一种野牛草ISSR-PCR分子标记体系

摘要

本发明属于野牛草分子育种技术领域，具体涉及一套野牛草ISSR-PCR反应最佳体系。本发明提供如下的ISSR-PCR反应体系：每25μL的反应体系中含有1×PCR缓冲液，dNTPs 0.3mM，Taq酶1.0U，如SEQ ID 1～7所示引物中的任一引物0.6μM，Mg2+ 2.0mM，DNA模板50ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：94℃预变性3min，94℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次，72℃再延伸4min。本发明提供的野牛草ISSR-PCR稳定性好，清晰度高而且增加了条带的丰富度。

说明书

技术领域

本发明属于野牛草分子育种技术领域，具体涉及一套野牛草ISSR-PCR反应最佳体系。

背景技术

野牛草(Buchloe dactyloides)是禾本科画眉草亚科野牛草属多年生草坪草，近一百年里它主要被当作牧草种植，但由于其具有很多优良特性及较好的坪用价值(如耐旱、植株低矮、叶片纤细柔软等)而逐渐被用于草坪种植，而且与其它草坪草种相比没有较明显的病害。随着水资源的日益短缺及公众对环境要求的日益重视，野牛草草坪由于具有很强的耐旱性而逐渐被人们所重视。由于其优越的抗旱性及适应性，成为我国华北、东北、西北等地区园林绿化、环境保护、水土保持的主要草种之一。目前野牛草育种技术采用的仍然是传统的选择育种、诱变育种等方法，使得野牛草品种的遗产基础日益狭窄，一些重要的性状如耐旱性、品质、耐热性等均有不同程度的丢失，从而限制了我国野牛草育种业的发展。

分子标记辅助选择(molecular maker-assisted selection)是根据目标性状的分子标记，对育种后代进行选择的一种育种方法，其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。由于分子标记不受环境条件的影响，能够快速有效地选择出带有目标性状的单株、加快优良基因的聚合和提高作物数量性状的选择，因而这种方法可以提高育种选择的准确性，缩短育种周期，加快育种进程。

简单重复区间序列标记(ISSR)，是以微卫星为引物的PCR分子标记，它直接对基因组DNA进行分析，不受任何环境条件影响。它用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3’端或5’端加上2～4个随机核苷酸，在基因组上只有与锚定的核苷酸匹配的位点才能被靶定，避免了SSR在基因组中的滑动，大大地提高了PCR扩增的专一性。ISSR引物开发费用低，操作简单，比RAPD和RFLP能揭示更高的多态性。它在牧草遗传连锁图谱的构建、基因定位、种质资源鉴定、牧草进化和遗传多样性的分析、分子标记辅助选择等方面得到越来越广泛的应用。ISSR分子标记试验的关键在于对反应体系和试验条件的优化。不同的材料的ISSR-PCR体系存在着很大差异，DNA模板的浓度和纯度、引物和dNTP、Taq酶的用量和商品型号、Mg²⁺浓度，引物的浓度、反应时间和PH值大小等诸多因素都会影响试验的结果。

近年来畜牧业有了很大发展，ISSR标记技术在牧草研究中相继使用，但是目前国内外关于野牛草ISSR标记技术的报道还很少，只有刘莉等运用ISSR研究野牛草实生群体多样性的表型。其所选择的ISSR-PCR反应体系为(20μL)：1×PCR buffer缓冲液、0.2mM dNTPs、1.0U Taq酶、0.5μM引物、2.0mM Mg²⁺、DNA模板30ng，清晰度和条带丰富度稍有欠缺。

总体而言，野牛草资源的研究和其它牧草相比还存在很大的差距。因此建立野牛草的科学合理的ISSR-PCR反应体系，寻求最佳理论组合，既可以加快试验进程，为后续工作提供科学的依据和指导作用，又可以提高分子标记辅助育种的效率，缩短育种年限。

发明内容

本发明的目的是提供一种野牛草ISSR-PCR反应体系及其应用。

其中，每25μL的反应体系中含有1×PCR缓冲液，dNTPs 0.3mM，Taq酶1.0U，SEQ IDNo.1～7引物中的任一引物0.6μM，Mg²⁺ 2.0mM，DNA模板50ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：

94℃预变性3min，94℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次，72℃再延伸4min。

优选的退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下：

SEQ ID No.1 52.8℃

SEQ ID No.2 49.9℃

SEQ ID No.3 57.7℃

SEQ ID No.4 49.9℃

SEQ ID No.5 57.7℃

SEQ ID No.6 48.8℃

SEQ ID No.7 57.7℃。

本发明提供的野牛草ISSR-PCR反应体系多态性丰富，背景清晰且信号强。

本发明较为细致地进行了野牛草ISSR-PCR反应体系的建立与优化工作，确定了适合野牛草的ISSR-PCR最佳反应体系，大大提高了试验的准确性和稳定性，缩短了育种年限。本发明以ISSR标记为起点，弥补了国内外对野牛草遗传多样性研究的不足，发明成果可用于野牛草杂交育种、遗传关系、分子标记辅助育种、新品种选育等方面，具有很大的科学价值与应用价值。

附图说明

图1为ISSR-PCR探索性正交试验图。其中M表示DL2000 Marker；1-9表示处理组合1-9。

图2为ISSR-PCR细调性正交试验图。其中M表示DL2000 Marker；1-9表示处理组合1-9。

图3两种反应体系结果的比较。其中M表示DL2000 Marker；1-9表示处理组合1-9。

图4为引物TP10最佳退火温度的确定。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 野牛草基因组DNA提取

