胃肠肿瘤诊断和预示的新分子标记

摘要

本发明公开了一种用于预示和诊断胃肠肿瘤的检测方法及其试剂盒和基因芯片，该方法包括以下步骤：(1)获取待测样品；(2)检测选自下列编码mRNA基因在样品中是否过表达，所述基因为具有SEQ ID No：39的CST1基因；或特异性识别CST1基因的mRNA、CST1剪切子(SEQ ID No：43，SEQ ID No：44)、CST1基因的cDNA、CST1剪切子的cDNA的其中一种的引物或/和探针所识别的基因；或通过至少一种CST1引物对应的扩增子所鉴定的基因。该方法可应用于胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断方面，该方法具有验证的样本量多，结果准确可靠、灵敏度高等优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，更具体的，本发明涉及一种胃肠癌症标志物及其用途，胃肠道癌症诊断、动态检测以及预后判断的试剂或试剂盒及其使用方法。

背景技术

近年来恶性肿瘤的发病率持续上升，其中60％以上为消化系统肿瘤，以胃癌、大肠癌最为常见。在全球范围内，胃癌发病率在男性恶性肿瘤中仅次于肺癌占第二位，在女性恶性肿瘤中居第四位。而在我国死亡率居恶性肿瘤首位，年平均死亡率为每10万人口中有25.53人。大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是近几十年来发病数和死亡数在世界大多数国家和地区上升最快的肿瘤之一。近年的流行病学资料显示，大肠癌已上升为全球第三位最常见的癌症，2000年全世界有70万人患大肠癌，其中50万人因此而死亡。

早期发现胃肠道肿瘤，早期治疗，是提高胃肠道恶性肿瘤疗效的关键。肿瘤分期越高，则表明发现越晚。据国外资料报道I、II、III、IV期直肠癌患者5年生存率则分别为93％、84％、44％和8％。但是胃肠道恶性肿瘤的临床症状常常不典型，往往被我们自认为是我们常说的胃炎、胃溃疡、消化不良、便秘等，从而延误诊断和治疗。

目前中国临床诊断多为症状性筛选，即出现腹部不适、隐痛、泛酸、嗳气或消瘦、黑便等症状后进行内镜等检查，最终检出的癌绝大部分为进展期癌。现有的诊断方法如血清学免疫检测通常使用的标志物如CEA、CA系列抗原，普遍存在灵敏度低、特异性差，尤其对早期癌检出率、有效性都很低。常用的细胞学检测虽然低廉简便，灵敏度同样偏低，而影像学检测仅对有较大占位的恶变肿瘤有很高的诊断率。中国是发展中的人口大国，经济条件欠发达，开展以影像为主的全民性普查筛选困难重重。另外，多数胃肠道癌症患者临床确诊时已属中晚期，如何进行手术后病人预后的监测和有效治疗方法的选择，是改善预后的有效方法。

发展具有高灵敏度、特异性强的胃肠道诊断产品，是提高胃肠癌症早期检出率、改善患者预后的关键之一。在肿瘤发生发展过程中，作为组织蛋白酶的天然抑制蛋白Cystatin基因家族与肿瘤的发生发展关系密切。在组织和体液中，Cystatin家族蛋白可逆性地结合半胱氨酸蛋白酶，防止组织蛋白酶的活性过度。Cystatin C是组织蛋白酶B最强的抑制蛋白，但是在卵巢癌和头颈部癌症中，cystatin C的表达有不同水平的上升。而在非小细胞肺癌中，stefin A(cystatin家族成员)的表达水平有所增加；在脑膜瘤中，stefinB在mRNA水平上有明显降低；cystatin F(亦称为leukocystatin或CMAP)在多种肿瘤中的表达水平都有显著增加。研究结果显示，cystatin的几个家族成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升，很可能是由于在肿瘤发生发展过程中需要组织蛋白酶的参与，先诱导其表达量增加，再激活机体本身的应激机制，导致cystatin的表达量上升以抑制过盛的蛋白酶活性。但cystatin的表达量并不与肿瘤的发展成正相关的关系，因为在胶质瘤中，cystatin C的低表达意味着疾病的晚期，病人的生存期较短，且易于复发，该结论在mRNA和蛋白水平上都得到了验证。

本发明证实cystatin家族成员CST1及其剪切子的表达水平与胃肠道肿瘤关系密切。CST1，又名cystatin SN，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)家族成员，含141个氨基酸，2个二硫键，16.4Kda，分布于多种体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。

发明内容

本发明目的在于提供一种预示和提供诊断胃肠肿瘤信息的检测方法，解决了现有技术中胃肠肿瘤难以早期检测的难题。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种提供胃肠肿瘤易感性信息的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)获取待测样品；

(2)测定选自下列编码mRNA或cDNA的基因在样品中的表达水平是否过表达，所述基因为具有SEQ ID No：39的CST1基因；或特异性识别CST1基因的mRNA、CST1剪切子、CST1基因的cDNA、CST1剪切子的cDNA的其中一种的引物或/和探针所识别的基因；或通过至少一种CST1剪切子引物对应的扩增子所鉴定的基因。其中CST1mRNA有2中剪切拼接方式，第一种(splice1)(SEQ ID No：43)，包含CST1外显子1((SEQ ID No：40)、外显子2(SEQ ID No：41)、外显子3(SEQ ID No：42)；而第二种剪切方式(splice2)(SEQ ID No：44)仅包含CST1外显子1((SEQ ID No：40)和外显子2(SEQ ID No：41)；当基因表达水平超过预定阈值时则预示胃肠肿瘤易感或形成。

优选的，所述引物为具有SEQ ID No：1～2或SEQ ID No：4～21至少之一序列的引物；所述探针为具有SEQ ID No：3序列的探针。

优选的，所述CST1第一个剪切子引物对应的扩增子具有SEQ ID No：45的序列。

优选的，所述方法中特异性引物是具有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列形成的引物对以及具有SEQ ID No：3所示序列的探针。

优选的，所述方法步骤(2)中检测表达水平的方法采用基于核酸序列扩增法的体外RNA扩增技术或多聚酶链式反应法。

优选的，所述方法步骤(2)中检测表达水平的方法采用实时定量PCR法，所述实时定量PCR法选自基于非特异性双核苷酸染料的实时PCR或基于特殊荧光探针的实时PCR。

本发明的另一目的在于提供一种检测胃肠功能的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于捕获SEQ ID No：39的CST1基因和/或CST1基因剪切子(SEQ ID No：43，44)的引物或探针以及使CST1和/或其剪切子及其捕获引物或探针混合物可视化的反应试剂。

优选的，所述反应试剂通过选自琼脂糖凝胶电泳、酶联凝胶法、电化学发光技术、原位杂交技术、荧光检测法使CST1和/或其剪切子及其捕获引物或探针混合物可视。

优选的，所述试剂盒还包括作为阳性参照品的胃癌细胞株、作为阴性参照品的正常的胃细胞株、核酸提取试剂、逆转录试剂、聚合酶链反应试剂。

本发明首次发现该基因异常表达和胃肠癌具有密切的相关性，并根据该相关性提供了基于特异性分子Marker的，用于诊断胃肠疾病、监控胃肠疾病、监控胃肠疾病治疗效果以及监控和评价胃肠癌是否转移复发的测定法、试剂盒及其使用方法，从而为胃肠癌症提供有效的分子诊断标记或评价胃肠癌症是否转移的分子标记或判断胃肠癌症患者预后的分子标记，这些可以用于胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断。

根据本发明的第一个方面，提供一种CST1基因的用途，用于制备胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断的试剂或试剂盒。

