与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用

摘要

本发明公开了与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记的获得方法。通过番茄苗期耐盐主效QTL定位；选择番茄苗期的M82和耐盐渐渗系IL7-5杂交，得到杂种F

说明书

发明领域

本发明涉及农业生物技术领域。具体的说，本发明涉及一种番茄苗期耐盐主效QTL(Quantitative Tratit Loci，数量性状位点)紧密连锁的分子标记及其获得方法和应用的技术领域。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)属茄科番茄属，广泛栽培于世界各地，不仅可用于鲜食，而且可加工成不同类型的番茄制品。然而，随着复种指数的提高，水、肥、农药尤其是长期氮肥施用量的大幅度增加，无论是露地还是保护地均已出现不同程度的次生盐渍化现象，严重影响了番茄的正常生长与发育(李廷轩，西南农业学报，2001，14(suppl.)：103-107)。与硬粒小麦、玉米、马铃薯、甜菜和向日葵等作物相比，番茄为中度盐敏感植物(Katerji N，Agricultural WaterManage(农业灌溉水管理)，2001，47：1-8)，而且番茄与其它作物一样，耐盐性受生长发育不同阶段的调控，每一个生长发育阶段的耐盐性和其它阶段基本不相关，每一个生长发育阶段都受多基因控制，而且受环境影响较大。芽期和苗期对盐更敏感，随着株龄的增加，耐盐性呈现增加的趋势，开花和座果期可以忍受使苗期致死的盐浓度(Mittova V，Journal of Experimental Botany(植物试验学报)，2004，55(399)：1105-1113)。盐害不仅影响番茄的产量和品质，严重时可导致植株死亡。目前，无论是保护地还是露地番茄生产，主要采用育苗移栽；另外，盐胁迫下番茄植株营养生长与产量呈正相关，良好的营养生长是后期产量形成的重要基础。因此，在盐碱含量较高的土壤栽培番茄，幼苗期耐盐不仅可提高番茄移栽的成活率，而且是未来形成产量的重要基础。

耐盐性鉴定是番茄耐盐育种的重要环节。只有对育种材料的耐盐性进行客观准确的评价，才能进行有效的选择。目前育种工作者普遍采用的耐盐性鉴定指标有形态指标、生理生化指标。大量前人工作(吴运荣，浙江大学学报(农业与生命科学版)，1999，25(6)：645-649；费伟，上海交通大学学报(农业科学版)，2005，23(1)：5-9；Foolad MR，HortSciene(园艺作物科学)，1997，32(2)：296-300)已表明。番茄耐盐的遗传机理复杂；常规育种实践中，对于耐盐材料的选择是十分困难的：一方面选育周期长，需要经历杂交和回交复杂的选择程序，另一方面盐害的发生受很多因素的综合影响，例如：空气温度、空气湿度和土壤含水量等，致使鉴定耐盐材料的过程不易控制。这些都是导致番茄耐盐育种进展缓慢的重要原因。

为了丰富我国番茄品种的遗传资源，改良番茄的耐盐性，选育耐盐性强、品味好的品种一直是番茄育种的重要目标。目前番茄主要是以育苗移栽为主，因此番茄苗期耐盐就显的尤为重要，近几年发展起来的分子标记辅助育种技术，通过构建重要番茄耐盐品种的遗传图谱和数量性状位点(Quantitative TratitLoci，QTL)分析，对于找到与番茄耐盐主效QTL紧密连锁(或共分离)的分子标记具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记。比现有技术在鉴定结果与田间耐盐吻合率明显提高，不受环境条件的影响，节约了成本，提高了育种和选择效率。

本发明通过以下技术方案实现的：通过构建重要番茄耐盐品种的遗传图谱和数量性状位点(Quantitative Tratit Loci，QTL)分析，找到与番茄耐盐主效QTL紧密连锁(或共分离)的分子标记。使用与某一特定番茄耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记，实现对番茄种质材料在幼苗期进行早代筛选，淘汰盐敏感的植株，节约生产成本，提高育种和选择效率。

本发明具体提供了一种番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁分子标记的方法，包括以下步骤：

(1)以野生番茄S.pennellii LA716的76个渐渗系中苗期耐盐渐渗系IL7-5为材料，此渐渗系群体是以盐敏感普通番茄S.lycopersicum M82为遗传背景，耐盐渐渗系IL7-5的亚渐渗系IL7-5-5与IL7-5含有相同的耐盐QTL。

