一种家蚕微粒子病荧光PCR检测方法及其试剂盒

摘要

本发明提供了一种使用荧光定量PCR技术(PCR-荧光探针法)从家蚕和蚕卵等样本中检测引起家蚕微粒子病(Pebrine)的病原微生物家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，N.b)的方法及其试剂盒。该方法包括：(1)采集样本；(2)家蚕微孢子虫DNA的提取；(3)荧光定量PCR扩增法对样本进行检测；(4)扩增反应结束后根据反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中家蚕微孢子虫的存在，并能对其进行准确定量，实现了对家蚕微孢子虫的实时快速检测。

说明书

一、技术领域

本发明涉及家蚕微粒子病(Pebrine)病原微生物家蚕微孢子虫(Nosemabombycis，N.b)的检测方法，特别是涉及使用荧光PCR方法对家蚕微孢子虫进行快速准确检测的方法，属于生物技术领域。本发明进一步涉及一种用于该病检测的试剂盒。

二、背景技术

家蚕微粒子病(Pebrine)是蚕业生产的毁灭性疫病，引起该病害的病原微生物为家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，简称N.b)。由于其特殊的经卵传染方式，对蚕业生产，尤其是蚕种生产造成严重危害且长期得不到根治。法国、意大利等欧洲主要养蚕国家曾因该病的暴发而导致蚕丝业蒙受重大损失，我国近几年每年因微粒子病而淘汰的各级原种达数百万张之多，直接经济损失达数亿元之巨。该病害的广泛流行不但给蚕种的生产造成严重的损失，而且极易导致丝茧育蚕茧质量的下降和蚕农的歉收，严重影响蚕丝产业链下游经济的发展，甚至给社会带来不稳定因素。鉴于此，家蚕微粒子病始终是蚕丝业国家蚕病防治和进出口检疫的难点和重点。

家蚕微粒子病的病原是蚕微孢子虫，属原生动物界微孢子虫门、微孢子虫纲、微孢子虫目、微孢子虫科、微孢子虫属。除了微孢子虫属，在家蚕体中还发现有变形孢子虫属(Vai.rimorpha Pilly，1976；佐藤令一和渡部仁，1985)具褶孢子虫属(Pfeis hora Gurley，1893；藤原公，1985)、泰罗汉孢子虫属(Thelohania hennegay，1892)(早坂昭二，1985)、内网虫属(Beenel&Kennedy，1988)以及与N.b同属异种(田中茂男等，1972；万国富等，1995)的微孢子虫等寄生。到目前为止，已发现上百种Nosema属的微孢子虫，它们大都是鳞翅目昆虫的典型寄生虫。据检查发现，包括家蚕在内的大多数昆虫种类至少都受到一种以上的微孢子虫寄生，且从昆虫的卵到成虫的每一阶段都可能被微孢子虫感染，微孢子虫可在蚕、蛹、蛾体内寄生，并能经蚕卵遗传给下一代。该病在全国各蚕区不同季节都有不同程度的发生，对种茧育和丝茧育都有影响，给农业生产带来巨大的损失。因此为了及早发现和剔除病蚕，有效避免该病的蔓延和传播，建立一种针对家蚕微粒子病病原也即家蚕微孢子虫的快速准确检测方法是非常必要的。

综观家蚕微孢子虫检测技术发展史，其采用了肉眼鉴定、显微镜检查、血清学检测和分子生物学检测等几种方法。1865～1870年，法国的Pasteur创立的通过母蛾镜检制造无毒蚕种的方法为家蚕微粒子病的防治奠定了基础，后来发展到集团袋蛾和集团磨蛾镜检。目前蚕业生产中一般采用光学显微镜(明视野，或位相差)的方法，对所检样本是否存在病原微孢子虫进行确认，该技术在大规模生产中为控制家蚕微粒子病的流行起到重要作用。但该技术存在一些缺陷，其一是速度和效率问题；其二是检测技术的特异性和灵敏度方面的问题；其三是无法区别和鉴定不同微孢子虫的种和属；其四是很难实现早期检测。血清学鉴别法具有特异性强、灵敏度高的特点，但是存在比较高的交叉反应与非特异性反应。

随着分子生物技术的发展，蚕微粒子病的分子生物学检测技术也开展探索研究。有学者曾用PCR技术，利用家蚕微孢子DNA的高度保守序列，设计引物，对蚕微孢子虫进行定性PCR检测；也有学者为了将家蚕微孢子虫(N.b)从蚕业生产中流行的多种病原微孢子虫中鉴定出来，用PCR技术合成了一段317bp的DNA片段，将其克隆到大肠杆菌E.coli DH5a中，并大量制备该片段，用地高辛(DIG)标记成特异性检测探针，用于蚕业生产上对带毒蚕蛾和蚕卵的模拟检测。该种方法是有一定的创新性，但这仅仅是一个尝试，尚有许多需要完善的地方。因此建立一种快速、特异、灵敏、简便、实用的家蚕微粒子病的检测方法，对提高家蚕微粒子病监控技术，加强检疫能力，保证进出口蚕种的安全，提升养蚕的产业水平非常迫切，具有十分重要的现实意义。