检测方法包括检测CST1 mRNA和/或CST1剪切子过表达或检测CST1 cDNA和/或CST1剪切子cDNA过表达。

优选的，检测方法包括使用至少一对能特异性结合CST1mRNA和/或CST1剪切子的引物和/或一条至少与部分CST1mRNA和/或CST1剪切子互补的寡聚核苷酸。

优选的，检测方法包括使用至少一对能特异性结合CST1 cDNA和/或CST1剪切子cDNA的引物和/或一条至少与部分CST1 cDNA和/或CST1剪切子cDNA互补的寡聚核苷酸。

优选的，检测方法包括基于核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplificatin，NASBA)的体外RNA扩增技术、转录介导的扩增(Transcription-median amplification，TMA)、连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)、适温链置换反应(thermophilicstrand displacement amplification，tSDA)、多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、最佳的是实时定量PCR(quantitative real-time PCR)。

优选的，实时定量PCR包括基于非特异性双核苷酸染料如SYBR Green的实时PCR、基于特殊荧光探针的实时PCR。

优选的，检测方法进一步包括使CST1和/或其剪切子及其捕获试剂混合物可视化的反应试剂。

本发明提供了一种检测受试者样品胃肠功能的方法，该方法包括检测所述样品中CST1 mRNA和/或CST1剪切子的水平。

优选的，所述检测进一步包括诊断所述受试者的胃、肠疾病，监控所述受试者的胃、肠疾病，判断所述受试者的胃、肠疾病的预后，监控给予所述受试者的胃、肠疾病治疗的效果，分期所述受试者的癌症。

优选的，所述受试者包括胃、肠不适就医者，慢性胃炎、肠炎患者，有家族性胃、肠道癌症者，且所述的检测进一步包括对受试者进行筛查以检测胃、肠道癌症。优选的，所述受试者为胃、肠道癌症患者，且所述的检测进一步包括监控所述受试者的胃、肠癌症，判断所述受试者的预后，监控给予所述受试者的治疗效果。

优选的，所述检测方法进一步包括定量所述样品中CST1 mRNA和/或CST1剪切子的水平。

优选的，检测方法包括使用至少一对能特异性结合CST1mRNA和/或CST1剪切子的引物和/或一条至少与部分CST1mRNA和/或CST1剪切子互补的寡聚核苷酸。

优选的，检测方法包括定量检测CST1 cDNA和/或CST1剪切子cDNA过表达的水平。

优选的，检测方法包括使用至少一对能特异性结合CST1 cDNA和/或CST1剪切子cDNA的引物和/或一条至少与部分CST1 cDNA和/或CST1剪切子cDNA互补的寡聚核苷酸。

所述方法中所述待测样品包括手术组织、镜检组织、淋巴结组织、骨髓、血清样品、血浆样品、尿样、血样、全血样品、血液级分样品。优选的检测方法，包括基于核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplificatin，NASBA)的体外RNA扩增技术、转录介导的扩增(Transcription-median amplification，TMA)、连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)、适温链置换反应(thermophilic strand displacement amplification，tSDA)、多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、最佳的是实时定量PCR(quantitativereal-time PCR)。

实时定量PCR，包括基于非特异性双核苷酸染料如SYBR Green的实时PCR、基于特殊荧光探针的实时PCR。也可以进一步包括使CST1和/或其剪切子及其捕获试剂混合物可视化的反应试剂。

一种用于胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断的试剂或材料，所述的试剂选自下组：CST1基因或转录本的特异性引物；和/或CST1基因或转录本的特异性识别探针或表面固定有所述探针的芯片。

在另一优选例中，所述的试剂是引物，所述的引物是针对CST1外显子的引物。更优选的优选例中，所述的引物是针对CST1基因第一个剪切子(SEQ ID No：43)的特异性引物；或所述的引物是针对CST1第二个剪切(SEQ ID No：44)子的特异性引物；或所述的引物是针对CST1基因的外显子1(Exon1)(SEQ ID No：40)和外显子2(Exon2)(SEQ ID No：41)的特异性引物(即扩增产物跨越外显子1和外显子2)；或所述的引物是针对CST1基因的外显子1(Exon1)和外显子3(Exon3)(SEQ ID No：42)的特异性引物(即扩增产物跨越外显子1和外显子3)；或所述的引物是针对CST1基因的外显子2(Exon2)和外显子3(Exon3)的特异性引物(即扩增产物跨越外显子2和外显子3)。

优选的引物是针对CST1基因第一个剪切子的外显子1的特异性引物。在另一优选例中，所述的特异性引物是具有SEQ ID No：1和SEQID No：2所示的序列的引物对以及SEQ ID No：3的探针。

一种用于预示或检测胃肠肿瘤的基因芯片，其特征在于所述基因芯片包括用于捕获对应于SEQ ID No：39的CST1基因或对应于SEQ ID No：43的CST1基因第一个剪切子的引物或探针。

根据本发明的第一个方面，提供了检测受试者样品的方法，包括检测样品中CST1第一个剪切子mRNA的水平。根据本发明所述的第一个方面优选实施方案中的特征，检测包括诊断受试者的胃肠疾病，监控受试者的胃肠疾病，监控受试者胃肠疾病治疗效果，受试者癌症分期或样品中CST1第一个剪切子mRNA的水平。

根据本发明更进一步的特征，受试者为胃肠部不适就医者，且检测包括对受试者进行筛查以检测胃肠癌症。根据本发明更进一步的特征，受试者为慢性胃炎、肠炎患者，且检测包括对受试者进行筛查以检测胃肠癌症。根据本发明更进一步的特征，受试者有家族性胃肠癌症，且检测包括对受试者进行筛查以检测胃肠癌症。根据如下所述的优选方案，样品包括胃肠手术、胃肠镜、淋巴结、骨髓、血清、血浆、血样、尿样。根据优选实施方案的特征，血样可包括全血样品或血液级分样品。

本发明的另外方面提供了胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断的试剂盒，所述的试剂盒中含有：针对CST1基因的至少一对引物和一条探针。根据如下所述的优选方案，试剂盒中的引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2，探针为SEQ ID No：3。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：胃癌细胞株和正常的胃细胞株分别作为阳性和阴性参照品，其中优选方案为胃癌细胞株(NCI-N87)，人胃上皮细胞株(GES-1)；CST1重组质粒作为标准品。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：肠癌细胞株和不表达CST1的肠癌细胞株分别作为阳性和阴性参照品，其中优选方案为肠癌细胞株(SW480)，肠癌细胞株(HCT116)；CST1重组质粒作为标准品。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：核酸提取试剂、逆转录试剂、聚合酶链反应(PCR)试剂、描述胃癌诊断、动态监测以及预后判断方法的说明书。

根据本发明所述的优选方案的更进一步的特征，检测试剂盒可用于实际场所，包括但不限于医院、诊所以及私人住宅。

根据本发明的另一面，提供用于根据受试者样品评价受试者是否为胃肠癌症，或胃肠癌症是否转移复发的测定法，包括针对CST1基因的至少一对引物和一条探针，取自样品中的总RNA，逆转录试剂、聚合酶链反应(PCR)试剂，由此能评估是否为胃肠癌症、治疗效果如何以及是否转移复发。

