化的L1区)是不能识别正常组织和宫颈癌组织的。

正如从图3的图板(c)所示结果所看出，使用比较例2的引物对时，在条带1和条带2均检出扩增产物。即，用比较例2的引物对从正常组织和宫颈癌组织制备的分析试样中都能获得扩增产物。由此结果可以知道，仅检测未甲基化的LCR(CpG部位的胞嘧啶未甲基化的LCR)是不能识别正常组织和宫颈癌组织的。

与此相反，正如从图3的图板(b)所示结果所看出，使用实施例1的引物对时，在条带1未检出扩增产物，在条带2检出扩增产物。即得知，用实施例1的引物对，从正常组织制备的分析用试样得不到扩增产物，从宫颈癌组织制备的分析用试样可以获得扩增产物。用实施例1的引物对，如图3的图板(e)所示，扩增目标是从在与甲基化L1区相应的核酸中引物杂交部位到在未甲基化LCR相应的核酸中引物杂交部位之间的连续区域的相应核酸。因此，使用实施例1的引物对，仅扩增上述表1所示感染HPV细胞2所含HPV16基因组DNA中含有一定L1区和LCR的连续核酸相应的经亚硫酸氢盐处理后的核酸。其结果，使用实施例1的引物对可以区分正常组织试样和宫颈癌组织试样。

从以上结果可以看出，使用由第一引物和第二引物组成的引物对可以检测出起因于HPV的癌细胞，其中第一引物与在HPV的L1区的有CpG部位的碱基序列中由CpG部位以外的胞嘧啶转化为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR的有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转化为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交。

(实验例2)

以与实验例1同样的操作，用来源于HPV18基因组被植入到染色体中的宫颈癌细胞株C4-1细胞，对HPV18基因组中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位进行了分析。具体而言，用C4-1细胞的基因组DNA取代SiHa细胞的基因组DNA，用表4所示引物对和PCR热循环模式(6)取代表2所示引物对和PCR热循环模式进行了PCR反应，除此之外，均以与实验例1相同的操作确定了扩增产物的碱基序列。

[表4]

表4中，PCR热循环模式(6)为95℃4.5分钟保温后，以95℃30秒、54℃30秒和72℃40秒为一周期，进行40周期的反应的条件。

根据确定的扩增产物的碱基序列，分析了HPV18基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的局部存在。其结果如图4所示。图4为植入C4-1细胞中的HPV18的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的模式图。图中，黑圆点表示甲基化CpG部位，白圆点表示非甲基化CpG部位。图中CpG部位栏的数值表示GenBank NC_001357(序列号：16)中的基因组位置。

从图4所示结果得知，植入C4-1细胞基因组DNA中的HPV18(植入型HPV18)也和植入SiHa细胞基因组DNA中的HPV16(植入型HPV16)同样，L1区CpG部位胞嘧啶甲基化，LCR的CpG部位和E6区CpG部位的胞嘧啶均未甲基化。此结果表明，使用本发明的引物对不管HPV种类如何，都能检测储引起宫颈癌的植入型HPV。

(试验例3)

从受检者体内手术摘取的、确认感染HPV16的14种宫颈部组织的组织石蜡块(paraffin block)(以下称“手术摘取试样”)以及在阴道镜观察下从受检者宫颈部刮取的、确认感染HPV16的7种宫颈部组织的组织石蜡块(以下称“活检试样”)分别切成10μm厚的薄片，获得组织试样。

上述手术摘取试样和活检试样都包含传统的组织诊断诊断为不典型增生以上阶段的组织。在14种手术摘取试样中，轻度不典型增生(CIN1)的试样1种，中度不典型增生(CIN2)的试样4种，重度不典型增生(CIN3)的试样4种，癌(SCC)的试样4种，正常试样1种。在活检试样中，轻度不典型增生(CIN1)的试样2种，重度不典型增生(CIN3)的试样2种，癌(SCC)的试样3种。

在1.5mL管中加入从同一石蜡块获得的组织试样3片和二甲苯1mL。所得混合物以12000rpm离心分离10分钟。离心分离后，除上清，在微球(pellet)中添加100体积％乙醇1mL悬浊，所得悬浊物以12000rpm离心分离10分钟。离心分离后，除上清，再在微球中添加100体积％乙醇悬浊，所得悬浊物再以12000rpm离心分离10分钟。离心分离后，除上清，干燥微球。以下将所得微球称为“干燥微球”。

