鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂及方法

摘要

本发明涉及动物医药领域，特别涉及鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂及方法，该检测试剂通过与鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫动物的血清发生凝集反应的程度来检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力，由菌体含量为2.00×108CFU/mL的鸭疫里默氏杆菌抗原与稀释剂混合而成，稀释剂的体积大于或等于待测血清体积的3倍，鸭疫里默氏杆菌抗原的体积等于待测血清与稀释剂的体积之和；该检测试剂配制简单，成本低廉，专一性强；利用该试剂检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力的方法包括凝集反应、观测结果、效力判断共三个步骤，避免了活体试验对动物的伤害，且操作简单，仅需通过测量血清中间数值即可判断疫苗效力。

说明书

技术领域

本发明涉及动物医药领域，特别涉及鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂及方法。

背景技术

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌(RA)引起的鸭、鹅等禽类败血症或慢性感染。其病变特征是出血、纤维素性心包炎、气囊炎、肝周炎、关节炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎等多种临床病症。由于鸭传染性浆膜炎给养鸭业带来严重的经济损失，有关其诊断和免疫预防等方面的研究引起了越来越多的关注。其中，疫苗效力检测技术非常重要，不仅可评价疫苗质量，还可对疫苗免疫鸭抵抗感染的状态做出评判。目前鸭传染性浆膜炎疫苗与其它疫苗的效力检测多采用攻毒保护率(或保护指数)来表示；此外也采用与攻毒保护率有平行关系的替代指标表示，即通过体液和细胞免疫检测评价疫苗的免疫效力。抗体检测方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接血凝试验(IHA)等，细胞免疫检测主要有淋巴细胞转化试验(LTT)等。但这些方法或需要通过活体动物，或操作复杂，仅适用于实验室研究而不适用于大规模使用。因此急需一种在生产上切实可行、操作简单、检测结果与免疫鸭产生保护效力相关性好的检测方法和相关试剂，但目前国内、外目前没有相关研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂，该试剂通过抽取鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫鸭的血液，测定血液中凝集抗体滴度，再利用上述滴度制备的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂；该检测试剂成本低廉，配制简单、专一性强。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂，通过与鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫动物的血清发生凝集反应的程度来检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力，所述检测试剂由菌体含量为2.00×10⁸CFU/mL的鸭疫里默氏杆菌抗原与稀释剂混合而成，所述稀释剂的体积大于或等于待测血清体积的3倍，所述鸭疫里默氏杆菌抗原的体积等于待测血清与稀释剂的体积之和。

进一步，所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂，所述鸭疫里默氏杆菌抗原的制备步骤具体为：

a、菌体培养：将鸭疫里默氏杆菌接种于含有体积分数为10％新生牛血清的胰酶大豆肉汤培养基中，37℃培养24～48h，得鸭疫里默氏杆菌培养液；

b、菌体灭活：向步骤a所得鸭疫里默氏杆菌培养液中加入甲醛至体积分数为0.5％，37℃作用24小时灭活菌体，得灭活鸭疫里默氏杆菌培养液；

c、调节浓度：将步骤b所得灭活鸭疫里默氏杆菌培养液离心，菌体沉淀用稀释剂离心洗涤后，再用稀释剂调节菌体含量为2.00×10⁸CFU/mL，即得鸭疫里默氏杆菌抗原；

进一步，所述检测试剂由鸭疫里默氏杆菌抗原与相当于待测血清体积3倍的稀释剂组成；

进一步，所述稀释剂为生理盐水或含有质量分数为0.5％的石碳酸的生理盐水。

本发明的目的之二在于提供一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测方法，该方法无需借助仪器检测和动物攻毒保护试验即可以实现快速检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述检测试剂检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

a凝集反应：将所述的检测试剂与待测血清充分混匀，置37℃温箱中16～24h，得凝集反应液；

b观测结果：观测所述凝集反应液中菌体凝集程度；

c判断：所述鸭疫里默氏杆菌抗原中数量为50％以上的菌体被凝集，判定为阳性，即鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力检测合格。

进一步，步骤a中所述检测试剂与待测血清之和为1mL；

进一步，所述方法中还设置空白对照和阳性血清对照。

本发明的有益效果在于：本检测试剂弥补了鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力检测试剂的空白，且成本低、配制简单、专一性强；另外，本试剂与免疫鸭产生保护效力的相关性好，且稳定性高；运用本试剂实现的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测方法避免了活体试验对动物的伤害，且操作简单，仅需通过测量血清中间数值即可实现对所述疫苗效力的判断；另外，本方法重现性高。