本发明的检测方法的依据是荧光定量PCR技术，它的原理是在常规PCR扩增系统中加入一段与靶基因特异性互补的荧光探针。探针的5′端标记有报告基团，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到荧光信号。当开始进行扩增时，随着PCR循环扩增的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针就会将探针切断产生荧光信号。在整个PCR过程中，就会连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。信号增强到某一阈值时的循环次数(用循环阈值Ct表示)被记录下来。Ct值和PCR体系中起始模板的对数之间有着严格的线性关系，利用阳性定量标准品扩增的Ct和标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可以确定出起始模板中某核酸的存在并对其进行定量。

利用上述原理，我们发明了一种用于家蚕微粒子病的病原微生物微孢子虫检测的荧光定量PCR方法，并研制了一种“家蚕微粒子病荧光定量PCR检测试剂盒”，实现了对蚕微孢子虫的快速准确检测的目的。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得微孢子虫检测的灵敏度和特异性得到很大程度的提高，并避免了漏检和误检。

三、发明内容

本发明提供了用于检测蚕微孢子虫(N.b)的方法，特别是提供了一种快速准确地检测家蚕和蚕卵等样本中微孢子虫的荧光定量PCR方法。本发明进一步提供了用于该类微孢子虫检测的试剂盒。

本发明具体步骤包括：(1)标本的选取(家蚕和蚕卵等样本)；(2)提取孢子虫DNA(孢子虫发芽及其DNA提取)；(3)荧光定量PCR扩增法对样本进行检测；(4)扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中家蚕微孢子虫的存在并根据阳性标准品对其标本中的微孢子虫进行定量。

从Genbank检索家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA(Nosema sp.smallsubunit ribosomal RNA，ssUrRNA)基因序列如下：

AGACCCAAATATCAAGTAATTTAGATAATAATGAAAACATTGTAGAACCAAAATATGAGTTCTCTAATTGCACAATTTTGAAATCTAGTGCCATCGTTGCTGGTTCAACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGATATAGGAAAGAAGAAAGGCCCAAGATCAAAACAGGTTGAAGAACTAGTCTTTACTTCTAACAAGTATGAACCCCTCATATAAGTTACATCCATAAGAATGCCCAACAAAGAACACGAATTTGTCTTTGATGCAAGTGGTTTTCTTGAAACTAGTTCTGTCATGAATGAGTTGATGCAGTACACAACGATTGCCCAATCGTGCGAATCAACGACGCTGGAAGATAAGACGAAIACACTTACCGTCTAGGTCACATCTCAACCACCAAGAAAATAAGCTATTCTTTTGTCGATGAAGAAGCAACATGATTTTATGATACCATCAAAGTAGTTAAAAATTCACCAGTAACATCTCCATCATTTTGCAGCATATATGGCTGAAGGTTTTGGTATGAAGAGAACATCTTTTCCACGTTCATACACATCTTAAATGTCACAAACCTTACCTAGTAAGCTCTTAAGACGAAACTTAAAGAGAAAGAIAAAAACGGAGACCACGTAGAATAAAAACTTTGCGTAAATGTTCAAAAAACTAGGTGGAGAGAATATTACTTACAAAGAATATTACAAGAATTTTCATCATCATTAAATGTAAGGATTCTTAATGTCAAGACCAAACATCGACGAAATGATTCGACAAATGATGGGTTGACTGTTCCCGTAAAGCCATCCATCGATAAGGACCAIATCTGAACAGT(SEQ ID NO.1)。

用生物信息学方法根据引物设计原则，并利用PRIMER EXPRESS设计软件，设计出扩增该基因片段的特异性引物和荧光探针：

上游引物：5’-AAGAATTTTCATCATCATT-3’(SEQ ID NO.2)；

下游引物：5’-TCATTTGTCGAATCATTTCGT-3’(SEQ ID NO.3)；

荧光探针：FAM-5’GGATTCTTAATGTCAAGACCAAAC3’-TAMRA(SEQ IDNO.4)。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的荧光探针标记是指检测家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA(Nosema sp.small subunit ribosomal RNA，ssUrRNA)基因的探针的报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA。

根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的分型检测方法首先采集标本，适用标本类型有家蚕和蚕卵等。

根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的检测方法，用检测上述标本中家蚕微孢子虫基因的PCR扩增体系按照如下方式配制，

