一种犊牛体外胚胎培养液

摘要

本发明提供一种犊牛体外胚胎培养液，所述培养液中含有半胱胺。利用本发明提供的早期胚胎体外发育培养液对犊牛体外胚胎进行培养，可以获得较高的囊胚发育率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养液，具体地说，涉及一种犊牛体外胚胎培养液。

背景技术

和多数哺乳动物一样，牛的卵泡发生于胎儿时期，在怀孕后期胎儿和出生后几天的幼牛卵巢上都可以检测到有腔卵泡的存在，2月龄时数目达到50个左右，明显高于成年母牛。因此，充分利用犊牛卵母细胞生产效率高于成年母牛数倍这一生理特点，发挥良种犊牛最大遗传潜力成为奶牛繁殖新技术领域中研究的热点之一。

以犊牛为供体不仅可为胚胎体外生产提供大量的卵母细胞资源，满足卵母细胞冷冻、胚胎分割、克隆和转基因等科研、生产的需求；而且还可以显著缩短世代间隔，加快育种进程；充分发掘优良遗传性状母牛的繁殖潜能；加快优良牛群的扩群速度。若结合性控精液进行研究，还可进一步加快育种进展，提高牛群的遗传改良速度与生产效率，为奶牛育种提供丰富的遗传资源。

目前，影响犊牛体外胚胎生产技术的因素主要包括：激素超排处理方法、体外培养体系、犊牛月龄、犊牛个体差异。其中体外培养体系是影响犊牛体外胚胎生产技术的重要因素。

Revel等对3月龄犊牛卵母细胞的体外成熟、体外受精和体外培养进行了研究，结果发现，受精率和卵裂率与成年牛差异不显著，但是，体外培养7d后囊胚率显著低于成年牛，同样妊娠率也显著低于成年牛，这说明犊牛卵母细胞中控制囊胚形成的一些关键因子可能尚未完全出现或表达。有学者指出，这可能是因为犊牛卵母细胞胞质存在缺陷造成的。

谷胱甘肽(GSH)作为细胞内一种主要的自由硫醇基团，在细胞增殖、氨基酸运输、蛋白质和DNA的合成、硫化物和其它化学物质分解以及保护细胞对抗氧化过程中具有重要的生物学功能。谷胱甘肽在卵母细胞成熟的过程中大量合成积累，成熟后胚胎不再具有合成谷胱甘肽的能力。成熟过程中卵母细胞内GSH水平的升高为下一步的受精以及胚胎分裂提供更加适宜的细胞内环境，在体外成熟体系中添加半胱胺，β-巯基乙醇，半胱氨酸，胱氨酸都能刺激牛卵母细胞合成GSH，但是只发现半胱胺能够增强胚胎的发育能力。

半胱胺(Cysteamine，NH₂CH₂CH₂SH，相对分子量为77.15)，又称β一巯基乙胺(简称CS)，相当于半胱氨酸的脱羧产物，是辅酶A分子的组成成分及动物体内的生物活性物质，在体内具有重要的生理作用。

在体外培养液中添加含有硫醇基团的半胱胺能够增强卵母细胞对半胱氨酸的吸收，促进GSH的合成，增强卵母细胞对抗活性氧的能力，促进卵母细胞胞质的成熟。因此，在体外成熟液中添加半胱胺能够提高卵裂率和囊胚率。但是半胱胺的添加要适量，否则会降低囊胚发育率。

发明内容

本发明的目的是提供一种犊牛体外胚胎培养液。

为了实现本发明目的，本发明的一种犊牛体外胚胎培养液，所述培养液中含有半胱胺。其中，半胱胺的含量为50μM-100μM，优选的半胱胺含量为100μM。

前述的成熟培养液中还包括：TCM199+10mM HEPES+5％FBS+0.5μg/ml FSH+5μg/ml LH+1μg/ml E₂+27.5μg/ml丙酮酸钠+100IU/ml青链霉素。

生产前述犊牛体外胚胎的方法包括高效的卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养技术等。具体方法为：

1)犊牛激素超排：选用9-12周龄犊牛，经阴道埋植羊用CIDR，分别在第5d和第6d注射FSH，第7d手术法采卵，利用9号针头采集卵巢上直径为3～6mm的卵泡液。

2)犊牛卵母细胞体外成熟：将步骤1)中得到的卵母细胞加入到成熟培养液中，在38.5℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下培养22-24h。

3)将得到的犊牛成熟卵母细胞进行体外受精。

4)受精卵在体外发育成胚胎。

前述的方法，步骤1)中在第5d注射FSH，剂量为40mg-45mg，间隔12h注射30mg-35mg，第6d注射FSH，剂量为30mg-35mg，间隔12h再注射30mg-35mg。

前述的方法，步骤2)中成熟培养液的成分：TCM199+10mMHEPES+5％FBS+0.5μg/ml FSH+5μg/ml LH+1μg/ml E₂+27.5μg/ml丙酮酸钠+100IU/ml青链霉素+100μM半胱胺。

前述的方法，步骤3)中受精时间为8h。

前述的方法，步骤4)包括：在38.5℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下，将受精卵置于前期发育培养液中培养2d，卵裂后移入后期发育培养液中继续培养，间隔2d半量换液一次，胚胎发育第7d、8d统计囊胚数量；

其中，所述CR I aa液：114.7mM NaCl+3.1mM KCl+26.2mMNaHCO₃+10μg/ml苯酚红+1mM谷氨酸+0.4mM丙酮酸钠+5.5mM半乳酸钙+2％EAA+1％NEAA+141mM MgCl₂6H₂O+100IU/ml青链霉素，前期发育培养液为：CR I aa液+6mg/ml BSA，后期发育培养液的成分为：CR I aa液+10％FBS。