优选的检测试剂盒由以下几个部分组成：CST1和/或其剪切子的捕获物；一种使CST1和/或其剪切子及其捕获试剂混合物可视化的方法；反应试剂以及使用说明书。其中所述CST1和/或其剪切子的捕获物包括至少一对能特异性结合CST1mRNA和/或CST1剪切子的引物和/或一条至少与部分CST1mRNA和/或CST1剪切子互补的寡聚核苷酸。其中所述CST1和/或其剪切子的捕获物也可以包括至少一对能特异性结合CST1 cDNA和/或CST1剪切子cDNA的引物和/或一条至少与部分CST1 cDNA和/或CST1剪切子cDNA互补的寡聚核苷酸。

所述使CST1和/或其剪切子及其捕获试剂混合物可视化的方法，包括琼脂糖凝胶电泳、酶联凝胶法(enzyme-linked gel assay，ELGA)、电化学发光技术(electroluminescence，ECL)、原位杂交技术(in situ hybridization，ISH)、荧光检测法。可以按照如下步骤进行检测：从受试者处获得样品；检测样品中CST1mRNA和/或其剪切子水平；检测结果与对照样本中CST1水平比较，从而判断受试者胃肠状况。所述的样品包括手术组织、镜检组织、淋巴结组织、骨髓、血清样品、血浆样品、尿样、血样、全血样品、血液级分样品。对照样品，包括正常人样品、患者治疗的不同阶段的样品。受试者胃肠状况可以分为正常、炎、癌，改善、未改善，治疗措施有效、无效。

本发明的检测试剂盒可以用实际场所如医院、诊所、私人住宅。

本发明人经过深入的研究，首次发现CST1第一个剪切子表达水平的改变与胃肠癌症或胃肠癌症组织转移密切相关。具体的，CST1基因表达的上调与胃肠癌症或胃肠癌症组织转移密切相关。因此可以通过检测CST1基因表达(特别是CST1 mRNA表达)来诊断胃肠癌症或胃肠癌症组织转移。

CST1基因是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，其含有两个个剪切子，三个外显子。本发明人通过对大量的胃癌、肠癌或胃癌、肠癌组织转移患者的组织进行研究，并与胃炎、肠炎患者的组织或正常对照等进行比较，从而有力的证实了CST1基因与胃癌、肠癌或胃癌、肠癌组织转移的相关性。在本发明的实施例中，首先，本发明人比较了人体不同组织中CST1 mRNA的表达，发现除唾液腺外，人体正常组织中CST1均低度表达，因此对于CST1用于病理条件下检测极为有利。然后，本发明人比较已经报道的CST1，2，4；CST1；CST2；CST4在胃癌、肠癌和对应癌旁中的表达量差异，发现CST1在胃癌和癌旁以及肠癌和癌旁中的表达量差异最大，其次是CST4，均优于报道的CST1，2，4。然后，本发明人分别比较了胃癌与癌旁手术组织中CST1两种剪切方式(splice1、splice2)表达差异，发现第一种剪切方式(splice1)(SEQ ID No：43)在癌与癌旁组织中的表达差异程度优于第二中剪切方式(splice2)(SEQ ID No：44)；接着，本发明人分别比较了胃癌与癌旁手术组织、胃癌与炎/正常人胃镜组织、胃癌转移阳性淋巴结与阴性淋巴结、胃癌与炎/正常人血浆cell-free RNA CST1第一个剪切子mRNA表达差异，发现胃癌中CST1第一个剪切子mRNA的表达中位数比癌旁组织高57.5倍，胃镜样本高24倍，转移样本高11.469倍，血浆Cell-freeRNA高37.18倍。本发明人还分别比较了肠癌与癌旁手术组织、肠癌与炎/正常人肠镜组织、肠癌转移阳性淋巴结与阴性淋巴结、肠癌与炎/正常人血浆cell-free RNA CST1第一个剪切子mRNA表达差异，发现肠癌中CST1第一个剪切子mRNA的表达中位数比癌旁组织高48.95倍，肠镜样本高约23倍，转移样本高11.469倍，血浆Cell-free RNA高约20倍。因此，以CST1第一个剪切子作为诊断的标志物，灵敏度高(可高于95％)且特异性良好(可达100％)。

因此，基于本发明人的新发现，可利用CST1基因：(1)进行胃癌或胃癌组织转移的鉴别诊断、和/或易感性分析；(2)评估相关人群的胃癌或胃癌组织转移治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(3)早期评估相关人群胃癌或胃癌组织转移患病风险，早期检测早期预防；(4)进行肠癌或肠癌组织转移的鉴别诊断、和/或易感性分析；(5)评估相关人群的肠癌或肠癌组织转移治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(6)早期评估相关人群肠癌或肠癌组织转移患病风险，早期检测早期预防。

本发明还提供了用于检测胃肠癌症或胃肠癌症组织转移的试剂。所述试剂可以是：CST1基因或转录本的特异性(与人类其它基因没有序列重复或互补)引物；或CST1基因或转录本的特异性(不识别人类其它基因)探针；或表面固定有所述探针的芯片。

作为本发明的优选方案，所述的试剂是引物和探针，所述的引物是针对CST1基因外显子的引物和探针，更佳的是针对CST1第一个剪切子外显子一的引物和探针；或针对CST1第一个剪切子外显子二、三的引物和探针。

作为本发明的更优选的方式，所述的引物和探针是针对CST1第一个剪切子外显子一的引物和探针，该引物和探针能仅识别CST1第一个剪切子，与CST1第二个剪切子及人类其它基因均不会互补结合。所述的特异性引物是具有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2，探针为SEQ ID No：3。所述的引物和探针特异性好，扩增效果良好。

本发明还提供一种检测胃肠癌症或胃肠癌症组织转移的试剂盒，所述的试剂盒比已有的胃肠癌症检测试剂盒具有更好的特异性和选择性。所述的试剂盒中含有：用于检测胃肠癌症或胃肠癌症组织转移的试剂。所述的试剂可以是：CST1基因或转录本的特异性引物；或CST1基因或转录本的特异性探针；或同时包括引物和探针。通常，所述的试剂存在于适当的容器中。可使用稀释剂如去离子水将每种所述的引物和探针调整到至少一种需要量的浓度，分装于容器中。

为了便于进行分析和比对，作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还含有：胃肠癌细胞株和不表达CST1的细胞株分别作为阳性和阴性参照品和制备标准曲线所用的标准品。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。

此外，所述的试剂盒中还可包括描述胃肠癌症诊断、动态检测以及预后判断的说明书和/或芯片图像分析软件等。

本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对不同的检测方法)的多种不同试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于CST1基因或转录本的检测来进行胃肠癌症诊断、动态检测以及预后判断的产品均包含在本发明范围内。

所述的试剂也可以是CST1基因或转录本的特异性识别探针或表面固定有所述的芯片。探针或芯片的制备方法是本领域的常规技术，制备方法例如可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolicand genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997；278：680。

所述的针对CST1基因或转录本的特异性识别探针，包括但不限于TaqMan水解探针、MGB探针、杂交探针、分子信标等。

检测受试者组织样品中CST1基因或转录本的表达的方法优选的是Real-time PCR方法。

本发明优选方案是Real-time PCR方法检测诊断受试者的胃肠疾病，监控受试者的胃肠疾病，监控受试者胃肠疾病治疗效果，受试者癌症分期或样品中CST1mRNA水平。

本发明试剂盒所针对的受试者可以为胃肠不适就医者，且检测包括对受试者进行筛查以检测胃肠癌症。

本发明试剂盒所针对的受试者可以为慢性胃炎、肠炎患者，且检测包括对受试者进行筛查以检测胃肠癌症。

本发明试剂盒所针对的受试者可以为有家族性胃肠癌症者，且检测包括对受试者进行筛查以检测胃肠癌症。

一种检测方法是：获得组织样品，从所述组织样品分离RNA；使用CST1特异性引物和探针从RNA样品中扩增cDNA拷贝，量化扩增的cDNA拷贝，使用量化的扩增cDNA拷贝来评估胃肠疾病进展或治疗效果。