具体实施方式

实施例鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂及方法

一、检测试剂中稀释剂用量的确定

1、材料准备

①培养基：为含有体积分数为10％新生牛血清的胰酶大豆肉汤培养基；实验动物：选用健康非免疫的1日龄鸭购自鸭场，隔离饲养观察6天，进一步确诊健康后于7日龄进行实验，其抗血清I型鸭传染性浆膜炎血清抗体为阴性；供试疫苗：含血清I型鸭疫里默氏杆菌灭活菌1.00×10¹⁰CFU/ml，批号为2005003，批量为20000ml，供试疫苗采取随机抽样；另外，巧克力琼脂平板、鲜血琼脂平板、普通肉汤及厌氧肉肝汤培养基均按常规方法配制。

②血清I型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清的制作

免疫抗原的制备：将鸭疫里默氏杆菌进行纯培养，对培养物进行计数后灭活，备用。将弗氏完全佐剂在研钵中研磨均匀，在研磨过程中加入等体积的灭活鸭疫里默氏杆菌菌液，直至其成为均匀的乳白色油包水状液体，得弗氏完全佐剂免疫抗原。检查乳化效果标准：取一滴该液体置于冰水上5～10分钟不扩散判定为合格。乳化物中鸭疫里默氏杆菌菌体含量应为10¹⁰CFU/ml。制备弗氏不完全佐剂免疫抗原可参照弗氏完全佐剂免疫抗原的制备方法。

免疫动物：准备体重约2～3kgSPF鸡10只，免疫前每只采血检测无RA抗体存在，继续饲养观察2天，无异常情况即可用于阳性血清制备。SPF鸡群是指没有目前国际、国内流行的鸡疫病感染史，也不携带这些疫病的病原和抗体的具有良好生长和繁殖性能的鸡群。

免疫程序：分别于第一次免疫(弗氏完全佐剂免疫抗原)后第7日、14日和21天进行二、三和四次免疫(弗氏不完全佐剂免疫抗原)，免疫部位为胸、腿部皮下多点注射，每次免疫剂量为1ml/只；并于第四次免疫后10天静脉注射纯菌体抗原1.00×10¹⁰CFU/只。

抗体效价测定：采用试管凝集试验进行测定，其中凝集效价≥1∶32，判定其为合格。

2、鸭疫里默氏杆菌抗原的制备

将血清I型鸭疫里默氏杆菌接种于盛有250ml含有体积分数为10％新生牛血清的胰酶大豆肉汤培养基的玻璃三角瓶中，37℃温箱中24h，得鸭疫里默氏杆菌培养菌液。在鸭疫里默氏杆菌培养菌液中加入体积浓度为10％的甲醛至所述鸭疫里默氏杆菌培养菌液的甲醛体积浓度为0.5％，并于37℃继续作用24h灭活。用含有质量分数为0.5％石碳酸的生理盐水在转速5000转/分钟条件下离心洗涤3次，至上清液透明，去上清液得鸭疫里默氏杆菌，用含有质量分数为0.5％石碳酸的生理盐水将鸭疫里默氏杆菌调整浓度为2.00×10⁸CFU/ml，得鸭疫里默氏杆菌抗原。

采用玻片凝集试验测定鸭疫里默氏杆菌抗原，生理盐水作为空白对照品，具体为：分别将鸭疫里默氏杆菌抗原和生理盐水滴加于干净玻片上，并滴加未稀释的所述血清I型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清1滴，将载玻片轻轻反复摆动或用接种环涂开，37℃温箱35分钟观察结果，鸭疫里默氏杆菌抗原中出现清晰的乳白絮状凝集块，生理盐水中无凝集现象发生。

4、实验方法

取7日龄鸭60只作为实验鸭，随机分为实验组和对照组。实验1组为经鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫后7日用5.08×10⁹CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的实验鸭，对照1组为同龄仅注射生理盐水7日后用5.08×10⁹CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的试验鸭；实验2组为经鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫后14日用5.25×10⁹CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的实验鸭，对照2组为同龄仅注射生理盐水14日后用5.25×10⁹CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的试验鸭；实验3组为经鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫后21日用5.44×10⁹CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的实验鸭，对照3组为同龄仅注射生理盐水21日后用5.44×10⁹CFURA-CH-I菌株活菌进行攻毒的试验鸭。在RA-CH-I菌株活菌进行攻毒后，观察7日，记录临床发病及其死亡情况并剖杀存活的试验鸭，记录心包膜、肝周膜、浆膜病变，并从心血管和肝脏进行细菌的再分离。实验鸭发病的判定标准如下，即符合下列条件之一，判为发病：①试验鸭出现精神不振、行动蹒跚、眼鼻有分泌物流出、排绿、黄绿色稀薄粪便等鸭传染性浆膜炎临床症状；②死亡；③剖检时鸭可见心包膜炎或肝周膜炎或浆膜炎病变或心血、肝脏、脾脏分离细菌呈阳性。

