一种海洋来源Bacillus barbaricus SCSIO 02429以及用它制备鱿鱼小肽的方法

摘要

本发明涉及一种海洋来源Bacillus barbaricus SCSIO 02429 CCTCC No：M2010213。本发明还涉及一种鱿鱼小肽的制备方法，其特征是将Bacillus barbaricus SCSIO 02429加入有诱导产酶发酵培养基中发酵，得到水解用粗酶溶液，然后将鱿鱼内脏碎成浆状后加入粗酶溶液进行酶解，得到糖基侧链被破坏的粗蛋白酶解物，再加入菠萝蛋白酶进行酶解，得到的酶解物经静置，粗脂肪层和水层分离，除去脂肪层后干燥，得鱿鱼小肽。本发明的鱿鱼小肽得率可达40～46％，氨基酸得率可达16～22％，这种鱿鱼小肽有降低海水养殖动物幼苗死亡率，提高增重率的作用，可以替代饲料中鱼粉等传统蛋白源，用于海水养殖配合饲料的功能性蛋白源、添加剂等。

说明书

技术领域

本发明涉及一种芽孢杆菌，具体来说涉及一种海洋来源芽孢杆菌Bacillus barbaricus SCSIO 02429菌株，还涉及利用该菌株来制备鱿鱼小肽的方法。 

背景技术

随着我国海洋捕捞业的迅速发展，鱿鱼年产量已达30万吨左右，成为我国重要的水产加工原料之一。在鱿鱼的加工处理过程中，有15％左右的内脏废弃物产生，这些废弃物富含蛋白质，但极易腐烂变质，难以储存。通常的处理方式是将提取完鱿鱼油后的废弃物进行掩埋，近期也有对鱿鱼内脏进行初级加工制成鱿鱼溶浆直接用作鱼类饲料的报道，但是这种未经精深加工的饲料生物利用率不高，还会污染水体环境，增加养殖动物病害爆发的机会。因此对鱿鱼内脏的深入开发利用具有经济和环保的重要意义。鱿鱼内脏的酶解方法研究也已经引起了广泛重视，使用生物酶技术将鱿鱼粗蛋白水解为水产动物易吸收、具有一定生理功能的小肽类蛋白源是一种有效的方式，并且也进行了一些研究，例如薛长湖、刘春娥等人对酶的种类、用量、反应温度、反应时间等因素对鱿鱼内脏粗蛋白转化率的影响的研究(刘春娥，林洪，曹立民，单俊伟.鱿鱼内脏蛋白质酶解工艺的研究.食品工业科技，2004，25(9)：83-85.)袁亚辉等人利用酶解鱿鱼内脏生产海味素，张井等人对鱿鱼内脏酶解液中重金属脱除方法的研究等。 

在已报道的鱿鱼内脏酶解方法中，采用的酶的种类有胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及这些酶的混合物。但现阶段的鱿鱼内脏水解方法仍存在粗蛋白水解率低，酶解产物中的残余粗蛋白很难被海水养殖动物吸收利用的问题。而通过提高反应温度、延长反应时间、提高催化剂用量等手段提高粗蛋白水解度后，又会出现过度水解现象，目标小肽的得率大幅降低，例如有文献报道，鱿鱼内脏水解的氨基酸得率超过70％，但小肽得率却非常低。如果能在提高粗蛋白水解效率的同时保证目标小肽得率，就可以大幅提高鱿鱼内脏的利用水平。 

发明内容

本发明的目的在于从海洋中开发出一种新的芽孢杆菌，另一目的是利用这种芽孢杆菌酶解鱿鱼内脏，提供一种能高粗蛋白水解率和高小肽得率的鱿鱼小肽的制备方法。 

我们从中国南海深海沉积物中分离出Bacillus barbaricus SCSIO 02429，用Bacillus barbaricus SCSIO 02429发酵得到的粗酶溶液破坏内脏蛋白中与肽链连接的氨基多糖侧链，再加入菠萝蛋白酶催化蛋白质肽链水解，得到的鱿鱼小肽得率达40％～46％，氨基酸得率为16％～22％，从而实现了本发明的目的。 