(2)番茄苗期盐敏感品种M82(母本)和番茄苗期耐盐渐渗系IL7-5(父本)杂交，得到杂种F₁。

(3)由杂种F₁自花授粉获得1338株F₂单株，提取每个F₂单株的基因组DNA。

(3)苗期耐盐鉴定，盐胁迫处理12d后开始调查盐害情况，根据盐害的萎黄、坏疽、枯萎不同程度，将盐害划分为0-10个等级，并根据耐盐分级情况，将分级数转换为耐盐成活百分率。

(4)选取在耐盐亚渐渗系IL7-5-5与盐敏感品种M82之间具有扩增多态性的SSR、CAPS和AFLP引物组合；扩增产物SSR、AFLP或经相应内切酶消化后的扩增产物CAPS，在6％变性聚丙烯酞胺凝胶SSR、AFLP和1.5％琼脂糖凝胶CAPS上电泳分离后，获得多态性分子标记。

(5)以已获得的IL7-5-5上的侧翼标记SSR285筛选1338株F₂单株，根据差异性标记建立了一个255株的F₂重组群体。

(6)根据已获得的在IL7-5-5与M82之间具有多态性的4个特异性标记U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49，对255个F₂重组群体进行遗传分析，获得分子标记资料。

(7)将255株F₂重组单株的耐盐成活率与遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，以3.0为LOD阀值，确定与番茄苗期耐盐主效QTL连锁的分子标记SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49。

本发明中，根据已获得的在IL7-5-5与M82之间具有多态性的5个特异性标记SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49中，所述的多态性分子标记，其引物序列为：

SSR285上游引物为5′AGTGGCTCTCACCTACTGCG′3，下游引物为5′CAATTCTCAGGCATGAAACG′3；

U231219上游引物为5′AGTCTCTTGCTTGAGTCTGGAGTTG′3，下游引物为5′TGCTGGGAATATAATCAGCAAGG′3；

C₂-At4g30580上游引物为5′TCAGCCGGTGCTGCTTATCCAC′3，下游引物为5′TGATGAACTTGAAGTTTCTCCCAAGAG′3；

AFLP引物E35/M49组合上游引物E35为5′GACTGCGTACCAATTCACA′3，下游引物为M49为5′GATGAGTCCTGAGTAACAG′3；

AFLP引物E39/M50组合上游引物E39为5′GACTGCGTACCAATTCAGA′3，下游引物为M50为5′GATGAGTCCTGAGTAACAT′3。

本发明中，由于IL7-5-5片段很短，仅为0.9cM，在第7条染色体2.0-2.9cM片段之间，在杂交组合中其发生交换的几率很小，而且构建F2临时性群体时，往往容易遗失耐盐QTL所在的片段，所以以重叠但片段较长的耐盐渐渗系IL7-5与盐敏感遗传背景材料M82为亲本材料。

本发明中，在盐胁迫处理后进行调查盐害情况中，根据盐害的萎黄、坏疽、枯萎不同程度，将盐害划分为0-10个等级，具体分级标准如下：0级：完全致死，10级：植株健康，没有任何盐害症状。根据耐盐分级情况，将分级数转换为耐盐成活百分率，即耐盐成活率％＝级数/11×100。耐盐成活率(SP)用于统计分析和QTL定位，为遗传分析的需要，划定：耐盐(SP≥45％)，耐敏感(SP＜45％)。

本发明中，将255株的F₂重组单株的耐盐成活率与遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，以3.0为LOD阀值，大于3.0说明存在一个QTL位点，确定与番茄苗期耐盐主效QTL连锁的分子标记SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49。

本发明所涉及的与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用，将分子标记SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49用于番茄品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系在苗期是否具有耐盐性，包括以下步骤：

(1)以耐盐渐渗系IL7-5或亚渐渗系IL7-5-5为父本或母本与其他番茄杂交并繁衍至F₂代以上；

(2)对通过步骤(1)获得的番茄单个植株，分离叶片DNA，检测分离的DNA中是否存在与耐盐主效QTL相连锁的分子标记；如有苗期耐盐主效QTL异侧的3个以上分子标记同时出现，预测番茄苗期达到耐盐水平。

本发明中，将SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49分子标记用于番茄种质材料的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有耐盐性。