检测CST1 mRNA表达的方法还有很多种，，包括但不限于基于核酸序列扩增法((Nucleic Acid based Amplificatin，NASBA)的体外RNA扩增技术。当然，RNA体外扩增技术不限于NASBA，其它已知的RNA扩增方法和即刻的方法和试剂盒也是可用的。非限制性的例子有多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，扩增产物通过Beacon方法用荧光探针在均匀相中被检测，或产物可通过荧光或测热法(fluorescent orcalorimetric method)在固相中被检测。根据当前发明检测和/或定量靶基因RNA，多种荧光、侧热或酶法可以被应用。最佳的是，基于特殊荧光探针的实时PCR技术，其中荧光探针可以是标记了荧光的特异互补于CST1的序列，也可以是非特异性的双核苷酸染料，包括但不限于SYBR Green，Eve Green，LC Green等。

组织样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。所述的组织样品可以是(但不限于)：外周血、血清、血浆、唾液、胃液、肠道分泌物、骨髓、淋巴结、腹腔清洗液、尿样等。

根据本发明所述的检测试剂盒可用于实际场所，包括但不限于医院诊所以及私人住宅。此外，还可应用多变量统计学分析，将待测样品的数据与对照数据比较，有利于作出关于胃肠癌症诊断、进展或治疗效果的判断。

本发明的主要优点在于：

1、首次发现并证实CST1基因与胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断具有密切相关性，并且证实CST1第一个剪切子在胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断方面更具有优越性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断提供了新的途径。

2、开发了适合于胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断的试剂或试剂盒，检测灵敏度良好。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为CST1与Pmd18-T重组质粒图谱；

图2为CST1在人体正常组织中的表达情况(芯片)，所述组织包括扁桃体、垂体后叶、甲状腺、唾液腺、骨骼肌、骨髓、除去红细胞和血小板的外周血、肺、胃、肝脏、心脏、肾、肾上腺、肠、结肠、胰脏脾脏、膀胱、前列腺、卵巢、子宫、胎盘、睾丸以及肠癌细胞株SW480，Caco2，LOVO，HCT16，胃癌细胞株NCI-N87，人胃上皮细胞株GES-1；

图3为染料法实时定量PCR给出的CST1，2，4；CST1；CST2；CST4在20对胃癌和癌旁组织中的表达量差异；

图4a为染料法实时定量PCR给出的20对胃癌、癌旁组织中ACTB CP值；

图4b为染料法实时定量PCR反映的是CST1第一种剪切方式(splice1)、第二种剪切方式(splice2)在20对胃癌、癌旁组织中癌旁的CP值与对应癌组织的CP之差的中位数比较；

图5为Real-time PCR绝对定量法给出的CST1的第一个剪切子在100例胃癌和癌旁组织中的表达量分布；

图6为Real-time PCR绝对定量法给出的CST1的第一个剪切子在36例胃癌以及29例胃炎胃镜表中的表达量分布；

图7为Real-time PCR绝对定量法给出的CST1的第一个剪切子在20枚胃癌病理阳性淋巴结，15枚病理阴性淋巴结中表达量分布；

图8为通过Real-time PCR绝对定量法检测外周血游离胃癌细胞的准确度与细胞学检测的对比；

图9为通过Real-time PCR绝对定量法检测胃癌骨髓转移的准确度与细胞学检测的对比；

图10a为通过Real-time PCR绝对定量法，胃癌病人(50例)血浆Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎(30例)/正常人(30例)的差异；

图10b为通过Real-time PCR绝对定量法获得的ROC曲线，区分胃癌/炎/正常的敏感性和特异性；

图11为通过连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)方法，胃癌病人(50例)血浆Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎(30例)/正常人(30例)的差异；

图12为通过适温链置换反应(thermophilic strand displacement amplification，tSDA)方法，胃癌病人(50例)血浆Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎(30例)/正常人(30例)的差异；

图13为通过核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplificatin，NASBA)，20例胃癌，10例胃炎，10例正常人尿样中CST1第一个剪切子量的表达差异。

图14为通过转录介导的扩增(Transcription-mediated amplification，TMA)，检测50例胃癌(pTNM分期，I+II 30例，III+IV50例)不同分期CST1第一个剪切子表达量的差异。

图15为Real-time PCR绝对定量法给出的CST1的第一个剪切子在100例肠癌和癌旁组织中的表达量分布。

图16为Real-time PCR绝对定量法给出的CST1的第一个剪切子在36例肠癌以及29例肠炎肠镜组织表中的表达量分布。

图17为Real-time PCR绝对定量法给出的CST1的第一个剪切子在20枚肠癌病理阳性淋巴结，15枚病理阴性淋巴结中表达量分布。

图18a为通过Real-time PCR绝对定量法，肠癌病人(50例)血浆Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎(30例)/正常人(30例)的差异。

图18b显示了通过Real-time PCR绝对定量法得到的ROC曲线，区分胃癌/炎/正常的敏感性和特异性。

图19为通过核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplificatin，NASBA)，30例肠癌，20例肠炎，20例正常人尿样中CST1第一个剪切子量的表达差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料和方法：

实施例中所用标本均与病人签署知情同意书后按医院规定途径获取。

内镜下获取的病理部位标本和非病理部位样本作为对比，也可是非镜检方式如手术或胃肠壁擦拭法获取的细胞、手术中获取的淋巴结等样本应立即提取RNA或置于液氮或RNAlater(Ambion公司产品)中保存。

外周血、骨髓或尿液样本首先通过离心机4000rpm，4℃，离心20分钟，取上清，13000rpm，4℃，离心10分钟，分离上清和沉淀，立即提取RNA或置于-20℃至-80℃保存。

TaqMan水解探针的Real-time PCR法：上述样本用商业化的核酸抽提方法进行，一个常用的非限制性例子是酚/氯仿抽提方法，如用Invitrogen公司生产的Trizol方法抽提总RNA，并进行RNA质量鉴定，相关方法可参照《分子生物学实验》等参考书描述。mRNA的逆转录过程采用商业化逆转录试剂盒并按操作说明书进行，所得cDNA按比例稀释成需要的工作浓度。所用特异性引物经优化设计，CST1的第一个剪切子的上下游引物设计在外显子1上。制备包含CST1第一个剪切子扩增子的重组质粒，所需的质粒为商业化的Pegm-T(promega)(图1)，上下游引物设计在外显子1，2上。采用基于TaqMan水解探针的Real-time PCR法进行CST1第一个剪切子扩增。

针对CST1第一个剪切子的引物和探针，最优的如下：

上游引物：TCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQ ID No：1)

下游引物：TTATCCTATCCTCCTCCTTGG(SEQ ID No：2)

探针：5′-FAM-CTCCAGCTTTGTGCTCTGCCTCT-TAMRA-3′(SEQ ID No：3)扩增长度为141bp。

针对制备包含CST1第一个剪切子扩增子的重组质粒的引物，最优的如下：

上游引物：GGGCTCCCTGCCTCGGGCTCTCAC(SEQ ID No：22)

下游引物：ACGGTCTGTTGCCTGGCTCTTAGT(SEQ ID No：23)

实验组，阳性对照组，阴性对照组与重组质粒标准品一起扩增。依据重组质粒浓度梯度和扩增后对应的CP(cross point)作标准曲线。依据该标准曲线给出实验组、阳性对照组和阴性对照组的拷贝数。

