一种鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，该试检测剂盒包括SYBRPremixExTaqTM专用试剂10.0μl，浓度为10μmol/L的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8μl，其特征在于所述上游引物的核苷酸序列为：5， TGCTACAATGGCCGGTACAGAG 3，所述下游引物的核苷酸序列为：5，TTCACGAGGTCGAGTTGCAGAC 3，；检测方法通过致病菌提取、致病菌酶解、DNA粗提物制备、DNA粗提物纯化和检测；该检测试剂盒可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出早期的鰤鱼诺卡氏菌，灵敏度可以达到10-6μg/μl，在10-5μg/μl水平上基本能定量。

说明书

技术领域

本发明涉及鰤鱼诺卡氏菌的检测试剂，具体涉及一种鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）是一种近年发现的鱼类、贝类和甲壳类等动物的致病菌，该菌从感染、发病至死亡的延续流行时间长，感染性强，死亡率高，危害性大，平均发病率高达40%，平均死亡率达35%。我们在海水养殖的大黄鱼和淡水养殖的乌鳢中都发现了该病菌，由于该病菌宿于动物的内脏（肝、脾、肾、心等），主要症状为内脏出现白色结节，而早期体表无明显症状，给鱼病检测和防治带来了困难。因此，建立鰤鱼诺卡氏菌的检测技术，尤其是早期快速检测技术就显得尤为重要和迫切。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒，该检测试剂盒可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出早期的鰤鱼诺卡氏菌。本发明还提供了用该检测试剂盒检测鰤鱼诺卡氏菌的方法，为水产养殖致病菌检测、养殖环境监测、养殖饲料致病菌检测等均具有重要意义。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒，该试检测剂盒包括SYBR Premix Ex Taq^TM专用试剂（2×）（TaKaRa公司生产，购于宝生物工程有限公司）10.0 μl，浓度为10μmol/L的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8 μl，所述上游引物的核苷酸序列为：5^， TGCTACAATGGCCGG TACAGAG 3^，，所述下游引物的核苷酸序列为：5^，TTCACGAGGT CGAGTTGCAG AC 3^，。上下游引物根据登录号为AB060282的鰤鱼诺卡氏菌16S–23S rRNA基因内转录间隔序列为模板，该序列大小为1359 bp ，用引物探测软件primer explorer设计了上述一对特异性较高的鰤鱼诺卡氏菌引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

用鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒检测该致病菌的方法，包括下述步骤：

1）致病菌提取：将动物内脏研磨成组织液，取1.5 ml组织液置于微量离心管中， 在室温下6000 rpm离心2 min，弃上清液，在沉淀中加无菌水至半管，在室温下6000 rpm离心5 min，弃上清液，再在沉淀中加无菌水至半管，在室温下6000 rpm离心5 min，弃上清液，然后在沉淀中加TE Buffer溶液至半管，在室温下6000 rpm离心5 min，弃上清液，得到致病菌提取物，所述TE Buffer溶液的pH8.0；所述TE Buffer溶液购于上海生工生物工程有限公司，也可以由浓度为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液 (Tris-HCl )与浓度为1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA) 自配成pH8.0的TE Buffer溶液；

2）致病菌酶解：在上述致病菌提取物加入所述TE Buffer溶液450 μl和浓度为50mg/ml的溶菌酶20 μl，置于37°C水浴中酶解24 h，然后加入质量百分浓度为20%的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液25 μl，置于56°C水浴中酶解30 min，再加入浓度为20 mg/ml的蛋白酶K溶液5 μl，置于37 °C水浴中酶解1 h，加入500 μl饱和酚，轻轻上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心15 min，弃沉淀得到致病菌酶解液；酶解的目的是：菌体破壁，释放DNA，溶菌酶可以裂解细胞壁，蛋白酶K可以降解蛋白质；溶菌酶和蛋白酶K购于上海生工生物工程有限公司； 