本发明中所选用的野生番茄S.pennellii LA716的76个渐渗系(IL)材料，来源于美国番茄遗传中心(TGRC)，本领域普通技术人员可以通过引进途径可以获得。

本发明中所选用的番茄S.lycopersicum M82，来源于普通栽培番茄，本领域普通技术人员通过购买或赠予途径可以获得。

本发明中所选用的F₁，来源于M82×IL7-5，本领域普通技术人员通过常规杂交途径可以获得。

本发明中所选用的F₂，来源于F₁自交产生，本领域普通技术人员通过常规自交途径可以获得。

本发明以IL7-5-5及其衍生品种或品系为父本或母本与其它番茄杂交并繁衍至F₂代以上。所述IL7-5-5及其衍生品种或品系，是指以IL7-5-5为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用花药培养、或用别的物理或化学方法杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的番茄品种或品系。

本发明筛选的SSR标记与CAPS标记的序列信息，都可以通过Cornell大学网站(http://www.sgn.cornell.edu/)免费获得。

本发明筛选的AFLP标记的序列信息，可以通过一般生物网站或已公开发表的论文文献免费获得。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：

1.本发明能克服常规育种中番茄苗期耐盐性鉴定易受环境影响，在幼苗期就可通过检测分子标记对番茄植株的耐盐性进行预测和筛选，淘汰盐敏感植株，而利用常规耐盐育种方法选育一个新品种或新品系，往往需要6-8年，甚至更长时间，同时每代都需要对群体进行耐盐性鉴定，工作量很大。此外，耐盐性鉴定又往往受环境条件的影响，而分子标记辅助选择不受环境条件的影响，在低世代就可以对耐盐性进行选择，将大大减少育种家的工作量，提高选择的准确性和育种效率。本发明对耐盐渐渗系IL7-5和盐敏感品种M82杂交获得的重组F₂代每个单株的基因型和耐盐性表型数据进行QTL和遗传连锁分析，获得与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记SSR285、U231219、C2_At4g30580、E35/M50和E39/M49。通过检测番茄种质材料的DNA中是否有分子标记，可预测其耐盐水平，从而可加快至少50％的选择进度，减少至少80％的工作量，选择的准确率由85％提高到100％。

2.本发明是一种多基因控制的耐盐性的技术，本发明使用的IL7-5是耐盐渐渗系，在国际上已经广泛被育种家使用作为耐盐的亲本，其苗期耐盐性主效QTL相连锁的分子标记为首次报道，利用与苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记，可以不受环境条件的影响，番茄种质材料在早代苗期进行筛选，节约成本，提高育种和选择效率。

附图说明

图1为6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M是100bp plus DNA Ladder marker；样本从左到右：第2、3泳道为IL7-5-5，第4、5泳道为M82。

图2为1.5％琼脂糖凝胶电泳图，M是100bp plus DNA Ladder marker；样本从左到右：第2、3泳道为IL7-5-5，第4、5泳道为M82。

图3为1.5％琼脂糖凝胶电泳图，M是100bp plus DNA Ladder marker；样本从左到右：第2、6泳道为IL7-5-5，第3、7泳道为M82。

图4为6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，样本从左到右：第1泳道为IL7-5-5，第2、3泳道为M82。

图5为6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，样本从左到右：第1、2、3、4泳道为I L7-5-5，第5、6、7、8泳道为M82。

图6为番茄苗期耐盐主效QTL(Stq7b)连锁片段定位分析示意图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中设备和材料有：

PCR仪选用MJ PTC-200热循环仪；引物由上海生物工程责任有限公司提供；Taq酶采用上海生工Promega进口分装；缓冲液采用上海生工Promega进口分装；dNTPs中dATP，dCTP，dGTP，dTTP各取10mM组成混合液均购于大连宝生物责任有限公司和Promega进口原装；限制性内切酶选用TaqI，EcoRI，EcoRV，PstI，HindIII，XbaI，DraI，HinfIII，HaeII，PvuII，BamHI，AluI，MspI，ScaI，HhaI，RsaI均购于大连宝生物责任有限公司；其他试剂购于北京鼎国生物技术发展中心。