试验鸭每只采血1.00ml并分离血清测定其凝集抗体，待测血清依次按2、4、8、16、32、64、128倍稀释，并按试管凝集法检测血清凝集抗体滴度，进而确定检测试剂中稀释剂用量。凝集抗体滴度测定采用1.00ml反应体系：依次取按上述倍数稀释的待检血清0.50ml和鸭疫里默氏杆菌抗原0.50ml。以血清I型RA标准阳性血清为阳性对照品，以生理盐水为空白对照品。按照下述试管凝集法的判断标准进行判断：

++++：管底形成伞状沉淀，或沉淀物呈片状、块状或颗粒状，直径≥0.25cm，即数量为100％以上的菌体被凝集；

+++：菌体大部分凝集呈片状、块状或颗粒状，直径0.20cm～0.24cm，即数量为75％以上的菌体被凝集；

++：管底有明显的凝集沉淀，呈块状或小片絮状物，直径0.10cm～0.19cm，即数量为50％以上的菌体被凝集；

+：有不太显著的凝集沉淀或仅有凝集沉淀的痕迹，直径0.01cm～0.09cm，即数量为25％以上的菌体被凝集；

-：液体呈浑浊、不透明，无凝集沉淀或凝集沉淀的痕迹。

以出现“++”判断标准的血清最高稀释度的下一倍比稀释度为待检血清效价，即抗体滴度。例如血清稀释度为1∶1时未出现凝集反应，则待检血清效价仍记为0；如果出现凝集反应，则待检血清效价记为1∶2，依次类推。其中生理盐水对照凝集效价应≤1∶2。

5、实验结果

经鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫后7日用5.08×10⁹CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的实验鸭凝集抗体滴度与保护效力的关系见表1。

表1鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫7日龄鸭后7日抵抗5.08×10⁹CFU攻击的结果

经鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫后14日用5.25×10⁹CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的实验鸭凝集抗体滴度与保护效力的关系见表2。

表2鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫7日龄鸭后14日抵抗5.25×10⁹CFU攻击的结果

经鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫后21日用5.44×10⁹CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的实验鸭凝集抗体滴度与保护效力的关系见表3。

表3鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫7日龄鸭后21天抵抗5.44×10⁹CFU攻击的结果

实验结果表明，鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫鸭凝集抗体滴度与保护效力呈现明显的正相关。随着鸭日龄的增长，鸭对鸭传染性浆膜炎感染的抵抗力在增强。免疫后7日：表1可以看出，鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫7日龄鸭后7日，产生部分免疫力，免疫鸭血清凝集抗体滴度为1∶2～1∶4，抵抗5.08×10⁹CFU攻击为5/10保护，非免疫对照10/10发病。免疫14日：从表2可以看出，鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫7日龄鸭后14日，产生良好免疫力，免疫鸭血清凝集抗体滴度为1∶8～1∶16，抵抗5.25×10⁹CFU攻击为10/10保护，非免疫对照为8/10发病。免疫21天：从表3可以看出，鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫7日龄鸭后21天，产生很强的免疫力，免疫鸭血清凝集抗体滴度为1∶16～1∶32，抵抗5.44×10⁹CFU攻击为10/10保护，非免疫对照为10/10发病。

综上所述，鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫鸭，免疫鸭血清凝集抗体滴度≥1∶8，即血清1∶4稀释后与等量凝集抗原混合，可产生良好免疫保护力。由于滴度是稀释倍数的倒数，根据上述凝集抗体滴度实验筛选的稀释倍数，即大于或等于3倍，可制备鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂。其中，当稀释倍数在大于3倍时出现试管凝集法的判断标准中“++”的现象，在稀释倍数在等于3倍必然会出现试管凝集法的判断标准中“++”的现象。所以，在下述检测试剂的配制及检测方法的运用中，稀释剂以3倍的阈标准对疫苗的阈效力进行判断。