向从手术摘取试样获得的干燥微球中添加含有1％(w/v)SDS和0.1M氢氧化钠的溶液700μL。在从活检试样获得的干燥微球中添加含有1％(w/v)SDS和0.1M氢氧化钠的溶液500μL。取所得各混合物100℃保温20分钟。取保温后的混合物4℃下以12000rpm离心分离10分钟，回收上清。

向从手术摘取试样获得的上清中添加上述亚硫酸氢盐溶液700μL，混匀。在从活检试样获得的上清中添加上述亚硫酸氢盐溶液500μL，混匀。然后取所得各混合物80℃培养40分钟，进行亚硫酸氢盐处理。经亚硫酸氢盐处理后的溶液中所含核酸用核酸提纯试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：QIAquick PCR Purification kit)提纯。在所得核酸中添加氢氧化钠使最终浓度为0.3M。然后，所得混合物室温下培养5分钟。用核酸提纯用离心柱(通用电气医疗集团制，商品名：MicroSpin S-300 HR Columns)提纯所得产物，获得分析用试样。

除用来源于手术摘取试样的分析用试样外，均以与试验例1相同的操作配制PCR用反应液。除用来源于活检试样的分析用试样、分析用试样量为2μL外，均以与试验例1相同的操作配制PCR用反应液。PCR用反应液的引物对使用的是以序列号：10表示的碱基序列构成的引物和以序列号：11表示的碱基序列构成的引物所组成的、实施例1的引物对。

使用含有来源于手术摘取试样的分析用试样的PCR用反应液时的PCR条件与表3中的PCR热循环模式(3)的条件相同。使用含有来源于活检试样的分析用试样的PCR用反应液时的PCR条件为95℃4.5分钟保温后，以95℃30秒、60℃15秒和72℃30秒为一周期，进行40周期的反应的条件。

使用上述PCR用反应液在与引物对种类相应的PCR条件下进行PCR，确认有无扩增产物。其结果如图5所示。图5为显示用实施例1的引物对和从手术摘取试样及活检试样制备的各分析用试样进行核酸扩增后扩增产物的结果的电泳图。图5中，条带1表示使用CIN3的手术摘取试样的结果，条带2表示使用CIN2的手术摘取试样的结果，条带3表示使用CIN1的手术摘取试样的结果，条带4表示使用CIN3的手术摘取试样的结果，条带5表示使用CIN3的手术摘取试样的结果，条带6表示使用SCC的手术摘取试样的结果，条带7表示使用SCC的手术摘取试样的结果，条带8表示使用SCC的手术摘取试样的结果，条带9表示使用SCC的手术摘取试样的结果，条带10表示使用CIN2的手术摘取试样的结果，条带11表示使用CIN2的手术摘取试样的结果，条带12表示使用CIN2的手术摘取试样的结果，条带13表示使用CIN3的手术摘取试样的结果，条带14表示使用正常手术摘取试样的结果，条带15表示使用CIN1的活检试样的结果，条带16表示使用CIN1的活检试样的结果，条带17表示使用CIN3的活检试样的结果，条带18表示使用CIN3的活检试样的结果，条带19表示使用SCC的活检试样的结果，条带20表示使用SCC的活检试样的结果，条带21表示使用SCC的活检试样的结果。图5中，PC表示用SiHa细胞的基因组DNA经过亚硫酸氢盐处理的核酸作为分析用试样时的结果，NC表示使用蒸馏水作为分析用试样时的结果。另外，根据不典型增生阶段对图5的结果进行分析的结果见表5。表5中，“L1-LCR阳性”表示检出扩增产物的试样。表5还在括号内列出了L1-LCR阳性的试样数相对于试样总数的比例(％)。

[表5]

从图5和表5所示结果得知，使用实施例1的引物对，当所用分析试样来源于组织诊断判断为重度不典型增生(CIN3)以上阶段的组织时，获得扩增产物的比例很高，但当所用分析试样来源于组织诊断判断为中度不典型增生(CIN2)以下阶段的组织时，获得扩增产物的比例较低。由此结果得知，使用实施例1的引物对，可以判断作为手术摘取试样和活检试样等临床样本获得的组织是否为重度不典型增生以上阶段的组织。

(试验例4)

使用手术从受检者身体摘取、手术从确认感染HPV18的癌组织的石蜡块和受检者身体摘取的、确认感染HPV58且诊断为CIN3阶段组织的宫颈部组织的石蜡块(手术摘取试样)以及在阴道镜观察下从受检者宫颈部刮取、确认感染HPV58且诊断为CIN3阶段组织的、来源于患者的宫颈部组织石蜡块(活检试样)，以与试验例2相同的操作，分别获得各个分析用试样。