染料法实时定量PCR：样本处理同TaqMan水解探针的Real-time PCR法，CST1，2，4引物，上游：AGTCCCAGCCCAACTTGGA(SEQ ID No：24)下游：GGGAACTTCGTAGATCTGGAAAGA(SEQ ID No：25)；CST1的第一种剪切子的上下游引物同TaqMan水解探针的Real-time PCR法；CST1的第二种剪切子的上下游引物，上游：GCACTGGGGAAGAGAGGCAT(SEQ ID No：26)下游：AGGAGCAGCAGGGTACTCAGATA(SEQ ID No：27)CST2引物，上游：CAGAAGAAACAGTTGTGCTC(SEQ ID No：28)下游：GGAGTAGGAGGTGGTCAG(SEQ ID No：29)CST4引物，上游：GCTCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQ ID No：30)下游：TATCCTATTCTCCTCCTTGG(SEQ ID No：31)内参基因β-actin，上游引物：AAGATCATTGCTCCTCCTG(SEQ ID No：32)，下游引物：CGTCATACTCCTGCTTGC(SEQ ID No：33)。癌和癌旁组织目的基因和内参基因一起扩增，通过2^(-ΔΔCT)公式计算目的基因在癌和癌旁组织中的相对表达量。荧光染料如SYBR Green，Eve Green，LC Green等。

核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplificatin，NASBA)的体外RNA扩增技术：T7RNA聚合酶，RNase H，禽骨髓白血病病毒(AMV)逆转录酶，核糖核苷酸(NTP)，脱氧核糖核苷酸(dNTP)，CST1的第一个剪切子的上下游引物同TaqMan水解探针的Real-time PCR法，RNA荧光染料(Ribo-Green fluorescent dye)。42度，2小时，可将RNA模板扩增2^(9-12)，反应产物放入荧光检测仪内检测荧光强度(U)，从而反应初始模板量。

实施例1.人体不同组织中CST1的表达差异

所用人体组织标本除正常胃黏膜，结肠黏膜组织为发明人从合作医院收集外，其它各组织均从商业化机构购买。采用Affymetrix的核苷酸芯片HG-U95Av进行各正常组织CST1 mRNA表达比较，操作过程参照产品说明书。本实验的相对表达量的值是通过管家基因β-actin荧光值进行归一化处理后的标准化信号值。

结果如图2所示，除唾液腺中CST1表达量较高外，其它组织中CST1不表达，说明CST1mRNA表达在正常组织中的背景值很低，这对CST1用于病理条件下检测极为有利。在胃癌细胞株NCI-N87，结肠癌细胞株SW480，Caco2中过表达，在人胃上皮细胞GES-1，大肠癌细胞株LOVO，HCT116中不表达，说明CST1极有可能可作为胃癌，肠癌分子诊断的Marker。

实施例2.胃癌及癌旁手术组织样本CST1与CST1，2，4，CST2 mRNA表达量比较

通过比较20对(G1-G20)胃癌及癌旁组织中CST1，CST1，2，4，CST2 mRNA表达量，发现CST1 mRNA在胃癌和癌旁组织中表达量差异最大，结果见图3。上述标本均通过病理证明，采用染料法实时定量PCR。

实施例3.胃癌、癌旁组织样本中CST1第一种剪切方式(splice1)，第二种剪切方式(splice2)表达量差异

通过手术取样的样本均经病理验证后才进行RNA抽提和逆转录cDNA，采用染料法实时定量PCR，首先检测样本中管家基因ACTB表达量，发现样本ACTB中CP值基本一致，如图4a，也就是说样本中总的cDNA量基本一致，然后比较了CST1第一种剪切方式(splice1)，第二种剪切方式(splice2)在20对胃癌、癌旁组织中的癌旁的CP值与癌之差的中位数，见图4b，发现CST1第一种剪切方式(splice1)在癌与癌旁中的表达量差异明显优于splice2，也就是说CST1第一种剪切方式(splice1)在判别是否为癌时，更具有优越性。

实施例4.胃癌、癌旁及正常手术组织样本CST1的第一个剪切子(splice1)的表达差异

通过手术取样的样本均经病理验证后才进行RNA抽提和逆转录cDNA，Real-timePCR绝对定量法鉴定CST1第一个剪切子在胃癌、癌旁以及正常组织中的表达差异，测试样本数为100例。

图5的结果表明，胃恶性病理条件下特异性高表达CST1的第一个剪切子mRNA，而癌旁及正常组织低表达。癌拷贝的中位数是癌旁/正常拷贝中位数的57.5倍，提示CST1的第一个剪切子mRNA可作为良好的胃癌分子标志物。在100.68拷贝处划线，可将癌与正常区分开来，因此100.68拷贝可作为胃癌临床诊断的一个参考值。

实施例5.胃镜下取样的胃癌、胃炎中CST1的第一个剪切子的表达差异

胃镜下取样与手术取样的样本具有较大差别，主要表现在取样组织中胃癌细胞的比例变动很大，有时可能仅占到整块组织的很小一部分，有的甚至没有。因此本发明人统计比较了36例胃癌以及36例胃炎病人胃镜取样标本中CST1的第一个剪切子的表达差异，癌标本拷贝数的中位数是炎标本拷贝数中位数的24倍，如果在98.89拷贝处划线，可以将癌和炎区分开来，可为胃镜下取样胃癌诊断提供一参考值。

结果见图6，方法同样采用Real-time PCR绝对定量的方法。

实施例6.CST1的第一个剪切子在胃癌转移阳性淋巴结和阴性淋巴结中的表达差异

手术中获得的经病理证明为胃癌转移阳性的淋巴结20枚，且转移灶大小不等。病理阴性淋巴结15枚主要取自早期胃癌病人，原因是尽可能减少病理诊断阴性但实际有微转移存在的淋巴结，以避免实验误差。实验采用Real-time PCR检测方法，具体材料和过程同实施例2。

图7的结果表明，CST1的第一个剪切子在转移阳性淋巴结中高表达，而在阴性淋巴结中只有较低表达。转移阳性淋巴结CST1的第一个剪切子mRNA表达量是阴性淋巴结中的11.469倍。如果从98.5拷贝处划线，基本可区分胃癌转移阳性和阴性淋巴结。病理阴性淋巴结中有两例检出CST1的第一个剪切子弱阳性的淋巴结，经病理医师连续切片细致观察，鉴定有微转移的存在。因此，从CST1的第一个剪切子mRNA表达程度划分不仅100％区分了细胞学检测结果，而且能检测细胞血不能检出的有微转移存在的淋巴结，相比细胞学检测该检测方法具有更高的灵敏度。

实施例7.定量PCR检测外周血中游离胃癌细胞的准确度与细胞学检测对比

除去红细胞和血小板的外周血有核细胞提取RNA，经Real-time PCR方法定量检测CST1的第一个剪切子mRNA表达水平，通过和胃炎病人和正常人表达量的对比，判断胃癌患者的外周血中是否有游离胃癌细胞的存在，并和细胞学检测比对。

图8的结果表明，本发明的检测方法100％确认细胞学鉴定的阳性结果，同时可检测出细胞学鉴定胃阴性的病例中有部分转移病例，说明该方法比细胞学检测具有更高的灵敏度，能检测到细胞学无法检测的微转移的存在。

实施例8.定量PCR方法检测胃癌骨髓转移与细胞学检查结果对比

穿刺等方法获得的胃癌患者骨髓经Real-time PCR方法定量检测CST1的第一个剪切子mRNA表达水平，通过和正常骨髓的比较判断CST1的第一个剪切子mRNA是否高表达，确认骨髓是否存在转移和微转移，并与细胞学结果进行了比较。