栽培种S.lycopersicum M82及来自S.pennellii LA716的76个渐渗系。渐渗系群体是基于普通番茄S.lycopersicum M82遗传背景，利用侧翼标记，将野生种S.pennellii LA716片段渗入构建，包括初始含有较长染色体片段的50个品系，及含有的较短片段的26个品系，这些含有较短片断的品系与50个品系中的一些品系基本完全重叠，为精细定位提供了基础。全套渐渗系基本覆盖了野生种LA716的整个基因组，片段平均长度约12.3cM。上述材料均由美国番茄遗传资源中心(Tomato Genetic Resource Center，TGRC)提供，种子由中国农业科学院蔬菜花卉研究所繁殖。

1.5％琼脂糖凝胶采用100ml TBE溶液中含1.5g琼脂糖；6％变性聚丙烯酰胺凝胶采用100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含42.0g尿素、5.7g丙烯酰胺和0.3g甲叉双丙烯酰胺。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁分子标记的获得

(1)采用耐盐渐渗系IL7-5与番茄盐敏感品种M82杂交产生F₁杂种。

(2)F₁自交产生1338个F₂单株，分离每个F2单株的基因组DNA，利用耐盐亚渐渗系IL7-5-5上的侧翼标记SSR285筛选1338株F₂单株，根据差异性标记建立了一个255株的F₂重组群体。

(3)根据已有方法(宋建，上海交通大学学报(农业科学版)，2006，24(6)：524-528；吴玉辉，中国农学通报，2008，24(4)：80-84；雷娜，东北农业大学学报，2008，39(3)：29-33)，分离亲本IL7-5-5与M82的DNA，利用微卫星(SSR)、酶切扩增多态性序列(CAPS)和扩增片段长度多态性(AFLP)引物对俩亲本进行PCR扩增，扩增产物(SSR、AFLP)或经相应内切酶消化后的扩增产物(CAPS)，在6％变性聚丙烯酞胺凝胶(SSR、AFLP)和1.5％琼脂糖凝胶(CAPS)上电泳分离。结果从2对SSR引物中获得了1对具有多态性标记的引物，即SSR285，参见附图1。从4对CAPS引物中获得了2对具有多态性标记的引物，即U231219和C2_At4g30580，参见附图2和附图3，相应的消化内切酶分别为Cfo I和RsaI。从10对AFLP引物中获得了2对具有多态性标记的引物，即E35/M49和E39/M50，参见附图4和附图5。利用这些在两个亲本IL7-5-5与M82之间具有扩增多态性的引物，对255个F2重组单株进行分析，获得分子标记多态性数据。

(4)基于遗传连锁交换定律，用分子标记分析资料构建番茄遗传图谱，将获得的多态性数据采用软件Joinmap4.0，设定LOD≥3.0，使用Kosambi函数构建IL7-5-5的遗传连锁图谱。

(5)苗期耐盐鉴定2009年春天在温室进行，将1338个F2单株的种子播种在按体积比计的草炭、珍珠岩、蛭石以1∶1∶1的混合基质中，按常规温室管理。待幼苗长到4片真叶时，将幼苗根部的草炭、珍珠岩和蛭石清洗干净，然后移栽到盛有1/2浓度的Hoagland标准营养液。每一个塑料容器15株，每一个塑料容器包括至少1株M82作为对照，日补充空气三次、每次30分钟，并每隔两天将蒸发掉的水分用无离子水补充到原体积，一周后开始加盐。每天按50mM NaCl+5mM CaCl2增加盐浓度，直至终盐浓度达到700mM NaCl+70mMCaCl2为止。当盐浓度达到终浓度后第12天调查耐盐级数，根据盐害的萎黄、坏疽、枯萎不同症状，按照耐盐程度分为0-10个等级。具体分级标准如下；0级：完全致死。1级：植株叶枯萎，茎干直立。2级：植株叶枯萎，茎干直立且绿色。3级：植株叶一半萎黄，一半枯萎。4级：植株叶大部分萎黄，有少许萎缩绿叶。5级：植株叶1/3绿色、2/3萎黄，绿叶萎缩严重。6级：植株叶一半绿，一半萎黄，绿叶有萎缩。7级：植株叶2/3叶绿色、1/3萎黄，绿叶有萎缩。8级：叶全绿色，有萎缩。9级：叶全绿色，有轻微萎缩。10级：植株健康，没有任何盐害症状。