3）DNA粗提物制备：将上述致病菌酶解液置于第一微量离心管中，加入与致病菌酶解液等体积的第一有机溶液，所述第一有机溶液由酚、氯仿和异戊醇按体积比25：24：1配置得到，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第一上清液，将第一上清液置于第二微量离心管中，加入与所述第一上清液等体积的第二有机溶液，所述第二有机溶液由氯仿、异戊醇按体积比24：1配置得到，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第二上清液，将第二上清液置于第三微量离心管中，加入浓度为3mol/L的醋酸钠（NaAC）溶液，所述醋酸钠溶液与所述第二上清液的体积比1：10，再加入所述第二上清液二倍体积的-20°C无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后用离心机以10000 rpm离心10 min，弃上清液，得到DNA沉淀，在DNA沉淀中加入质量百分浓度为70%的乙醇至半管，用冷冻离心机在4°C下以12000 rpm离心洗涤2 min，弃上清液，再同样加70%的乙醇离心洗涤一次，然后将DNA沉淀在室温下挥干乙醇，得到DNA粗提物；这样通过三级粗提可以去除蛋白质等杂质；

4）DNA粗提物纯化：在上述DNA粗提物中加入所述TE Buffer溶液400μl和浓度为10 mg/ml的RNA酶溶液5μl，37 °C下温育1 h，得到粗提物酶解液，再加入与粗提物酶解液等体积的所述第一有机溶液，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第一DNA上清液，将第一DNA上清液置于离心管中，加入与第一DNA上清液等体积的所述第二有机溶液，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第二DNA上清液，将第二DNA上清液置于另一离心管中，加入浓度为3mol/L的醋酸钠溶液，所述醋酸钠溶液与所述第二DNA上清液的体积比1：10，再加入所述第二DNA上清液二倍体积的-20°C无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后用离心机以10000 rpm离心10 min，弃上清液，得到DNA纯化物，加入所述TE Buffer溶液50 μl溶解 DNA纯化物，得到模板DNA溶液，置于-20°C保存备用； RNA酶购于上海生工生物工程有限公司，RNA酶可以降解DNA粗提物中的RNA：

5）检测：取上述模板DNA溶液1 μl，加入到所述的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒中，用灭菌去离子水定量至20μL，在Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪上扩增反应进行检测，扩增反应条件为第一步：预变性95°C，1 min ，1 Cycle；第二步：PCR反应，变性 95°C，5 sec、退火 60°C，20 sec、延伸 72°C，20 sec共40循环（Cycle）；第三步：95°C，15 sec、 60°C，30 sec、95°C，15 sec，PCR反应结束，得到扩增曲线图和熔解曲线图及Ct值，与已建立的鰤鱼诺卡氏菌DNA的 PCR反应的扩增曲线和熔解曲线比较相似性，判别是否含有鰤鱼诺卡氏菌，又根据检测出的Ct值代入已建立鰤鱼诺卡氏菌DNA的标准曲线，计算出的DNA含量。

与现有技术相比，本发明的优点在于一种鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括SYBR Premix Ex Taq^TM专用试剂10.0 μl，浓度为10μM的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8 μl，上游引物的核苷酸序列为：5^， TGCTACAATG GCCGGTACAG AG 3^，，下游引物的核苷酸序列为：5^，TTCACGAGGT CGAGTTGCAG AC 3^，；检测方法通过致病菌提取、致病菌酶解、DNA粗提物制备、DNA粗提物纯化和检测；该检测试剂盒可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出早期的鰤鱼诺卡氏菌，灵敏度可以达到10^-6 μg/μl，在10^-5 μg/μl水平上基本能定量；并可以应用于多种样品的检测，如检测水产养殖动物是否感染鰤鱼诺卡氏菌，监测养殖水体环境中鰤鱼诺卡氏菌含量，检测养殖饲料和鲜活饵料是否遭受鰤鱼诺卡氏菌污染等。该检测试剂盒及检测方法对水产养殖动物病害的发现和防治、无公害水产品生产及养殖饲料和鲜活饵料质量安全均具有重要意义，可为其它养殖动物病原菌早期检测提供借鉴模式，具有广泛的适用性。