图9的结果表明，本发明的检测方法可95％确认细胞学阳性结果，同时阳性率高于细胞学结果，表明敏感性比细胞学检测方法要高。

实施例9.胃癌病人血浆Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎/正常人的差异

应用商品化的试剂盒，抽提血浆中Cell-free RNA，Real-time PCR检测胃癌病人(50例)血浆Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎(30例)，正常人(30例)的差异。

结果如图10所示，图10a显示CST1第一个剪切子在癌中拷贝数的中位数是炎/正常的约20倍，在拷贝数13.972处划线，可将癌和炎/正常区分开来。图10b的ROC曲线显示基于CST1第一个剪切子表达量诊断胃癌的方法具有较高的灵敏度和特异性，因此CST1可作为非侵入性的血浆样本胃癌诊断的特异性Marker。

实施例10.连接酶链反应(Ligase chain reation，LCR)方法检测胃癌病人血样Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎/正常人的差异

应用商品化的试剂盒，抽提血浆中Cell-free RNA，Real-time PCR检测胃癌病人(50例)血浆Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎(30例)，正常人(30例)的差异。

结果如图11所示，CST1第一个剪切子在癌中相对荧光强度(relative light units，RLU)的中位数是炎/正常的约19倍，在相对荧光强度13.66RLU处划线，可将癌和炎/正常区分开来。

实施例11适温链置换扩增(thermophilic strand displacement amplification，tSDA)方法胃癌病人血样Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎/正常人的差异

应用商品化的试剂盒，抽提血浆中Cell-free RNA，Real-time PCR检测胃癌病人(50例)血浆Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎(30例)，正常人(30例)的差异。

结果见图12，CST1第一个剪切子在癌中相对荧光强度(relative light units，RLU)的中位数是炎/正常的约19倍，在相对荧光强度12.44RLU处划线，可将癌和炎/正常区分开来。

实施例12.胃癌病人尿样Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎/正常人的差异

应用商品化的试剂盒，抽提尿液中Cell-free RNA，荧光检测的核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplificatin，NASBA)检测胃癌病人(20例)尿样Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎(10例)，正常人(10例)的差异。

结果如图13所示，CST1第一个剪切子在癌中荧光强度的中位数是炎/正常的约7倍，在14.329U处划线，可将癌和炎/正常区分开来，即可作为非侵入性的尿液样本胃癌诊断的一个参考值。

实施例13.CST1第一个剪切子表达量与胃癌pTNM分期的关系应用商品化的试剂盒，抽提血浆中Cell-free RNA，应用Gen-probe转录介导的扩增(Transcription-Mediated amplification，TMA)方法，检测50例胃癌(pTNM分期，I+II 30例，III+IV50例)不同分期CST1第一个剪切子表达量的差异。

结果见图14，CST1第一个剪切子在胃癌I+II中相对荧光强度(relative light units，RLU)的中位数是III+IV的2.1倍，在相对荧光强度(relative light units，RLU)12.44RLU处划线，可将癌和炎/正常区分开来。

实施例14.大肠癌及癌旁手术组织样本CST1的第一个剪切子的表达差异

通过手术取样的样本均经病理验证后才进行RNA抽提和逆转录cDNA，Real-timePCR绝对定量法鉴定CST1第一个剪切子在大肠癌和癌旁组织中的表达差异，测试样本数为100对。

图15的结果表明，结肠恶性病理条件下特异性高表达CST1的第一个剪切子mRNA，而癌旁的正常组织低表达。癌拷贝的中位数是癌旁拷贝中位数的48.95倍，提示CST1的第一个剪切子mRNA可作为良好的肠癌分子标志物。在77.7拷贝处划线，可将癌与正常区分开来，因此77.7拷贝可作为大肠癌临床诊断的一个参考值。

实施例15.肠镜下取样的肠癌、肠炎中CST1的第一个剪切子的表达差异。

肠镜下取样与手术取样的样本具有较大差别，主要表现在取样组织中肠癌细胞的比例变动很大，有时可能仅占到整块组织的很小一部分，有的甚至没有。因此本发明人统计比较了36例肠癌以及36例肠炎病人肠镜取样标本中CST1的第一个剪切子的表达差异，癌标本拷贝数的中位数是炎标本拷贝数中位数约23.1倍，如果在87.5拷贝处划线，可以将癌和炎区分开来，可为肠镜下取样胃癌诊断提供一参考值。

结果见图16，方法同样采用Real-time PCR绝对定量的方法。

实施例16.CST1的第一个剪切子在肠癌转移阳性淋巴结和阴性淋巴结中的表达差异

手术中获得的经病理证明为肠癌转移阳性的淋巴结20枚，且转移灶大小不等。病理阴性淋巴结15枚主要取自早期肠癌病人，原因是尽可能减少病理诊断阴性但实际有微转移存在的淋巴结，以避免实验误差。实验采用Real-time PCR检测方法，具体材料和过程同实施例2。

图17的结果表明，CST1的第一个剪切子在转移阳性淋巴结中高表达，而在阴性淋巴结中只有较低表达。转移阳性淋巴结CST1的第一个剪切子mRNA表达量是阴性淋巴结中的11.469倍。如果从100拷贝处划线，基本可区分肠癌转移阳性和阴性淋巴结。病理阴性淋巴结中有两例检出CST1的第一个剪切子弱阳性的淋巴结，经病理医师连续切片细致观察，鉴定有微转移的存在。因此，从CST1的第一个剪切子mRNA表达程度划分不仅100％区分了细胞学检测结果，而且能检测细胞血不能检出的有微转移存在的淋巴结，相比细胞学检测该检测方法具有更高的灵敏度。

实施例17.肠癌病人血浆Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎/正常人的差异

应用商品化的试剂盒，抽提血浆中Cell-free RNA，Real-time PCR检测肠癌病人(50例)血浆Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎(30例)，正常人(30例)的差异。

结果如图18所示，图18a显示CST1第一个剪切子在癌中拷贝数的中位数是炎/正常的约20倍，在拷贝数13.89处划线，可将癌和炎/正常区分开来。图18b的ROC曲线显示基于CST1第一个剪切子表达量诊断肠癌的方法具有较高的灵敏度和特异性，因此CST1可作为非侵入性的血浆样本肠癌诊断的特异性Marker。

实施例18.肠癌病人尿样Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎/正常人的差异

应用商品化的试剂盒，抽提尿液中Cell-free RNA，荧光检测的核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplificatin，NASBA)检测肠癌病人(30例)尿样Cell-free RNA中CST1第一个剪切子量与炎(20例)，正常人(20例)的差异。

结果如图19所示，CST1第一个剪切子在癌中拷贝数的中位数是炎/正常的约7倍，在拷贝数16.96U处划线，可将癌和炎/正常区分开来，即可作为非侵入性的尿液样本肠癌诊断的一个参考值。

实施例19.CST1第一个剪切子表达量用于胃癌、肠癌治疗过程中动态监测

应用实时定量PCR方法，通过检测病人血液中CST1第一个剪切子表达量，实时监测胃癌化疗病人3人，放疗病人2人，肠癌化疗病人3人，放疗2人，治疗效果。

结果见表1，治疗有效的病人CST1第一个剪切子表达量随着疗程的增加逐渐降低，影像学结果也显示，肿块逐渐减小；而治疗无效的病人CST1第一个剪切子表达量随着疗程的增加逐渐增加，影像学结果显示，肿块有变大的趋势。因此，CST1第一个剪切子可作为胃癌、肠癌患者治疗过程中一个动态监测的指标。