5×FQ PCR buffer    6ul

上游引物(10uM)：    1ul

下游引物(10uM)：    1ul

荧光探针(10uM)：    0.5ul

dNTPS(10mM)         1ul

Taq酶               2ul

DNA                 4ul

ddH₂O               14.5ul

                                   

Total               30.0μl

根据本发明的一个优选实施方案，上述用于检测微孢子虫的反应体系中的5×FQ PCR buffer含以下成分：250mM Tris-HCl(pH8.0)、25mM MgCl2、250mMKCl以及10％的DMSO等。

根据本发明的一个优选实施方案，上述PCR扩增体系中：6ul 5×FQ PCRbuffer、1ul上游引物(10uM)、1ul下游引物(10uM)、0.5ul荧光探针(10uM)、1ul dNTPS(10mM)、14.5ul ddH₂O总计24ul，即为该体系的PCR MIX，可以批量配制，并同时配以扩增用的Taq酶系，可满足大量检测的需要。

本发明的另一个目的是提供一种用于快速检测蚕微孢子虫DNA的试剂盒，该试剂盒包括核酸提取液、Taq酶系、Nb-PCR MIX、Nb-阳性质控品(1×10⁷copies/ml)和阴性质控品等。其中本试剂盒的一个组成部分“核酸提取液”是用来提取标本中的微孢子虫的DNA，该提取液由25mM NaOH、50mMTris-HCl(PH8.0)、0.1％TritonX-100、0.05mM EDTA(PH8.0)组成。

根据本发明的一个优选实施方案，本试剂盒的的反应体系设置为30ul，具体配制方法是：上述PCR MIX24ul、Taq酶系2ul以及提取的DNA或者阳性质控品或者阴性质控品分别为4ul。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的阳性质控品是蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA(Nosema sp.small subunit ribosomal RNA，ssUr RNA)基因特异性扩增片段，经过克隆连接到载体上，构成的重组质粒，经过绝对定量，其浓度为10⁷copies/ml。ssUr RNA普通PCR的扩增结果见图1。对阳性质控品进行梯度稀释，其扩增的动力学曲线和标准曲线如图2和3。

根据本发明的一个优选实施方案，稀释阳性质控品(10⁷copies/ml)，浓度梯度为每ml1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹copies，进行灵敏度实验，结果证实本试剂盒检测灵敏度为：不低于1.0×10²copies/ml，该荧光定量PCR的方法敏感性和精确性均优于普通PCR方法。

为了完成本发明的方法，取上述标本加入适量生理盐水研磨，匀浆液用纱网过滤，收集滤液，以差速离心法(500rpm，离心2分钟，弃沉淀，然后上清液以5000rpm，10分钟离心)弃上清。用适量生理盐水悬浮，得到Nb孢子粗提液。取0.5ml(浓度为10⁸个/ml)微孢子虫悬浮液，5000rmp，离心5分钟，去上清，保留孢子，同时加入0.2mol/L KOH 0.25ml，充分混合，27℃诱导1小时后5000rpm，离心5分钟，去上清。用0.5ml生理盐水重悬，25℃放置30分钟。5000rpm，离心5分钟，沉淀加50μl核酸提取液充分混匀(提取液用前需室温溶解并充分混匀)，然后100℃沸水浴10分钟，13,000rpm离心3分钟，上清液即为提取的微孢子虫DNA。DNA短时间可于4℃保存，长时间于-20℃保存。

根据本发明的再一个优选实施方案，取上述配制的蚕微粒子病NB-PCR MIX反应液(内含有扩增用的引物探针和各种反应成分等)、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10秒。每个检测反应体系配制如下表：

  试剂  PCRMIX  Taq酶系  用量  24μl  2μl

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净0.2mlPCR扩增管中，充分混匀，10,000rpm离心10秒，向每个PCR反应管中分别加入26μl，然后分别加入处理后样品(提取的DNA)、阳性质控品和阴性质控品4μl，10,000rpm瞬时离心10秒。将反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阳性质控品、阴性质控品以及待检样本，并设置样品名称和荧光基团标记。

根据本发明的再一个优选实施方案，用于扩增的条件为：ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon等荧光定量PCR仪循环条件为：93℃2分钟，然后93℃30秒55℃45秒，采集荧光信号，40个循环。LightCycler等使用毛细管的仪器：循环条件为：93℃2分钟，然后93℃5秒，58℃45秒，检测荧光信号，共40个循环。反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品扩增反应的Ct值在40以上，Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为阳性；Ct值在35-40个循环之间为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在35-40个循环之间判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。判断结果时要注意以下问题：阴性质控品应全部为阴性；NB阳性质控品的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线。否则此次试验视为无效，全部试验应重新进行。