附图说明

图1为鰤鱼诺卡氏菌DNA的荧光定量PCR检测的扩增曲线的示意图；

图2为鰤鱼诺卡氏菌DNA的荧光定量PCR检测的熔解曲线的示意图；

图3为鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测的标准曲线图；

图4为实施例7、8、9、10、11、12和13的扩增曲线图；

图5为实施例7、8、9、10、11、12和13的熔解曲线图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒：包括SYBR Premix Ex Taq^TM（2×）专用试剂10.0 μl，浓度为10μM的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8 μl，上游引物的核苷酸序列为：5^， TGCTACAATG GCCGGTACAG AG 3^，，下游引物的核苷酸序列为：5^，TTCACGAGGT CGAGTTGCAG AC 3^，，上下游引物根据鰤鱼诺卡氏菌16S–23S rRNA基因内转录间隔序列设计，由上海生工生物工程有限公司合成。

标准鰤鱼诺卡氏菌模板DNA制备：将培养的鰤鱼诺卡氏菌菌悬液1.5ml置于微量离心管中6000 rpm离心5 min，弃去上清液，得到的沉淀溶于450 μl TE Buffer溶液中，加入浓度为50 mg/ml的溶菌酶20 μl，置于37°C水浴中酶解24 h，然后加入质量百分浓度为20%的SDS溶液25 μl，置于56°C水浴中酶解30 min，再加入浓度为20 mg/ml的蛋白酶K溶液5 μl，置于37 °C水浴中酶解1 h，加入500 μl饱和酚，轻轻上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心15 min，弃沉淀得到鰤鱼诺卡氏菌酶解液；将鰤鱼诺卡氏菌酶解液置于第一微量离心管中，加入与鰤鱼诺卡氏菌酶解液等体积的第一有机溶液，第一有机溶液由酚、氯仿和异戊醇按体积比25：24：1配置得到，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第一上清液，将第一上清液置于第二微量离心管中，加入与第一上清液等体积的第二有机溶液，第二有机溶液由氯仿、异戊醇按体积比24：1配置得到，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第二上清液，将第二上清液置于第三微量离心管中，加入摩尔浓度为3mol/L的 NaAC溶液，NaAC溶液的加入体积为第二上清液体积的1/10，再加入第二上清液二倍体积的-20°C的无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后用离心机以10000 rpm离心10 min，弃第三上清液，得到DNA沉淀，DNA沉淀中加入质量百分浓度为70%的乙醇至半管，用冷冻离心机在4°C下以12000 rpm离心洗涤2 min，弃上清液，再同样加70%的乙醇离心洗涤一次，然后将DNA沉淀在室温下挥干乙醇，得到鰤鱼诺卡氏菌DNA粗提物；将鰤鱼诺卡氏菌DNA粗提物溶于400 μl TE Buffer溶液中，加入浓度为10 mg/ml的RNA酶溶液5 μl，37 °C下温育1 h，得到DNA酶解液，加入与DNA酶解液等体积的第一有机溶液，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第一DNA上清液，将第一DNA上清液置于离心管中，加入与第一DNA上清液等体积的第二有机溶液，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第二DNA上清液，将第二DNA上清液置于另一离心管中，加入摩尔浓度为3mol/L的 NaAC溶液，NaAC溶液的加入体积为第二DNA上清液体积的1/10，再加入第二DNA上清液二倍体积的-20°C无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后用离心机以10000 rpm离心10 min，弃上清液，得到DNA纯化物， DNA纯化物溶于TE Buffer溶液，配成浓度为10^-1 μg/μl鰤鱼诺卡氏菌DNA模板标准溶液，置于-20°C保存备用。

荧光定量PCR检测：取上述鰤鱼诺卡氏菌DNA模板溶液1μl，加入到上述鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒中，用灭菌去离子水定量至20μL，在Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪上扩增反应进行检测，扩增反应条件为第一步：预变性95°C，1 min ，1 Cycle；第二步：PCR反应，变性 95°C，5 sec、退火 60°C，20 sec、延伸 72°C，20 sec共40 Cycle；第三步：95°C，15 sec、 60°C，30 sec、95°C，15 sec，PCR反应结束，从荧光定量PCR仪上可以得到如图1所示的扩增曲线的示意图和图2所示的熔解曲线的示意图，为已建立的鰤鱼诺卡氏菌DNA的荧光定量PCR检测的标准扩增曲线和熔解曲线。

