一种防治水稻稻瘟病和纹枯病的芽胞杆菌菌株

摘要

本发明公开了一种从桂花果实中分离得到的对水稻纹枯病和稻瘟病病原菌具有拮抗作用的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)XZJ.BP01。该菌株已于2009年10月27日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M209235。本发明菌株XZJ.BP01能拮抗水稻稻瘟病和纹枯病病原菌，且其次生代谢产物对纹枯病菌的抑菌率达99％以上；同时，在稻瘟病田间试验中，经涂抹该菌发酵液后的水稻感病指数为16.7％，而对照水稻的感病指数却高达67.8％，由此可见，本发明菌株对于解决水稻两大病害问题具有十分重要的作用，且效果明显。

说明书

技术领域

本发明涉及一种芽胞杆菌菌属的菌株，尤其是一种从桂花果实中分离得到的对水稻稻瘟病及纹枯病病原菌具有强烈拮抗作用的短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)菌属的菌株XZJ.BP01，该菌株在PDA培养基中、30℃培养条件下产生的次生代谢产物对水稻的纹枯病、稻瘟病也具有极强的拮抗作用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物之一。但是，随着经济的迅速发展，人口的逐步增加和耕地面积的急剧减少，加上病虫害的袭击，水稻生产正面临着越来越大的压力。水稻稻瘟病(Pyricularia)和纹枯病(Thanatephorus cucumeris)是我国稻区危害最大的两大病害。稻瘟病分布十分广泛，全球80余个国家和地区均有发生，一般流行年份可造成10％～20％的减产，严重发生时其损失可达40％～50％。90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380万公顷以上，每年损失稻谷达数亿公斤。因病害发生时期和部位的不同，稻瘟病即表现为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟等症状。纹枯病病原菌腐生能力强，寄主范围广。随着水稻优质品种的推广和高肥密植技术的应用，该病危害日趋严重，每年都会给水稻生产造成一定损失，直接威胁水稻的高产稳产。因此，目前人们在水稻育种选育过程中，除了考虑水稻产量和品质外，水稻品种的稻瘟病和纹枯病抗性也被作为一项重要的育种指标。到目前为止在水稻稻瘟病和纹枯病抗性筛选育种过程中，虽然人们付出了大量心血，也取得了一定的成果，但是，结果还不是很理想。至今还没有发现对稻瘟病和纹枯病都具有高抗的水稻品种。稻瘟病的生理小种变化极快，一般一个抗性品种在生产上只能维持2-5年，这给育种带来了极大困难；而纹枯病目前在实际生产中仍然没有抗性品种，人们主要用井岗霉素防治纹枯病，也没有发现比较理想的其它可替代的抗生素。在生产上，目前稻瘟病防治主要使用三环唑类药物。由于三环唑类属于化学合成药物，其施用在短期内虽然效果较好，但如果长期大面积连续使用类似化学药剂，会严重污染环境，也会导致病原菌抗、耐药性大幅度增加。长此以往，会对整个农业的稳定性，以及人类的健康产生严重威胁。因此，探索发现对以上病原菌具有良好防治效果、自然环境中可以降解、对人体无害的抗菌物质，显得尤为迫切和重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从桂花果实中分离得到的短小芽胞杆菌XZJ.BP01菌株。该菌株在PDA等培养基中、28-30℃培养条件下产生的次生代谢产物对水稻纹枯病、稻瘟病具有较强的防治作用。

本发明的具体技术方案如下：

本发明中的短小芽胞杆菌XZJ.BP01菌株已于2009年10月27日在“中国典型培养物保藏中心”进行保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 209235。

本发明的菌株XZJ.BP01具有下述性质：

1、形态特征：

在PDA或NA培养基上生长，菌落圆形，边缘整齐。革兰氏染色后光学显微镜结果为：革兰氏阳性，具芽孢。在PDA培养基上28℃培养3天，电镜观察结果为：无鞭毛、杆状，且大小为0.5-0.7μm×1.1-2.4μm。

2、生理、生化特征(见下表)：

3、菌种鉴定结果

在形态学方面，菌株XZJ.BP01表现为短小芽孢杆菌。部分生理生化测定结果与标准的短小芽孢杆菌生理生化特征有差异。例如该菌株马尿酸实验呈阴性。经过16s rRNA测序比对，我们发现菌株XZJ.BP01与短小芽孢杆菌序列相似性达99％，认定其为短小芽孢杆菌类的新菌株。