在分析用试样2μL中添加PCR用试剂[宝生物(takara-bio)株式会社制，商品名：TaKaRa EX Taq(注册商标)Hot Start Version]所含试剂(×10缓冲液)1.5μL、DNA聚合酶[商品名：TaKaRa EX Taq HS(5U/μL)]0.75μL和2.5mM dNTP混合物1.2μL、上游引物水溶液(10μM)0.6μL、下游引物水溶液(10μM)0.6μL和水9.025μL，制备PCR用反应液。

用于来源于含HPV18试样的分析试样的上游引物和下游引物构成的引物对见表6。用于来源于含HPV58试样的分析试样的上游引物和下游引物构成的引物对见表7。

[表6]

[表7]

作为PCR条件，分别使用实验例2中使用的PCR热循环模式(6)和来源于手术摘取试样的分析试样及来源于活检试样的分析试样，以与实验例1同样的操作，分析了在HPV18和HPV58各基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位。这些结果如图6～8所示。

图6为显示来源于手术摘取试样的HPV18的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的模式图。图7为显示来源于手术摘取试样的HPV58的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的模式图。图8为显示来源于活检试样的HPV58的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG部位的模式图。图中，黑圆点表示甲基化CpG部位，白圆点表示非甲基化CpG部位。另外，在图6中，CpG部位栏的数值表示GenBank NC_001357(序列号：16)中的基因组位置。此外，图7及图8中CpG部位栏的数值表示GenBank NC_001443(序列号：37)中的基因组位置。

从图6的结果得知，在来源于确认感染HPV18的癌组织的HPV18中，L1区CpG部位的胞嘧啶被高频度地甲基化，而LCR的CpG部位的胞嘧啶几乎未甲基化，而且E6区CpG部位的胞嘧啶未甲基化。从图7的结果得知，在来源于确认感染HPV58且诊断为CIN3的宫颈部组织的HPV58中，L1区和L2区CpG部位的胞嘧啶被高频度地甲基化，而LCR的CpG部位的胞嘧啶未甲基化。从图8的结果得知，在来源于在阴道镜观察下从患者身体获得的、确认感染HPV58且诊断为CIN3的宫颈部组织的HPV58中，L1区CpG部位的胞嘧啶被高频度地甲基化，而LCR的CpG部位的胞嘧啶几乎未甲基化。

此结果说明，如果使用一种由第一引物和第二引物构成的引物对，不论HPV为何种类，都能检测出引起宫颈癌的HPV，其中所述第一引物与在HPV的L1区或L2区有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，所述第二引物与在HPV的LCR或E6区有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交。还说明用上述引物对可以判断作为手术摘取试样或活检试样等临床样本获得的组织是否处于重度不典型增生以上阶段。

(制备例1)

制备起因于HPV的癌诊断用或不典型增生阶段诊断用试剂盒。以下举其中一例。此试剂盒由以下二种容器组成：盛有以下引物对各引物的水溶液的无核酸酶(Nuclease free)的容器和盛有非甲基化胞嘧啶诱变剂-亚硫酸氢盐溶液(10M亚硫酸氢钠水溶液)的无核酸酶的容器。

起因于HPV的癌诊断用或不典型增生阶段诊断用试剂盒的内容物：

容器1

上游引物水溶液(将序列号：10所示碱基序列构成的引物16L1/LCR-F溶解到无核酸酶水中获得的水溶液)

容器2

下游引物水溶液(将由序列号：10所示碱基序列构成的引物16L1/LCR-F溶解到无核酸酶水中获得的水溶液)

容器3

10M亚硫酸氢钠水溶液

用此试剂盒通过与上述试验例1同样的操作即可精确、简便地诊断起因于HPV的癌症。用此试剂盒通过与上述试验例3同样的操作即可精确、简便地诊断不典型增生阶段。

序列表

序列号：1为引物的序列。

序列号：2为引物的序列。

序列号：3为引物的序列。

序列号：4为引物的序列。

序列号：5为引物的序列。

序列号：6为引物的序列。

序列号：7为引物的序列。

序列号：8为引物的序列。

序列号：10为引物的序列。

序列号：11为引物的序列。

序列号：12为引物的序列。

序列号：13为引物的序列。

序列号：14为引物的序列。

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序列号：18为引物的序列。

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