实施例2

与实施例1基本相同，所不同的只是鰤鱼诺卡氏菌DNA模板标准溶液浓度为10^-2 μg/μl，扩增曲线和熔解曲线与实施例1基本相同。

实施例3

与实施例1基本相同，所不同的只是鰤鱼诺卡氏菌DNA模板标准溶液浓度为10^-3μg/μl，

扩增曲线和熔解曲线与实施例1基本相同。

实施例4

与实施例1基本相同，所不同的只是鰤鱼诺卡氏菌DNA模板标准溶液浓度为10^-4μg/μl，

扩增曲线和熔解曲线与实施例1基本相同。

实施例5

与实施例1基本相同，所不同的只是鰤鱼诺卡氏菌DNA模板标准溶液浓度为10^-5μg/μl，

扩增曲线和熔解曲线与实施例1基本相同。

实施例6

与实施例1基本相同，所不同的只是鰤鱼诺卡氏菌DNA模板标准溶液浓度为10^-6μg/μl；

本实施例具有与图1和图2基本相似的扩增曲线和熔解曲线，说明本发明的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏度可以达到在10^-6 μg/μl，对10^-6 μg/μl量可以定性。

根据实施例1、2、3、4、5的Ct值，以Ct值为横坐标，鰤鱼诺卡氏菌DNA模板溶液浓度的log值为纵坐标，得出如图3所示的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测的标准曲线图，其中实施例 1的Ct值为14.42、实施例 2的Ct值为17.25、实施例3的Ct值为21.23、实施例 4的Ct值为24.54、实施例 5的Ct值为28.19，回归方程为y = 0.2865x -6.0531，回归直线决定系数R² = 0.998，说明本发明的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒的对浓度为10^-5 μg/μl及以上可以定量检测；上述鰤鱼诺卡氏菌DNA模板标准溶液浓度为10^-1 μg/μl 、10^-2 μg/μl、10^-3 μg/μl、10^-4 μg/μl、10^-5 μg/μl，相当于DNA含量为10² ng、10 ng 、10⁰ ng 、10^-1 ng、10^-2 ng。

实施例7

1、致病菌提取：将乌鳢鱼1的内脏研磨成组织液，取1.5 ml组织液置于微量离心管中，在室温下6000 rpm离心2 min，沉淀中加无菌水至半管，在室温下6000 rpm离心5 min，沉淀中再加无菌水至半管，在室温下6000 rpm离心5 min，然后在沉淀中加TE Buffer溶液至半管，在室温下6000 rpm离心5 min，弃去上清液，得到致病菌提取物； 

2）致病菌酶解：将上述致病菌提取物溶于450 μl TE Buffer溶液中，加入50 mg/ml的溶菌酶20 μl，置于37°C水浴中酶解24 h，然后加入质量百分浓度为20%的SDS溶液25 μl，置于56°C水浴中酶解30 min，再加入浓度为20 mg/ml的蛋白酶K溶液5 μl，置于37 °C水浴中酶解1 h，加入500 μl饱和酚，轻轻上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心15 min，弃沉淀得到致病菌酶解液； 

3）DNA粗提物制备：将上述致病菌酶解液置于第一微量离心管中，加入与致病菌酶解液等

体积的第一有机溶液，第一有机溶液由酚、氯仿和异戊醇按体积比25：24：1配置得到，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第一上清液，将第一上清液置于第二微量离心管中，加入与第一上清液等体积的第二有机溶液，第二有机溶液由氯仿、异戊醇按体积比24：1配置得到，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第二上清液，将第二上清液置于第三微量离心管中，加入浓度为3mol/L的 NaAC溶液，NaAC溶液的加入体积为第二上清液体积的1/10，再加入第二上清液二倍体积的-20°C无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后用离心机以10000 rpm离心10 min，弃第三上清液，得到DNA沉淀，DNA沉淀中加入质量百分浓度为70%的乙醇至半管，用冷冻离心机在4°C下以12000 rpm离心洗涤2 min，弃上清液，再同样加70%的乙醇离心洗涤一次，然后将DNA沉淀在室温下挥干乙醇，得到DNA粗提物； 