二、鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测方法

1、材料准备

以灭活血清I型鸭疫里默氏杆菌菌体为鸭疫里默氏杆菌抗原；以效价为32～64的SPF鸡抗血清I型鸭疫里默氏杆菌免疫血清为阳性对照，生理盐水为阴性对照；另准备含有质量分数为0.5％石碳酸的生理盐水为稀释剂、灭菌小玻璃试管(0.9cm ×9cm)、2.00ml玻璃吸管及20～200μl加样器等。

2、鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂的制备

取0.5000份浓度为2.00×10⁸CFU/mL的鸭疫里默氏杆菌抗原与0.375份含有质量分数为0.5％石碳酸的生理盐水混合，得鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂。

3、鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测实验

特进行免疫原性和攻毒保护试验以验证鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测实验：用5批供试疫苗(批号为2005001～2005005)分别对14日龄健康易感鸭20只分别经腿部肌肉注射、颈部皮下注射两种接种途径注射0.50ml/只，每种途径免疫10只，进行免疫原性和攻毒保护实验；另设相同条件的生理盐水空白对照，免疫后14日分别采血测定血清凝集抗体滴度，同时用5.40×10⁹CFU强毒活菌进行攻毒，观察7日，并记录保护结果。

用0.375份含有质量分数为0.5％石碳酸的生理盐水与0.500份所述鸭疫里默氏杆菌抗原混合后，所得的效力检测试剂与0.125份待测血清在试管中充分混匀，每管总体积为1mL，置37℃温箱中24h；观测所述待测血清与所述抗原的凝集现象，按照试管凝集法的判断标准：

++++：管底形成伞状沉淀，或沉淀物呈片状、块状或颗粒状，直径≥0.25cm，即数量为100％以上的菌体被凝集；

+++：菌体大部分凝集呈片状、块状或颗粒状，直径0.20cm～0.24cm，即数量为75％以上的菌体被凝集；

++：管底有明显的凝集沉淀，呈块状或小片絮状物，直径0.10cm～0.19cm，即数量为50％以上的菌体被凝集；

+：有不甚显著的凝集沉淀或仅有凝集沉淀的痕迹，直径0.01cm～0.09cm，即数量为25％以上的菌体被凝集；

-：液体呈浑浊、不透明，无凝集沉淀或凝集沉淀的痕迹。以出现“++”以上判为阳性，即鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力检测合格。

4、鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测实验结果

在阳性对照出现++以上，阴性对照液体呈浑浊、不透明，无凝集沉淀的痕迹的现象成立时，待测血清的检测为阳性时，即出现“++”以上判断标准的现象，疫苗效力检测为合格。结果详见表4、表5。

表42005001～2005005批实验室制疫苗免疫14日龄鸭后14日凝集抗体滴度结果

表5  2005001～2005005批实验室制疫苗对14日龄鸭免疫保护结果

注A：分母为免疫组14日后攻毒鸭数或对照组攻毒鸭数，分子为攻毒鸭观察7日临床健康鸭数。

B：分母为对照组攻毒鸭数，分子为攻毒鸭观察7日发病鸭数。

5结果

将5批实验室疫苗制品对14日龄健康易感鸭进行效力试验，结果表明：该实验室制疫苗免疫原性好，免疫鸭后能产生较高的抗体滴度，可对鸭产生10/10保护，且运用本检测试剂及检测方法的判断结果和以实验鸭发病的判定标准的判断结果100％吻合。

本实验使用的理论和技术成熟，结果判定指标客观，整个实验的各个环节严格操作、正确评估实验结果，结果如有疑议至少重复操作2次。每一个实验组的鸭≥10只，由此认为本实验结果有效。

另外，本实验采用1ml体积，即所述鸭疫里默氏杆菌抗原、待测血清和稀释剂体积之和为1ml，其疫苗效力的判断标准为管底有明显的凝集沉淀，呈伞状、块状或小片絮状物，直径0.10cm以上，或数量为50％以上的菌体被凝集，则判定为疫苗效力检测合格。

如按“所述检测试剂由含有大于或等于待测血清体积3倍的稀释剂和鸭疫里默氏杆菌抗原组成的鸭疫里默氏杆菌抗原稀释液，所述鸭疫里默氏杆菌抗原的菌体含量为2.00×10⁸CFU/mL，且所述鸭疫里默氏杆菌抗原的体积相当于待测血清与稀释剂体积之和的1倍”的原则扩大或缩小鸭疫里默氏杆菌抗原、待测血清和稀释剂的用量，由于反应原理不变，其判断结果为数量为50％以上的菌体被凝集，则判定为疫苗效力检测合格。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。