一种快速检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种快速检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒及检测方法。本发明试剂盒含有基因序列如SEQ ID NO：1～4所示的引物，可以特异性扩增来自产肠毒素大肠杆菌的基因。利用本发明的试剂盒可以快速准确地检测被产肠毒素大肠杆菌污染的食品，为食品生产和销售监督提供了一种简便可靠的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测食品质量的方法，具体的说，涉及一种快速检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒及检测方法。

背景技术

食品安全突发事件频率高是近年来社会公共安全问题的一个显著特点。在食品污染所引发的肠道疾病中，产肠毒素大肠杆菌是引起食物中毒的常见肠道致病菌之一。有效控制食品污染扩散，对食品质量的监督和检测提出了更高的要求。如何快速、准确的检测食品中的病原菌，是控制食品安全事故发生的基础。

目前，国内检测产肠毒素大肠杆菌仍采用传统的方法，其操作繁琐，检测时间长，通常需要3～5天。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出10⁹靶序列拷贝，扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。

本发明采用环媒恒温基因扩增技术，建立了快速检测不耐热型产肠毒素大肠杆菌的方法，缩短了检测时间(2-3小时完成)，提高了检测的灵敏性，为快速、准确检测食品是否发生病原菌污染，预防食品安全事故发生提供了可能。

发明内容

本发明提供一种检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒，其含有引物

SEQ ID NO：1  attacatttaagagcggcgc；

SEQ ID NO：2  ggttcctagcattagacatgcttt；

SEQ ID NO：3  gtgtatggaataataaaacccctaaagcaaactagttttcca；

SEQ ID NO：4  gtgtccttcatcctttcaatggcaggtcgaagtcccgggcagtc

特异性扩增来自产肠毒素大肠杆菌的基因。

所述产肠毒素大肠杆菌的基因为编码不耐热肠毒素的基因，其基因序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步的，所述试剂盒还含有Mg²⁺，更进一步的，所述试剂盒还含有显色剂。

优选的，所述显色剂是绿色核酸凝胶染液(SYBR Green I)鉬酸铵或硫酸铜。

本发明的另一目的是提供一种快速检测食品是否被产肠毒素大肠杆菌污染的方法，包括以下步骤：

1)提取待检样本中的DNA；

2)用引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物如SEQ ID NO：1～4所示；

3)对DNA扩增结果进行检测。

其中，步骤2)的扩增条件为，dNTPs浓度为0.6mM，Bst酶添加量为8U，扩增温度为55-65℃，扩增反应最短反应时间为40min。

步骤3)所述的检测DNA扩增结果的方法是：观察是否生成焦磷酸镁沉淀或沉淀显色。

根据本发明的另一方面，还提供如SEQ ID NO：1～4所示寡核苷酸序列的用途，其用于扩增或检测来自病原体产肠毒素大肠杆菌的基因。

本发明依据不耐热肠毒素(LT)编码基因的6个保守区，采用引物设计软件设计LAMP引物，优化了dNTPs浓度、BstDNA聚合酶浓度、反应温度、反应时间等反应条件，结果理想，并对该方法进行了特异性、敏感性试验，初步探索了可实际应用的试剂盒条件。

产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)的核苷酸序列总长度约为70kb，主要有两类致病基因：一类为菌毛蛋白基因(或称粘着素、定居因子)，已知的粘着素有K₈₈，K₉₉，987P，CFA，PCF0166，F41等。另一类为肠毒素基因，ETEC的主要毒力因子为耐热性肠毒素(heat-stable enterotoxin，ST)和不耐热性肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)，ST和LT是导致幼龄动物腹泻的直接致病因子。ETEC借助这些粘着素定居于宿主肠道粘膜的上皮细胞上，从而大量繁殖，产生大量肠毒素。

LAMP技术的特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在恒温条件(65℃左右)保温四十分钟，即可完成核酸扩增反应，直接扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度(或颜色反应)进行判断是否发生反应。

根据上述原理，发明人进行了下述工作：

1、LAMP检测方法的建立

以本发明设计的特异性引物扩增enterotoxigenic E.coli，ETEC特征基因片段。判断是否存在特异性扩增来确定ETEC的存在。

2、LAMP反应条件的优化

在不同的反应温度、反应时间、镁离子浓度、dNTP浓度、Betaine浓度下扩增。

3、特异性试验

以本发明建立的方法扩增各产毒素大肠菌参考株及其它细菌，考察该方法的特异性。

4、敏感性试验

逐步降低样品的菌液浓度，记录特异性条带亮度强弱，直至无扩增产物，以此研究该方法的灵敏性。

5、判定LAMP结果阴阳性方法探索

1.由于LAMP反应形成大量扩增产物，可以直接向扩增管中加入嵌入剂SYBRGreen I，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。