4）DNA粗提物纯化：将上述DNA粗提物溶于400μl TE Buffer溶液中，加入浓度为10 mg/ml的RNA酶溶液5 μl，37 °C下温育1 h，得到粗提物酶解液，加入与粗提物酶解液等体积的第一有机溶液，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第一DNA上清液，将第一DNA上清液置于离心管中，加入与第一DNA上清液等体积的第二有机溶液，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000 rpm离心10 min，得到第二DNA上清液，将第二DNA上清液置于另一离心管中，加入摩尔浓度为3mol/L的 NaAC溶液，NaAC溶液的加入体积为第二DNA上清液体积的1/10，再加入第二DNA上清液二倍体积的-20°C无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后用离心机以10000 rpm离心10 min，弃上清液，得到DNA纯化物，DNA纯化物用50 μl TE Buffer溶液溶解，即为模板DNA，置于-20°C保存备用； 

5）检测：取上述模板DNA1 μl，加入到本发明的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒中，用灭菌去离子水定量至20μL，在Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪上扩增反应进行检测，扩增反应条件为第一步：预变性95°C，1 min ，1 Cycle；第二步：PCR反应，变性 95°C，5 sec、退火 60°C，20 sec、延伸 72°C，20 sec共40 Cycle；第三步：95°C，15 sec、 60°C，30 sec、95°C，15 sec，PCR反应结束，得到如图4和图5所示的扩增曲线图和熔解曲线图及Ct值为14.46，其与已建立的鰤鱼诺卡氏菌DNA的 PCR反应的扩增曲线和熔解曲线基本相同，说明该乌鳢鱼宿有鰤鱼诺卡氏菌，又根据检测出的Ct值代入已建立鰤鱼诺卡氏菌DNA的标准曲线，得出DNA含量为0.813×10^-2μg。

实施例8

与实施例7基本相同，所不同的只是乌鳢鱼2的内脏，该乌鳢鱼2的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量

PCR检测试剂盒检测得到的Ct值为13.84，得出的DNA含量为1.224×10^-2μg。

实施例9

与实施例7基本相同，所不同的只是乌鳢鱼3的内脏，该乌鳢鱼3的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量

PCR检测试剂盒检测得到的Ct值为15.05，得出的DNA含量为0.551×10^-2μg。

 实施例10

与实施例7基本相同，所不同的只是乌鳢鱼4的内脏，该乌鳢鱼4的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量

PCR检测试剂盒检测得到的Ct值为16.58，得出DNA含量为0.201×10^-2μg。

实施例11

与实施例7基本相同，所不同的只是乌鳢鱼5的内脏，该乌鳢鱼5的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量

PCR检测试剂盒检测得到的Ct值为13.88，得出DNA含量为1.19×10^-2μg。

实施例12

与实施例7基本相同，所不同的只是大黄鱼1的内脏，该大黄鱼1的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量

PCR检测试剂盒检测得到的Ct值为14.61，得出DNA含量为0.737×10^-2μg。

实施例13

与实施例7基本相同，所不同的只是大黄鱼2的内脏，该大黄鱼2的鰤鱼诺卡氏菌荧光定量

PCR检测试剂盒检测得到的Ct值为17.82，得出DNA含量为0.886×10^-3μg。

从图4和图5中可以看出，实施例7、8、9、10、11的乌鳢鱼和12、13的大黄鱼的扩增曲线和熔解曲线都与已建立的 图1的扩增曲线的示意图和图2的熔解曲线的示意图基本相似，因此说明实施例7、8、9、10、11的乌鳢鱼和12、13的大黄鱼宿有鰤鱼诺卡氏菌。

本发明的检测试剂盒和检测方法，也可以用于贝类和甲壳类等水产动物的鰤鱼诺卡氏致病菌的检测，也可以用于检测养殖饲料和鲜活饵料是否遭受鰤鱼诺卡氏菌污染，监测养殖水体环境中鰤鱼诺卡氏菌含量等，在此不一一列举。

<110>宁波大学

 

<120>一种鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

<160>2

<170>PatentInversion3.1

 

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

 

<400>1

5^， TGCTACAATG GCCGGTACAG AG 3^，   22

 

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

 

<400>2

5^，TTCACGAGGT CGAGTTGCAG AC 3^，   22