根据耐盐分级结果，计算每个单株的耐盐成活率(SP)，其值用于统计分析和QTL定位。

耐盐成活率公式如下：

耐盐成活率％(SP)＝级数/11×100

为遗传分析的需要，划定：耐盐(SP≥45％)，耐敏感(SP＜45％)。

(6)综合遗传图谱数据和耐盐性鉴定资料，QTL分析采用MapQTL 4.0软件，选择单区间作图法(Single interval mapping，SIM)找到确定的QTL及与其紧密连锁的分子标记。利用“Permutation Test”命令，估计连锁片段在α＝0.05水平上的LOD阈值。以连锁片段上LOD值最高的位置作为QTL的位置。估计QTL的贡献率和可解释的表型变异率。分析发现在连锁片段上标记U231219和SSR285之间存在一个QTL位点，与标记U231219、E35/M49、E39/M50和SSR285之间的连锁距离分别为0.36cM、0.46cM、0.48cM和0.54cM，而与标记C2_At4g30580共分离，参见附图6。其LOD值为8.1，解释了22％的遗传变异率，见表1，表明SSR285、U231219、E35/M50和E39/M49标记与IL7-5-5的苗期主效耐盐QTL紧密连锁，且C2_At4g30580标记与IL7-5-5的苗期主效耐盐QTL共分离。可用于番茄苗期耐盐品种和品系的耐盐性预测。

表1 IL7-5-5片段上苗期耐盐主效QTL分析

实施例二：

根据现有技术，采用：宋建，上海交通大学学报(农业科学版)，2006，24(6)：524-528；吴玉辉，中国农学通报，2008，24(4)：80-84；雷娜，东北农业大学学报，2008，39(3)：29-33，选取在两个亲本IL7-5-5与M82之间具有扩增多态性的SSR、CAPS和AFLP引物组合。经PCR扩增后，扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶和6％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得的多态性标记，分别获得的多态性标记为SSR引物SSR285，CAPS标记U231219和C₂-At4g30580，AFLP标记E35/M49和E39/M50。

采用的引物序列分别为：

SSR285上游引物为5′AGTGGCTCTCACCTACTGCG′3，下游引物为5′CAATTCTCAGGCATGAAACG′3；

U231219上游引物为5′AGTCTCTTGCTTGAGTCTGGAGTTG′3，下游引物为5′TGCTGGGAATATAATCAGCAAGG′3；

C₂-At4g30580上游引物为5′TCAGCCGGTGCTGCTTATCCAC′3，下游引物为5′TGATGAACTTGAAGTTTCTCCCAAGAG′3；

AFLP引物E35/M49组合上游引物E35为5′GACTGCGTACCAATTCACA′3，下游引物为M49为5′GATGAGTCCTGAGTAACAG′3；

E39/M50组合上游引物E39为5′GACTGCGTACCAATTCAGA′3，下游引物为M50为5′GATGAGTCCTGAGTAACAT′3。

扩增产物SSR和AFLP或经相应内切酶消化后的扩增产物CAPS，在6％变性聚丙烯酞胺凝胶SSR、AFLP和1.5％琼脂糖凝胶CAPS上电泳分离后，获得分子标记多态性数据。结果从2对SSR引物中获得了1对具有多态性标记的引物，即SSR285。从4对CAPS引物中获得了2对具有多态性标记的引物，即U231219和C2_At4g30580，相应的消化内切酶分别为Cfo I和Rsa I。从10对AFLP引物中获得了2对具有多态性标记的引物，即E35/M49和E39/M50。

实施例三：与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记在F₂分离群体中的验证

将获得的与番茄苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记，在IL7-5-5与M82杂交的F₂代的部分植株进行了苗期耐盐性预测，先从它们的叶片中分离DNA，然后利用标记SSR285、C2_At4g30580、U231219、E35/M49和E39/M50的引物对这些DNA进行PCR扩增，并通过评判图谱来确定是否存在相应的标记，存在耐盐主效QTL异侧的3个以上分子标记，说明该株系是属于苗期耐盐的株系，不存在则是盐敏感的材料。然后基于这些判断准则对每个番茄植株的苗期耐盐性进行预测。随后利用加盐水培的方法测定受测样品的苗期实际耐盐性并与预测结果进行对比。结果见表2，预测结果与实测结果吻合度达到100％。

表2：用与苗期耐盐主效QTL紧密连锁的分子标记预测分离后代(F₂)的苗期耐盐性

表中：+表示有标记(SSR285、C2_At4g30580、U231219、E35/M49和E39/M50)的扩增条带：-表示无标记(SSR285、C2_At4g30580、U231219、E35/M49和E39/M50)的扩增条带。