本发明采用含有半胱胺的体外成熟培养液对犊牛卵母细胞进行培养，可以获得较高的囊胚发育率。

本发明的优点在于：

(1)本发明建立了犊牛优质体外胚胎生产的技术规程，包括高效的卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养技术等。犊牛卵母细胞的体外成熟率分别达到85％，体外受精率达80％，囊胚发育率达到35％。

(2)本发明采用含有半胱胺的体外成熟培养液对卵母细胞进行培养，可以获得较高的囊胚发育率。

附图说明

图1为本发明较佳实施例犊牛经激素超排后获得的卵母细胞，经体外成熟后的成熟卵母细胞。(显微镜下观察结果)

图2为本发明较佳实施例犊牛经激素超排后获得的卵母细胞，经体外受精后，发育后获得的囊胚。(显微镜下观察结果)

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中胚胎体外生产的常规操作采用本领域技术人员熟知的方法和技术进行。实施例中的犊牛来自于北京奶牛中心良种场的荷斯坦母犊牛。

实施例1    犊牛激素超排及采卵

犊牛超排处理当天用送栓器经阴道埋植羊用CIDR(羊用，产地新西兰)，分别在第5d(40mg、30mg)、6d(30mg、30mg)间隔12h注射FSH(FSH，商品名为Folltronpin-V，购自加拿大Bioniche AnimalHealth公司)，第7d采卵，同时撤栓。

每次犊牛超排头均获得的可用卵母细胞数为48枚。

实施例2    犊牛卵母细胞体外成熟

体外成熟操作前2h在6孔圆锥型培养板的每孔中放入适量成熟培养液(平均每枚卵母细胞10μl成熟培养液)，上覆盖矿物油，放入38.5℃的培养箱中预平衡。其中，成熟培养液的成分为：TCM199+10mMHEPES+5％FBS+0.5μg/ml FSH+5μg/ml LH+1μg/ml E₂+27.5μg/ml丙酮酸钠+100IU/ml青链霉素+100μM半胱胺。

将经过鉴定可用的卵母细胞放到预热的成熟培养液中，轻轻洗涤4遍后，移入预先在培养箱平衡2h的6孔圆锥型培养板的成熟液中，放入恒温培养箱中培养22h-24h。培养条件为38.5℃，5％CO₂，饱和湿度。图1所示为本发明犊牛经激素超排后获得的卵母细胞，经体外成熟后的成熟卵母细胞在显微镜下观察到的结果。

实施例3    犊牛卵母细胞体外受精

首先将成熟的卵母细胞在受精液(114.0mM NaCl+4.02mM KCl+2.25mM CaCl₂.2H₂O+0.52mM MgCl₂6H₂O+0.83mM NaH₂PO₄H₂O+37.0mM NaHCO₃+13.9mM葡萄糖+0.5mM丙酮酸钠+3mg/mlBSA+10μg/ml苯酚红+100IU/ml青链霉素+10μg/ml肝素)中清洗2-3次，之后放入预平衡2h的受精液中(每50ul受精液中放入15枚卵母细胞)。

取细管(0.25ml)冻精(精液来源于北京奶牛中心种公牛冷冻精液)，置37℃水浴中停留约10s，直至有气泡上浮时即可取出，用面巾纸擦干，并用酒精棉球消毒细管。将平衡后的离心管(内含洗精液：114.0mM NaCl+4.02mM KCl+2.25mM CaCl₂.2H₂O+0.52mM MgCl₂6H₂O+0.83mM NaH₂PO₄H₂O+37.0mM NaHCO₃+13.9mM葡萄糖+0.5mM丙酮酸钠+3mg/ml BSA+10μg/ml苯酚红+100IU/ml青链霉素+10mM咖啡因)从恒温培养箱中取出，将精液细管一端剪掉，插入离心管中再剪掉另一端直至精液全部进入离心管，轻轻转动离心管混匀。以300g-400g离心5min。用移液管吸去上清液，管中留0.5ml左右即可，用手搓2～3次以使液体均匀。加入离心管中的洗精液至总体积为6ml，再用同样的方法离心一次，最后留0.5ml液体，用手搓两次使其均匀，加适量洗精液使精子的浓度为5×10⁶/ml～1×10⁷/ml。

实施例4    犊牛卵母细胞体外发育

将受精后的卵子洗涤4次，吸卵管口径应与卵子直径大小接近，洗掉透明带上粘着的精子即可，不要将卵丘细胞全部洗掉，留2-3层即可。将洗涤干净的卵子首先在500μl前期发育培养液(114.7mMNaCl+3.1mM KCl+26.2mM NaHCO₃+10μg/ml苯酚红+1mM谷氨酸+0.4mM丙酮酸钠+5.5mM半乳酸钙+2％EAA+1％NEAA+141mMMgCl₂6H₂O+100IU/ml青链霉素+6mg/ml BSA)中培养2d，统计卵裂后转移至500μl后期发育培养液(CR I aa液+10％FBS)中继续培养，间隔2d半量换液一次。胚胎发育第7d、8d统计囊胚数量。胚胎培养条件为38.5℃，5％CO₂，饱和湿度。图2所示为本发明犊牛经激素超排后获得的卵母细胞，经体外受精后，发育获得的囊胚在显微镜下观察到的结果。

结果表明，犊牛卵母细胞的体外成熟率分别达到85％，体外受精率达80％，囊胚发育率达到35％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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