Bacillus barbaricus SCSIO 02429已于2010年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址是武汉市武昌珞珈山，简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2010213。 

所述的Bacillus barbaricus SCSIO 02429从2009年采集到的中国南海深海沉积环境(经度：119°57.260′，纬度：20°59.877′，水深229米)中分离得到。采用细菌培养基通过稀释平板法分离及划线法进行纯化。经16S rRNA基因序列相似性分析，发现其与Bacillus barbaricus具有99％(722/728bp)的相似性，鉴定其为Bacillus barbaricus种的一个菌株SCSIO 02429。该菌株在ISP2培养基(每升蒸馏水中加入酵母膏4.0g，麦芽汁10.0g，葡萄糖4.0g，琼脂20.0g，pH 7.0)上28～37℃生长良好。 

按照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》的标准、方法和种的分类特征，对待测菌株进行细菌形态观察、生理生化测试等试验。该菌株在PYES medium (0.3％酪蛋白胨，0.3％的酵母提取物，0.23％琥珀酸二钠，pH值7.2)上同样生长良好，为棕色、不透明、平坦的圆形菌落，最大菌落直径5mm。菌落在生长初期有完整边界，但在继续生长的过程中边界逐渐消失。细胞呈杆状，芽孢为椭圆型，细胞为革兰氏阳性。在PYES medium上，28～37℃均可良好生长；经3周培养后，在4～47℃下均可观察到明显的生长。该菌可以在含2％和5％氯化钠的PYES medium上生长；培养3周后，在含12％NaCl的PYES medium培养基上可以观察到生长。菌株在pH6.0时可以观察到生长，在pH7.0、8.0、9.5可以快速生长，说明该菌具有耐碱性。SCSIO 02429株菌的生理生化试验结果见表1，表中“+”表示阳性或能够利用；“-”表示阴性或不能利用。 

表1 SCSIO 02429株菌的生理生化试验结果 

SCSIO 02429株菌与最相似菌株Bacillus barbaricus V2-BIII-A2(参考文献：Taubel M.，Kampfer P，Buczolits S，Lubitz W，Busse H-J R.Bacillus barbaricus sp.nov.，isolated from an experimental wall painting.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53：725-730.该菌的16S rDNA序列在GenBank/EMBL/DDBJ中的登录号为AJ422145)在生理学特性上绝大部分相同，但在D-核糖，柠檬酸盐，蔗糖的利用，最高盐耐受浓度为5％特征上不同。因此，SCSIO 02429被鉴定为Bacillus barbaricus的一个菌株，Bacillus barbaricus目前还没有中文译名。 

本发明的鱿鱼小肽的制备方法，其特征包括以下的步骤： 

(1)将Bacillus barbaricus SCSIO 02429菌种转接到菌种活化培养基中，30～37℃下培养18～24h，活化后加入有诱导产酶发酵培养基的容器中，pH＝7.0～8.0，30～37℃的条件下发酵12～24小时，当发酵液蛋白酶活力达到2000～3000单位/mL，氨基多糖酶活力达到0.95～1.12单位/mL时，即为糖基水解用粗酶溶液，所述的诱导产酶发酵培养基由鱿鱼内脏浆，蛋白胨，酵母膏，复合盐和水按质量比20～30∶5∶5∶10∶1000混合加热溶解后制得，所述的复合盐由氯化钠，硫酸钾，氯化镁和氯化铵按质量比5～8∶2∶2∶3混合得到； 

(2)将鱿鱼内脏原料碎成浆状后与步骤(1)所述的粗酶溶液按体积比1∶1～2∶1混合进行酶解，反应的起始pH值为6.5～7.0，温度为40～50℃，时间5～8小时，得糖基侧链被破坏的粗蛋白酶解物； 