表1为通过实时定量PCR检测放化疗过程中胃肠肿瘤患者血液中CST1第一个剪切子的量

实施例20.CST1第一个剪切子表达量与胃癌、肠癌患者预后判断的关系

基于实时定量PCR技术，分别在术后或放化疗后的1个月、3个月、1年，跟踪随访了3个胃癌，2个肠癌患者血液中CST1第一个剪切子表达量的情况。

结果如表2所示，一年后复发的2个病人，CST1第一个剪切子表达量随着时间的延长逐渐增高，当达到1000个拷贝左右时才被影像学发现确诊；而1年内没有复发的病人，CST1第一个剪切子表达量并无明显变化，影像学也无异常。因此，CST1第一个剪切子表达量变化可作为胃肠肿瘤患者预后判断的一个指标。表2为通过实时定量PCR检测手术后或放化疗后1个月、3个月、1年，胃肠肿瘤患者血液中CST1第一个剪切子的量。

实施例21.基于Taqman水解探针法的CST1 mRNA实时定量检测试剂盒

制备试剂盒，所述的试剂盒中含有：

(1)引物，探针，包括：

上游引物：TCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQ ID No：1)

下游引物：TTATCCTATCCTCCTCCTTGG(SEQ ID No：2)

探针：5′-FAM-CTCCAGCTTTGTGCTCTGCCTCT-TAMRA-3′(SEQ ID No：3)

(2)常规的核酸抽提液及逆转录试剂，dNTP、Taq酶，无RNA酶的水(Rnase-freeH2O)、标准品、阳性对照品、阴性对照品，10＊Buffer，Mgcl2。

(3)使用说明书。

实施例22.基于染料法的CST1 mRNA实时定量检测试剂盒

试剂盒中含有：

(1)CST1引物，包括：

上游引物：TCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQ ID No：1)

下游引物：TTATCCTATCCTCCTCCTTGG(SEQ ID No：2)

β-actin：

上游引物：AAGATCATTGCTCCTCCTG(SEQ ID No：30)

下游引物：CGTCATACTCCTGCTTGC(SEQ ID No：31)

(2)常规的核酸抽提液及逆转录试剂，SYBR Green染料，dNTP，Taq酶，无RNA酶的水(RNase-free H2O)、标准品、阳性对照品、阴性对照品10＊Buffer，Mgcl2。

(3)使用说明书。

实施例23.基于核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplificatin，NASBA)法的CST1 mRNA定量检测试剂盒

试剂盒中含有：

(1)CST1引物，包括：

上游引物：TCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQ ID No：1)

下游引物：TTATCCTATCCTCCTCCTTGG(SEQ ID No：2)

常规的核酸抽提液及逆转录试剂，T7RNA聚合酶，RNase H，

禽骨髓白血病病毒(AMV)逆转录酶，核糖核苷酸(NTP)，脱氧核糖核苷酸(dNTP)，RNA荧光染料(Ribo-Green fluorescent dye)。

使用说明书。

实施例24.基于转录介导的扩增(Transcription-mediated amplification，TMA)的CST1 mRNA定量检测试剂盒。

制备试剂盒，所述的试剂盒中含有：

(1)引物，探针，包括：

上游引物：TCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQ ID No：1)

下游引物：TTATCCTATCCTCCTCCTTGG(SEQ ID No：2)

探针：5′-FAM-CTCCAGCTTTGTGCTCTGCCTCT-TAMRA-3′(SEQ ID No：3)

(2)其它反应试剂为Gen-probe TMA assay中除引物和探针之外的试剂。

(3)使用说明书

实施例25.基于连接酶链反应(Ligase chain reation，LCR)的CST1 mRNA定量检测试剂盒

制备试剂盒，所述的试剂盒中含有：

(1)探针4条(半抗原标记)

1)AGTATCTGAGTACCCTGCTGCTCCTGC(SEQ ID No：34)

2)ACCCTAGCTGTGGCCCTGGCCTGGAG(SEQ ID No：35)

3)CATAGACTCATGGGACGACG(SEQ ID No：36)

4)ACACCGGGACCGGACCTC(SEQ ID No：37)

(2)商业化的核酸提取试剂、逆转录试剂，其它试剂同Abbott Laboratories(LCX)

(3)说明书

实施例26.基于适温链置换扩增(thermophilic strand displacement amplification，tSDA)的CST1mRNA定量检测试剂盒

制备试剂盒，所述的试剂盒中含有：

(1)引物

randam primer：GTCGAC-TCTCA、CCCTCCTCTCCTG(SEQ ID No：1)(加Hinc II酶切位点)

下游引物：TTATCCTATCCTCCTCCTTGG(SEQ ID No：2)

探针：

5′-FAM-GTCGAC-TCTCAATCGACCGGCCAGGTTAGCGTCGATCTCCCTCCTCTCCTG-TAMRA-3′(SEQ ID No：38)

(2)商业化核酸提取试剂、逆转录试剂，其它试剂同Becton Dickinson的Thermophilicstrand displacement amplification(tSDA)assay。

(3)说明书。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>苏州工业园区为真生物医药科技有限公司

<120>胃肠肿瘤诊断和预示的新分子标记

<130>

<160>46

<170>PATENTIN VERSION 3.5

 

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>引物

 

<400>1

tctcaccctc ctctcctg                          18

 

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>引物

 

<400>2

ttatcctatc ctcctccttg g                      21

 

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>探针

 

<400>3

ctccagcttt gtgctctgcc tct                    23

 

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>引物

 

<400>4

ccctgggaga acagaaggtc c                      21

 

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>5

ggtggtggct ggtgcgaat                         19

 

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>6

cattcgcacc agccaccac                           19

 

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>引物

 

<400>7

agaagcaaga aggaaggagg gag                      23

 

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>8

cagcgtgccc ttcacttcg                           19

 

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>引物

 

<400>9

cggtctgttg cctggctctt a                        21

 

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>10

cattcgcacc agccaccac                           19

 

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>引物

 

<400>11

cagggctata gaagcaagaa ggaa                     24

 

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>引物

 

<400>12

ggtacagcgt gcccttcacttc                      22

 

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>引物

 

<400>13

cggtctgttg cctggctctt a                      21

 

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>引物

 

<400>14

gagaacagaa ggtccctggt gaa                    23

 

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>15

ggtggtggct ggtgcgaat                         19

 

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>引物

 

<400>16

tgggtacagc gtgcccttca                        20

 

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>引物

 

<400>17

cggtctgttg cctggctctt a                      21

 

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>引物

 

<400>18

ccctgggaga acagaaggtc c                      21

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>19

tggtggctgg tgcgaatgg                           19

 

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>引物

 

<400>20

ttccctggga gaacagaagg tcc                      23

 

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>21

tggtggctgg tgcgaatgg                           19

 

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>引物

 

<400>22

gggctccctg cctcgggctc tcac                     24

 

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>引物

 

<400>23

acggtctgtt gcctggctct tagt                     24

 

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>24

agtcccagcc caacttgga                           19

 

<210>25

<211>24

<212>DNA

<213>引物

 

<400>25

gggaacttcg tagatctgga aaga                      24

 

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>引物

 

<400>26

gcactgggga agagaggcat                           20

 

<210>27

<211>23

<212>DNA

<213>引物

 

<400>27

aggagcagca gggtactcag ata                       23

 

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>引物

 

<400>28

cagaagaaac agttgtgctc                           20

 

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>引物

 