根据本发明的一个优选实施方案，用大量已知蚕微粒子病感染的阳性标本和未感染的阴性标本进行验证实验并进行测序验证，结果证实，本试剂盒特异性较好，吻合度为100％。

本发明的试剂盒经过多次不同的重复实验证实，具有良好的重复性和稳定性。在-20℃条件下试剂盒的有效期可以达12个月。

四、附图说明

图1显示常规PCR扩增特异性片段，2％的琼脂糖凝胶电泳，经PCR扩增后，其扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察，可看到与目的片段大小一致的电泳条带，从左到右依次是DNA分子量Marker(2000bp)、蚕微孢子小亚单位核糖体RNA的特异性扩增片段和阴性对照普通PCR的扩增的结果。图2显示阳性质控品扩增动力曲线，梯度稀释；图3为阳性质控品标准曲线。

五、具体实施方式

实施例1：标本采集

适用标本类型包括家蚕、蚕卵等样本。蚕，取疑似病蚕转至一5ml离心管，密闭送检。对于蚕卵或排泄物，需取疑似病蚕蚕卵或排泄物1g左右，转至一1.5ml离心管，密闭送检。

实施例2：蚕微孢子虫DNA的提取

取上述标本加适量生理盐水研磨，匀浆液用纱网过滤，收集滤液，以差速离心法(500rpm，离心2分钟，弃沉淀，然后上清液以5000rpm，10分钟离心)弃上清。用适量生理盐水悬浮，得到Nb孢子粗提液。取0.5ml(10⁸个/ml)微孢子虫悬浮液，5000rmp，离心5分钟，去上清，保留孢子，同时加入0.2mol/LKOH 0.25ml，充分混合，27℃诱导1小时后5000rpm，离心5分钟，去上清。用0.5ml生理盐水重悬，25℃放置30分钟。5000rpm，离心5分钟，沉淀加50μl核酸提取液充分混匀后100℃沸水浴10分钟，13,000rpm离心3分钟，上清液即为提取的微孢子虫DNA。

实施例3：蚕微孢子虫DNA的扩增检测

从试剂盒取出NB-PCR MIX和Taq酶系等室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10秒。每个测试反应体系配制如下，PCR MIX 24μl、Taq酶系2ul，放入洁净0.2mlPCR管中，充分混匀，10,000rpm离心10秒。向设定的PCR反应管中分别加入处理后样品(提取的DNA)或阳性质控品或阴性质控品4μl，10,000rpm瞬时离心10秒。

将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称、荧光基团种类(报告基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA)和扩增条件：ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon等仪器扩增条件为93℃→2分钟，后93℃30秒→55℃45秒，40个循环。LightCycler等使用毛细管的仪器扩增条件为93℃→2分钟，后93℃5秒→58℃45秒，共40个循环。

实施例4：结果分析和判定

反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为阳性；Ct值在35-40个循环之间为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在35-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。判断结果时需要满足：阴性质控品应为全部阴性；阳性质控品的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线。以上条件应同时满足，否则此次试验视为无效，全部试验应重新进行。

六、序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中华人民共和国浙江出入境检验检疫局  浙江大学

     北京索奥生物医药科技有限公司

<120>一种家蚕微粒子病荧光PCR检测方法及其试剂盒

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>825

<212>DNA

<213>蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因

<400>1

agacccaaat atcaagtaat ttagataata atgaaaacat tgtagaacca aaatatgagt     60

tctctaattg cacaattttg aaatctagtg ccatcgttgc tggttcaacc gctaaggaaa    120

cccgcaagga tataggaaag aagaaaggcc caagatcaaa acaggttgaa gaactagtct    180

ttacttctaa caagtatgaa cccctcatat aagttacatc cataagaatg cccaacaaag    240

aacacgaatt tgtctttgat gcaagtggtt ttcttgaaac tagttctgtc atgaatgagt    300

tgatgcagta cacaacgatt gcccaatcgt gcgaatcaac gacgctggaa gataagacga    360

atacacttac cgtctaggtc acatctcaac caccaagaaa ataagctatt cttttgtcga    420

tgaagaagca acatgatttt atgataccat caaagtagtt aaaaattcac cagtaacatc    480

tccatcattt tgcagcatat atggctgaag gttttggtat gaagagaaca tcttttccac    540

gttcatacac atcttaaatg tcacaaacct tacctagtaa gctcttaaga cgaaacttaa    600

agagaaagat aaaaacggag accacgtaga ataaaaactt tgcgtaaatg ttcaaaaaac    660

taggtggaga gaatattact tacaaagaat attacaagaa ttttcatcat cattaaatgt    720

aaggattctt aatgtcaaga ccaaacatcg acgaaatgat tcgacaaatg atgggttgac    780

tgttcccgta aagccatcca tcgataagga ccatatctga acagt                    825

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aagaattttc atcatcatt          19

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tcatttgtcg aatcatttcgt        21

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggattcttaa tgtcaagacc aaac    24