(3)按鱿鱼内脏原料每克加入菠萝蛋白酶1000～1500活力单位的比例，将菠萝蛋白酶加入步骤(2)得到的粗蛋白酶解物中，pH调至6.5～7.0，在35～40℃下反应4～6小时，得到的酶解产物经静置，粗脂肪层和水层分离，除去脂肪层后干燥，得鱿鱼小肽。 

步骤(3)所述的干燥可以是喷雾干燥等。本发明所用的蛋白胨和酵母膏可从市场购买。 

本发明通过Bacillus barbaricus SCSIO 02429生产的粗酶酶解破坏内脏蛋白中与肽链连接的氨基多糖侧链，消除糖基对蛋白肽链水解位点的保护作用，在温和条件下反应避免过度水解，使鱿鱼小肽得率达40～46％，氨基酸得率达16～22％，这种鱿鱼小肽有降低海水养殖动物幼苗死亡率，提高增重率的作用，可以替代饲料中鱼粉等传统蛋白源，同时具有一定的生理活性，可以使水产动物的增重率和成活率显著提高，因此可以用于海水养殖配合饲料的功能性蛋白源、添加剂等。 

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。 

实施例中的Bacillus barbaricus SCSIO 02429保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2010213；所用的鱿鱼购自广州市黄沙海产市场，经鉴定为北太平洋鱿鱼(Ommastrephes bartrami)，采集内脏储存于-18℃备用。使用前24小时在4℃下解冻；所用的菠萝蛋白酶由南宁庞博生物工程有限公司生产，80万活力单位/g。蛋白胨0xide公司生 产，酵母膏(Yeast extract)购自碧云天生物技术研究所。 

实施例1： 

在1L水中加入蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，调节pH至7.0，得到菌种活化培养基。 

称取鱿鱼内脏浆100g，蛋白胨25g，酵母提取物25g，复合盐50g，加入去离子水5000mL，加热溶解，调节pH至7.0，移入发酵罐，蒸汽灭菌，得到产酶发酵培养基，其中的复合盐由氯化钠20.9g，硫酸钾8.3g，氯化镁8.3g和氯化铵12.5g组成。 

将Bacillus barbaricus SCSIO 02429的菌种转接到菌种活化培养基中，30℃下培养24h。活化后菌种加入有5L产酶发酵培养基的发酵罐中，在pH＝7.0，30℃，搅拌速度100r/min，通气比0.2的条件下发酵24小时，当蛋白酶活力达2000单位/mL，氨基多糖酶活力达0.95单位/mL时完成发酵，得到水解用粗酶溶液4.7L。 

蛋白酶活力测定方法：按中华人民共和国专业标准《蛋白酶活力测定法SB/T10317-1999》方法测定。 

氨基多糖酶活力单位定义为：在60℃，pH 5.2，反应30min，每min形成1μmol氨基葡萄糖所需要的酶量。氨基多糖酶活力测定方法：称取一定量的氨基多糖溶于0.2mol/L的醋酸溶液中，用0.2mol/L的醋酸钠调节pH至5.2，配成0.5％的氨基多糖溶液，吸取1.5mL多糖溶液，60℃保温2min后，加入0.5mL酶液，摇匀，反应30min后，加入3mL铁氰化钾试剂，中止反应，用Imoto法测其中还原糖含量，计算氨基多糖的分解速度。 

称取5kg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎10min，得约4.7L糊状物，移入装有产酶发酵产物的发酵罐中，用2.0mol/L的醋酸调节溶液pH值到6.5，将温度调至40℃，搅拌速度100r/min，反应8小时，得到糖基侧链被破坏的粗蛋白酶解物。 

向糖基侧链被破坏的粗蛋白酶酶解产物中加入菠萝蛋白酶6.25g，使酶用量达到1g鱿鱼内脏原料约1000活力单位。搅拌均匀后，设定反应温度为40℃，搅拌速度50转/分，调节pH值到7.0，反应时间6小时。反应完成后，停止搅拌，产物静置使油水分层，除去上层粗油后，取样测定鱿鱼小肽得率和氨基酸得率，结果分别为40％和16％。酶解物立即喷雾干燥，得鱿鱼小肽粉末853g。 