2.LAMP检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进行。LAMP反应中，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。

①鉬酸铵 在冷时鉬酸铵与焦磷酸盐溶液无沉淀发生；但在加热时，则有黄色磷鉬酸铵沉淀生成。

②硫酸铜 硫酸铜与焦磷酸盐生成灰蓝色沉淀。

本发明的试剂盒和检测方法可以快速方便地将被病原菌：产肠毒素大肠杆菌污染的食品检测出来，为食品生产和销售提供了一种新的监控方法。

附图说明

图1产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素基因的特异性扩增片段的电泳图

图2限制性内切酶酶切试验

M为分子量标记，泳道1-2分别为LAMP产物扩增片段的限制性内切酶酶切产物与LAMP产物扩增片段，LAMP扩增产物被EcoRI限制性内切酶酶切后的DNA片段与预期片段大小一致(372bp，285bp，240bp，200bp)

图3特异性实验

M为分子量标记，N为无模版对照，泳道1-10分别为：C83902产肠毒素大肠杆菌标准株、侵袭性大肠杆菌、普通变形杆菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、产气杆菌、球形芽孢杆菌、八叠球菌、腊样芽孢杆菌.

只有C83902产肠毒素大肠杆菌DNA模版被扩增，其余9种菌株均无LAMP扩增。表明LAMP法对不耐热肠毒素大肠杆菌的检测特异性较好。

图4灵敏性实验

随着菌液浓度的降低，特异性条带亮度逐渐变弱，至菌液稀释10^-8时无扩增产物。M-100bp分子量标记；泳道1：10^-4；泳道2：10^-5；泳道3：10^-6；泳道4：10^-7；泳道5：10^-8；泳道6：10^-9；NT：无模板对照

具体实施方式

本发明的实验条件：

1、材料

1.1主要菌株

实验涉及的主要菌种

1.2仪器和设备

主要的仪器设备：

(1)-70℃冰箱Ultra Freeze UF 3410                         Heto公司；

(2)TMQ.R-3250型高压灭菌锅            山东新华医疗器械股份有限公司；

(3)超净工作台SW-CF-2F                        苏州净化设备有限公司；

(4)电子天平                              北京赛多利斯天平有限公司；

(5)恒温培养箱                              中国上海科析实验仪器厂；

(6)倒置显微镜90-135.002                                 leica公司；

(7)空气振荡器HZQ-C                         哈尔滨市东明医疗仪器厂；

(8)稳流稳压电泳仪DYY-2                         北京市六一仪仪器厂；

(9)电泳槽DCY-31D                               北京市六一仪仪器厂；

(10)微型离心机minispin centrifuge                   Eppendorf公司；

(11)超纯水仪Milli-Q Biocel                          millipore公司；

(12)凝胶成像系统Gel DOCTMEQ                    Bio-RAD公司。

(13)水浴锅

其他的器材还有：灭菌广口瓶：500ml、灭菌锥形瓶：500ml、250ml、灭菌吸管：1mL、10mL、灭菌试管、灭菌毛细管、灭菌平皿、磁性搅拌器、均质器、载玻片、水浴槽、L型涂布棒、酒精灯、接种环。

电泳用的琼脂糖

1.3主要培养基

营养琼脂培养基：牛肉膏3g；蛋白胨10g；NaCl 5g；琼脂20g；水1000ml，调PH到7.4～7.6，121℃，灭菌20min。

LB液体培养基

称取Tryptone 5g，Yeast Extract 2.5g，NaCl 5g，置于500ml烧杯中。加入约400ml的去离子水，充分搅拌溶解。滴加5N NaOH，调节pH值7.0。加去离子水将培养基定容至500ml。高温高压灭菌后，4℃保存。

LB固体培养基

按照LB液体培养基配方准备好液体培养基，在高温高压灭菌前，加入Agar(琼脂粉，铺制平板用)15g/L。

高温高压灭菌后，戴上手套取出培养基，摇动容器使琼脂充分混匀。待培养基冷却至50～60℃时，加入热不稳定物质(如抗生素等)，摇动容器充分混匀。铺制平板(30～35ml培养基/90mm培养皿)。