<400>29

ggagtaggag gtggtcag                             18

 

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>引物

 

<400>30

gctctcaccc tcctctcctg                           20

 

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>引物

 

<400>31

tatcctattc tcctccttgg                      20

 

<210>32

<211>19

<212>DNA

<213>引物

 

<400>32

aagatcattg ctcctcctg                       19

 

<210>33

<211>18

<212>DNA

<213>引物

 

<400>33

cgtcatactc ctgcttgc                        18

 

<210>34

<211>27

<212>DNA

<213>引物

 

<400>34

agtatctgag taccctgctg ctcctgc              27

 

<210>35

<211>26

<212>DNA

<213>引物

 

<400>35

accctagctg tggccctggc ctggag               26

 

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>引物

 

<400>36

catagactca tgggacgacg                      20

 

<210>37

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>37

acaccgggac cggacctc                                                  18

 

<210>38

<211>51

<212>DNA

<213>引物

 

<400>38

gtcgactctc aatcgaccgg ccaggttagc gtcgatctcc ctcctctcct g             51

 

<210>39

<211>782

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

 

<400>39

gggctccctg cctcgggctc tcaccctcct ctcctgcagc tccagctttg tgctctgcct     60

ctgaggagac catggcccag tatctgagta ccctgctgct cctgctggcc accctagctg    120

tggccctggc ctggagcccc aaggaggagg ataggataat cccgggtggc atctataacg    180

cagacctcaa tgatgagtgg gtacagcgtg cccttcactt cgccatcagc gagtataaca    240

aggccaccaa agatgactac tacagacgtc cgctgcgggt actaagagcc aggcaacaga    300

ccgttggggg ggtgaattac ttcttcgacg tagaggtggg ccgcaccata tgtaccaagt    360

cccagcccaa cttggacacc tgtgccttcc atgaacagcc agaactgcag aagaaacagt    420

tgtgctcttt cgagatctac gaagttccct gggagaacag aaggtccctg gtgaaatcca    480

ggtgtcaaga atcctaggga tctgtgccag gccattcgca ccagccacca cccactccca    540

ccccctgtag tgctcccacc cctggactgg tggcccccac cctgcgggag gcctccccat    600

gtgcctgcgc caagagacag acagagaagg ctgcaggagt cctttgttgc tcagcagggc    660

gctctgccct ccctccttcc ttcttgcttc taatagccct ggtacatggt acacaccccc    720

ccacctcctg caattaaaca gtagcatcgc ctccctctga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    780

aa                                                                   782

 

<210>40

<211>299

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

 

<400>40

gggctccctg cctcgggctc tcaccctcct ctcctgcagc tccagctttg tgctctgcct    60

ctgaggagac catggcccag tatctgagta ccctgctgct cctgctggcc accctagctg    120

tggccctggc ctggagcccc aaggaggagg ataggataat cccgggtggc atctataacg    180

cagacctcaa tgatgagtgg gtacagcgtg cccttcactt cgccatcagc gagtataaca    240

aggccaccaa agatgactac tacagacgtc cgctgcgggt actaagagcc aggcaacag     299

 

<210>41

<211>114

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

 

<400>41

accgttgggg gggtgaatta cttcttcgac gtagaggtgg gccgcaccat atgtaccaag    60

tcccagccca acttggacac ctgtgccttc catgaacagc cagaactgca gaag          114

 

<210>42

<211>341

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

 

<400>42

aaacagttgt gctctttcga gatctacgaa gttccctggg agaacagaag gtccctggtg    60

aaatccaggt gtcaagaatc ctagggatct gtgccaggcc attcgcacca gccaccaccc    120

actcccaccc cctgtagtgc tcccacccct ggactggtgg cccccaccct gcgggaggcc    180

tccccatgtg cctgcgccaa gagacagaca gagaaggctg caggagtcct ttgttgctca    240

gcagggcgct ctgccctccc tccttccttc ttgcttctaa tagccctggt acatggtaca    300

caccccccca cctcctgcaa ttaaacagta gcatcgcctc cctctga                  347

 

<210>43

<211>760

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

 

<400>43

gggctccctg cctcgggctc tcaccctcct ctcctgcagc tccagctttg tgctctgcct    60

ctgaggagac catggcccag tatctgagta ccctgctgct cctgctggcc accctagctg    120

tggccctggc ctggagcccc aaggaggagg ataggataat cccgggtggc atctataacg    180

cagacctcaa tgatgagtgg gtacagcgtg cccttcactt cgccatcagc gagtataaca    240

aggccaccaa agatgactac tacagacgtc cgctgcgggt actaagagcc aggcaacaga    300

ccgttggggg ggtgaattac ttcttcgacg tagaggtggg ccgcaccata tgtaccaagt    360

cccagcccaa cttggacacc tgtgccttcc atgaacagcc agaactgcag aagaaacagt    420

tgtgctcttt cgagatctac gaagttccct gggagaacag aaggtccctg gtgaaatcca    480

ggtgtcaaga atcctaggga tctgtgccag gccattcgca ccagccacca cccactccca    540

ccccctgtag tgctcccacc cctggactgg tggcccccac cctgcgggag gcctccccat    600

gtgcctgcgc caagagacag acagagaagg ctgcaggagt cctttgttgc tcagcagggc    660

gctctgccct ccctccttcc ttcttgcttc taatagccct ggtacatggt acacaccccc    720

ccacctcctg caattaaaca gtagcatcgc ctccctctga                          760

 

<210>44

<211>655

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

 

<400>44

caggaagtca catagctttc acagtcaaag gaccagtgtc acctctgtgg agacctgggt    60

gactcaagct tgggagcact ggggaagaga ggcatggctc ggggaggctg cactccagct    120

ttgtgctctg cctctgagga gaccatggcc cagtatctga gtaccctgct gctcctgctg    180

gccaccctag ctgtggccct ggcctggagc cccaaggagg aggataggat aatcccgggt    240

ggcatctata acgcagacct caatgatgag tgggtacagc gtgcccttca cttcgccatc    300

agcgagtata acaaggccac caaagatgac tactacagac gtccgctgcg ggtactaaga    360

gccaggcaac agaccgttgg gggggtgaat tacttcttcg acgtagaggt gggccgcacc    420

atatgtacca agtcccagcc caacttggac acctgtgcct tccatgaaca gccagaactg    480

cagaagaaac agttgtgctc tttcgagatc tacgaagttc cctgggagaa cagaaggtcc    540

ctggtgaaat ccaggtgtca agaatcctag ggatctgtgc caggccattc gcaccagcca    600

ccacccactc ccaccccctg tagtgctccc acccctggac tggtggcccc caccc         655

 

<210>45

<211>141

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

 

<400>45

tctcaccctc ctctcctgca gctccagctt tgtgctctgc ctctgaggag accatggccc    60

agtatctgag taccctgctg ctcctgctgg ccaccctagc tgtggccctg gcctggagcc    120

ccaaggagga ggataggata a                                              141

 

<210>46

<211>304

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

 

<400>46

gggctccctg cctcgggctc tcaccctcct ctcctgcagc tccagctttg tgctctgcct    60

ctgaggagac catggcccag tatctgagta ccctgctgct cctgctggcc accctagctg    120

tggccctggc ctggagcccc aaggaggagg ataggataat cccgggtggc atctataacg    180

cagacctcaa tgatgagtgg gtacagcgtg cccttcactt cgccatcagc gagtataaca    240

aggccaccaa agatgactac tacagacgtc cgctgcgggt actaagagcc aggcaacaga    300

ccgt                                                                 304