(1)取新鲜野牛草叶片1g左右，清水洗净、擦干，剪碎放入研钵，随后倒入液氮致冷、研磨；

(2)将研磨后的粉末加入65℃的2×CTAB提取液900μL，65℃水浴30min；

(3)冷却后加入500μL氯仿/异戊醇(体积比24∶1)；

(4)8000rpm下离心10min；

(5)取上清液；

(6)重复(4)、(5)一次；

(7)加入1/10体积的3M醋酸钠和等体积的异丙醇，摇匀，冰上放置5min以上至出现絮状沉淀；

(8)12000rpm下离心15min，倒掉上清液；

(9)用75％酒精清洗，室温干燥1h后溶于TE缓冲液4℃保存备用。

实施例2 ISSR-PCR正交体系(25μL)的建立与优化

根据正交设计原理，采用L₉(3⁴)正交设计表，首先对dNTPs、Taq酶、引物和Mg²⁺浓度进行4因素3水平的探索性正交试验，探索性正交设计表见表1；再根据探索性正交试验的结果，缩小各个引物的浓度梯度进行细调性正交试验，细调性正交设计见表3。所选ISSR-PCR引物序列为5′-AGAGAGAGAGAGAGAGYG-3′[Y＝(C，T)]，试验设2次重复。ISSR-PCR扩增程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次，72℃再延伸4min，最后4℃保存。

2.1探索性ISSR-PCR反应体系的建立

探索性ISSR-PCR反应体系的正交试验设计见表1。

表2 探索性正交试验设计[L₉(3⁴)]单位：μL

探索性正交试验结果见图1，1号和2号处理没有扩增出条带。3号处理有很微弱的条带。4号和8号处理条带较多但是清晰度不高，说明其扩增效率不是很高。6号和9号处理两个重复之间的条带不同，说明其稳定性不够好。5号和7号处理组合条带多且很清晰，重复性也好，说明距最优组合偏差不大再以其为基点，缩小各个因素的浓度梯度进行细调性正交试验。

2.2细调性ISSR-PCR反应体系的建立

细调性ISSR-PCR反应体系的正交试验设计见表2。

表2 细调性正交试验设计[L₉(3⁴)]单位：μL

细调性正交试验结果见图2，除了9号处理以外，其他8个处理组合都跑出了明显的条带。1、3、7号处理组合扩增出了较多条带但2次重复结果不太一样，说明这3个反应体系不太稳定。5号处理组合扩出的条带较多但是条带较弱不太清晰。4号处理扩出了3个条带，重复性好，但是条带颜色稍浅。6号处理组合只扩出了2个很淡的条带。8号处理的条带很少，重复性也不好。试验效果最好的是2号处理组合，总共扩增出了5个条带而且条带清晰、重复性也好，为最佳的处理组合。

对细调性正交试验结果用BIORAD Gel Doc-XR凝胶成像系统中Quantity One软件测出每个条带的相对浓度值，然后进行正交直观分析，如表3所示。

表3 ISSR-PCR细调正交试验结果直观分析

实施例3 ISSR-PCR反应体系稳定性检测

选用其他的模板DNA，分别用细调性正交试验9个处理组合中的最好组合(2号处理)和统计理论上的最佳处理组合进行ISSR-PCR，检测2个体系的稳定性并比较2个体系的扩增效率。

结果如图3所示。这2个扩增体系条带基本一样，但最佳理论组合扩增出的有些条带明显较亮，且扩增条带数较多，所以选用最佳理论组合为正式试验的ISSR-PCR反应体系。所以选用最佳理论组合为正式试验的ISSR-PCR反应体系，即25μL的反应体系中含有1×PCR缓冲液，dNTPs 0.3mM、Taq酶1.0U、引物0.6μM、Mg²⁺ 2.0mM，DNA模板50ng。

实施例4 引物筛选及最佳退火温度的确定

本试验ISSR反应引物采用加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列，并由上海生工合成的33条引物信息见表4。

在试验确定最佳反应体系基础上，在美国梯度PCR仪(Thermo)上进行引物筛选和最佳退火温度的确定。筛选出的引物及其最佳退火温度信息见表5。试验设置了12个退火温度：48.0℃，48.1℃，48.8℃，49.9℃，51.3℃，52.8℃，54.5℃，56.1℃，57.7℃，59.0℃，59.9℃，60.5℃。

表4 本试验所选引物的相关信息

注：Y-嘧啶，R-嘌呤

表5 引物筛选结果

采用筛选好的体系分别用33条引物进行扩增，结果表明以上7条引物扩增出来的条带亮，信号强且多态性好。大多数材料采用琼脂糖扩增的条带均在5条及以上，且多态信息含量丰富。

以TP10号引物为例，由图4可以看出，当退火温度比较低时，ISSR-PCR扩增的效果条带很多但是很模糊，说明当退火温度较低时ISSR-PCR扩增的特异性不好；当退火温度比较高时扩增的条带较少而且条带也弱，说明扩增效率不高。当退火温度在49.9℃时扩增较多且条带清晰。因此确定这条引物的最佳退火温度为49.9℃。同理，其他引物的最佳退火温度按此原则确定。