1.4样品与生化试剂

Bst DNA聚合酶                    纽英伦生物技术(北京)有限公司

试验引物                                   北京赛百盛生物公司

DNA Marker E                               北京赛百盛生物公司

100bp DNA Ladder                           北京赛百盛生物公司

dNTPs                                      北京赛百盛生物公司

琼脂糖                                     北京赛百盛生物公司

1M Tris-HCL(pH 8.8)

称量121.1g Tris置于1L烧杯中。加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。pH值8.8加入浓盐酸约14ml，将溶液定容至1L。高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后，方可最后调定pH值。因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围

其他试剂均为国产分析纯。

实施例1本发明引物特异性实验

试验材料与方法

1菌种的培养

(1)取保藏的不耐热型产肠毒素大肠杆菌(C83902)在营养肉汁琼脂平板培养基中进行平板划线分离单菌落，放入恒温箱37℃倒置培养24h。

(2)挑取单菌落接种至3ml的液体培养基(试管)中，放入37℃180rpm摇床培养12h。

(3)将试管中培养的菌转接入120ml的液体培养基中相同条件下培养12h，4℃下保存备用。

2基因组的提取

(1)取细菌培养物100μl于12000rpm离心5min；

(2)加入100μl无菌水，混匀后，于100℃水浴10min，冰浴2min；

(3)最后于12000rpm离心5min，上清液备用。

基因组提取有多种本领域技术人员熟知的方法，可以根据实际情况，采用合适的方法提取样品DNA。

3本发明引物设计与合成

根据Genebank S60731提供的序列，通过BLAST同源性比较找出产肠毒素大肠杆菌Enterotoxigenic E.coli不耐热肠毒素(LT)的编码基因保守区片段长度255bp，序列如下(SEQ ID N0：5)：

attacatttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagactcccaaaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgagaccaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatcagtatggaaaactagtttgctttaaaagcatgtctaatgctaggaacctatataacaactactgtacttatacta

分别设计合成了以下4条特异性引物：

SEQ ID NO：1  attacatttaagagcggcgc；

SEQ ID NO：2  ggttcctagcattagacatgcttt；

SEQ ID NO：3  gtgtatggaataataaaacccctaaagcaaactagttttcca；

SEQ ID NO：4  gtgtccttcatcctttcaatggcaggtcgaagtcccgggcagtc

实验结果

1基因组DNA的提取

收集经37℃，180rpm摇床培养过夜的不耐热型产肠毒素大肠杆菌(C83902)菌体，用前述2的方法提取菌种基因组。将提取的基因组各取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。80V下电泳30min后，经凝胶成像系统处理，结果如图1所示，所提取的基因组条带非常清晰，证明提取总DNA的方法可靠。可以用来做LAMP反应的模板。

2优化后的扩增反应条件

LAMP反应最佳反应条件为：0.2μM引物1、2(SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2)，1.6μM引物3、4(SEQ ID NO：3和SEQID NO：4)的加入量分别为2μl，2.5mM dNTPs 4μl、0.8mM甜菜碱5μl、1X反应缓冲液2.5μl、ddH₂O 0.5μl；4μl DNA模板，混匀。94℃ 7min，然后冰浴5min。加入8U Bst DNA链置换聚合酶，63℃孵育60min。

3在上述反应条件下分别进行阳性和阴性对照实验

阳性实验：本发明的引物扩增终产物是一种混合物，由多个不同茎长的茎-环状结构DNA和在相同链中通过退火目的序列不断翻转复制而成的多样的环状结构所构成的花椰菜样结构所组成。由图2可知，LAMP扩增产物被EcoRI限制性内切酶酶切后的DNA片段与预期片段大小一致(372bp，285bp，240bp，200bp)，证明本发明引物扩增得到的产物与已知不耐热肠毒素基因一致。

阴性对照实验：用本发明的引物扩增C83902产肠毒素大肠杆菌标准株以及其他9种参考株。最终发现标准株呈阳性反应；而其他9种参考菌株呈阴性。扩增图谱见图3。只有C83902产肠毒素大肠杆菌DNA模版被扩增，其余9种菌株均无LAMP扩增。表明本发明的因为对不耐热肠毒素大肠杆菌的检测特异性较好。