本发明菌株XZJ.BP01对水稻纹枯病和稻瘟病病原菌均具有拮抗作用。同时该菌株XZJ.BP01的次生代谢产物对纹枯病病原菌的生长具有强烈抑制效果，对纹枯病病原菌的抑菌率达99％以上。在田间稻瘟病防治试验中，喷有该菌株XZJ.BP01次生代谢产物的水稻，其感病指数为16.7％，而对照感病指数为67.8％。说明该菌株XZJ.BP01次生代谢产物对稻瘟病具有很好的防除效果。

附图说明

图1为短小芽孢杆菌菌株XZJ.BP01的形态(包括A、B和C)

图2为短小芽孢杆菌菌株XZJ.BP01对水稻稻瘟病和纹枯病病原菌的拮抗作用(包括D和E)

图3为短小芽孢杆菌菌株XZJ.BP01对水稻纹枯病病原菌的致畸效应(包括F、G、H和I)

图4为短小芽孢杆菌菌株XZJ.BP01的次生代谢产物抑制水稻纹枯病病原菌的生长(包括J和K)

其中，A为菌株XZJ.BP01菌落形态特征，B为菌株XZJ.BP01革兰氏染色结果，C为菌株XZJ.BP01电镜形态观察，D为菌株XZJ.BP01对水稻稻瘟病病原菌的拮抗作用，E为菌株XZJ.BP01对水稻纹枯病病原菌的拮抗作用，F为水稻纹枯病菌正常菌丝，G为水稻纹枯病菌菌丝生长发生螺旋缠绕，且有明显的趋避拮抗菌的生长方向，H为水稻纹枯病菌菌丝尖端出现膨大现象，I为水稻纹枯病菌菌丝部分发生裂解，J为培养基中未加菌株XZJ.BP01的次生代谢产物时纹枯病菌生长情况，K为培养基中已加菌株XZJ.BP01的次生代谢产物时纹枯病菌生长情况。

具体实施方式

实施例1菌株XZJ.BP01筛选方法

70％乙醇对桂花果实进行消毒，灭菌水清洗3次。然后将果实粉碎离心，得到上清液，涂布于PDA固体培养基(马铃薯200克、蔗糖15克、琼脂18克、水1000毫升，pH7.0)，接种稻瘟及纹枯病原，置于28℃恒温培养箱中培养。筛选出抑制病原菌生长的菌株。经过划线培养方法分离出单克隆菌株。

实施例2拮抗菌抗生性研究

在装有PDA培养基的平皿内同时接种水稻纹枯病菌与菌株XZJ.BP01，接种菌饼直径均为1厘米。两菌饼距离5厘米。接种后置于28℃恒温培养箱中培养，6天后观察菌落形态。

将纹枯病菌和菌株XZJ.BP01用对峙法接种，挑取对峙边缘的纹枯病菌丝体和正常菌丝体于普通光学镜下观察和电镜扫描检测。

实施例3菌株的鉴定

A、形态特征：PDA培养基上28℃培养3天后，用扫描电子显微镜和光学显微镜进行常规的菌体形态观察。

B、生理生化实验：参照《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》的内容对菌株进行生理生化鉴定。

采用细菌通用引物P2F(5’-agccaggatcaaactctg-3’)，P5R(5’-aggaggtgatccagccgca-3’)对菌株XZJ.BP01的16rDNA进行扩增测序，用得到的16rDNA在NCBI上进行比对，与短小芽孢杆菌相似性达99％，基本判定其为短小芽孢杆菌。

实施例4菌株次生代谢产物抗生实验

菌株XZJ.BP01在PDB培养基中培养24h，然后将发酵液离心，过滤灭菌，取1ml与xx ml 50℃PDA充分混匀后，倒入直径6cm的灭菌培养皿。待培养基凝固后，将8mm直径的纹枯病原菌饼接于含有发酵液的培养基中心。同时，接8mm直径的纹枯病原菌饼接于含有PDB的培养基中心作为对照。对照除了将1ml发酵液换成1ml纯PDB，其他步骤均采用同样的方法。30℃下培养8天后观察结果。

水稻植株生长至一叶一芯时(10cm左右)，在植株叶片上涂抹菌株XZJ.BP01的发酵液，6小时后，喷施稻瘟病孢子，对照植株将菌株XZJ.BP01的发酵液改为未接种的液体培养基，其它条件不变。植株用塑料薄膜保温、保湿。待1周后检测感病情况。处理和对照各取50株，计算感病指数。