实施例2本发明引物的灵敏性实验

按照实施例1的方法，用本发明的引物对不同稀释浓度的菌液进行扩增，随着菌液浓度的降低，特异性条带亮度逐渐变弱，至菌液稀释到10^-7(原菌液的浓度稀释倍数)时仍有条带产生，但是菌液稀释为10^-8时无扩增产物出现(如图4所示)。

用本发明的引物和方法检测灵敏度比较高，而且能在相当简陋的环境下进行，对样本的要求不高。将不耐热产肠毒素大肠杆菌直接进行裂解，收集其悬浮液进行LAMP反应，取各反应体系液3μL进行2％的琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图4所示，电泳结果条带逐渐变暗，并且条带有一定托尾，第4泳道条带比较弱，但还是有微弱条带，由电泳结果可知LAMP可检测到菌液浓度稀释为10^-7时，与预期结果相符，经过细胞平板计数，我们可知其能检测到的最低细胞数为350cell/tube。

实施例3检测产肠毒素大肠杆菌试剂盒的制备

成分：特异性引物：

SEQ ID NO：1  attacatttaagagcggcgc；

SEQ ID NO：2  ggttcctagcattagacatgcttt；

SEQ ID NO：3  gtgtatggaataataaaacccctaaagcaaactagttttcca；

SEQ ID NO：4  gtgtccttcatcctttcaatggcaggtcgaagtcccgggcagtc

反应体系：0.2μM引物1、2(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)分别为2μl；

          1.6μM引物3、4(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)分别为2μl；

          2.5mM dNTPs 4μl；

          0.8mM Betaine 5μl；

          1X Thermopol buffer 2.5μl；

嵌入剂SYBR GreenI 5μl(显色液)

试剂盒规格：50T/盒。

试剂盒组合二

0.2μM引物1、2(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)分别为1.5μl；

1.6μM引物3、4(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)分别为1.5μl；

2.5mM dNTPs 4μl；

0.8mM Betaine  5μl；

1X Thermopol buffer 2μl；

嵌入剂SYBR GreenI 5μl(显色液)

试剂盒规格：70T/盒。

实施例4用本发明的试剂盒检测样品

试剂盒快速检测样品的操作方法和实验结果：

1、检测对象：未被污染的食品

污染金黄色葡萄球菌食品

污染产毒素大肠杆菌的食品

2、操作步骤：

(1)样品预处理

按照食品检验国家标准对待检测的三种食品进行预处理，获得待测样品；

(2)提取样品的DNA模板

取细菌培养液0.5-1ml，置于已灭菌Eppendorf管(1.5ML)中，煮沸15min，8000r/min离心15min，取上清，即为DNA模板溶液。

(3)用50T/盒进行检测

另取1只已灭菌Eppendorf管，依次加入0.2μM引物1、2(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)分别为2μl；1.6μM引物3、4(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)分别为2μl；2.5mM dNTPs 4μl；0.8mM Betaine 5μl；1X Thermopol buffer 2.5μl；待测样本DNA模板4μl，混匀。94℃ 7min，然后冰浴5min。加入8U Bst DNA链置换聚合酶，63℃孵育60min。加入嵌入剂SYBR Green I显色剂5μl，混匀后静止5min，观测结果。

(4)检测结果

未被污染的食品：橙色(阴性)

污染金黄色葡萄球菌食品：橙色(阴性)

污染产毒素大肠杆菌的食品：浅绿色(阳性)

综上所述，本发明的检测方法和试剂盒具有良好的特异性和灵敏性，为食品检测提供了一种快速准确的途径，为食品生产和销售监督提供了一种简便可靠的方法。

                    Untitled6.ST25.txt

SEQUENCE LISTING

<110>西华大学

<120>一种快速检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒及方法

<130>CD569-09P108085

<160>5

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>1

attacattta agagcggcgc                                                20

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>2

ggttcctagc attagacatg cttt                                           24

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>引物

<400>3

gtgtatggaa taataaaacc cctaaagcaa actagttttc ca                       42

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>引物

<400>4

gtgtccttca tcctttcaat ggcaggtcga agtcccgggc agtc                     44

<210>5

<211>255

<212>DNA

<213>不耐热肠毒素(LT)的编码基因保守区片段

<400>5

attacattta agagcggcgc aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac    60

tcccaaaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag    120

accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc    180

agtatggaaa actagtttgc tttaaaagca tgtctaatgc taggaaccta tataacaact    240

actgtactta tacta                                                     255