采用凝胶色谱法测定小肽得率和氨基酸得率，小肽得率(％)＝N₂/N₁×100，氨基酸得率％＝N₃/N₁×100，N₁是酶解液中氨基酸态氮总含量，N₂是分子质量300～1000Da肽类流分中氨基酸态氮含量(g)，N₃是分子质量100～250Da流分中氨基酸态氮的含量(g)。通过凯氏定氮法测定N₁。将酶解物脱脂、离心除去不溶物称重，溶解于0.2mol/L磷酸钠缓冲液，载入SephadexLH 20凝胶柱，使用0.2mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，依次收集不同保留体积流分，然后使用凝胶渗透高效液相色谱法测定各流分的分子质量分布，合并300～1000Da分子质量范围内流分即为小肽片段，使用凯氏定氮法测定其氨基酸态氮含量，即为N₂；合并100～250Da 分子质量范围内流分即为游离氨基酸片段，使用凯氏定氮法氨基酸态氮含量，即为N₃。各流分的分子质量分布用凝胶渗透高效液相色谱方法测定，计算公式为V_e＝-b’lgM_w+c’，式中V_c为保留体积，M_w为分子质量，b’和c’为常数，用0.2mol/L磷酸钠缓冲液以1mL/min平衡色谱柱(PL aquagel-OH 308um，SEC公司，英国)，至214nm的吸光度恒定，用蓝色葡聚糖溶液进样测定V₀(死体积)，甘氨酸溶液进样测定V_t(凝胶柱床的总体积)，用标准蛋白质混合液进样，流速1.0mL/min，记录各种标准蛋白的洗脱体积V_e，绘制分子量对数-V_e的工作曲线，求得中常数b’和c’。直接以Sephadex LH-20柱色谱分离所得各流分作为样品，进样测定保留体积V_e，根据公式计算分子质量分布范围。 

实施例2： 

在1L水中加入蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，调节pH至7.0，得到菌种活化培养基。 

称取鱿鱼浆150g，蛋白胨25g，酵母提取物25g，复合盐50g，加入去离子水5000mL，加热溶解，调节pH至8.0，移入发酵罐，蒸汽灭菌，得到产酶发酵培养基，其中的复合盐由氯化钠26.6g，硫酸钾6.7g，氯化镁6.7g和氯化铵10.0g组成。 

将Bacillus barbaricus SCSIO 02429的菌种转接到菌种活化培养基中，37℃下培养18h。活化后菌种加入有5L产酶发酵培养基的发酵罐中，在pH＝8.0，37℃，搅拌速度100r/min，通气比0.2的条件下发酵12小时，当蛋白酶活力达3000单位/mL，氨基多糖酶活力达1.12单位/mL时完成发酵，得到水解用粗酶溶液4.孔。蛋白酶活力和氨基多糖酶活力用实施例1的方法测定。 

称取10kg切块鱿鱼内脏，使用匀浆机以2000r/min粉碎10min，得约9.4L糊状物，移入装有产酶发酵产物的发酵罐中，用2.0mol/L的醋酸调节溶液pH值到7.0，将温度调至50℃，搅拌速度100r/min，反应5小时，得到糖基侧链被破坏的粗蛋白酶解物。 

向糖基侧链被破坏的粗蛋白酶解物中加入菠萝蛋白酶18.15g，使酶用量达到1g鱿鱼内脏原料约1500活力单位。搅拌均匀后，设定反应温度为35℃，搅拌速度50r/min，调节pH值到6.5，反应时间4小时。反应完成后，停止搅拌，产物静置使油水分层，除去上层粗油后，取样测定鱿鱼小肽得率和氨基酸得率，结果分别为46％和22％。酶解物立即喷雾干燥，得鱿鱼小肽粉末1630g。小肽得率和氨基酸得率按实施例1的方法计算。 

实施例3： 

奥尼罗非鱼鱼苗由广东柏士联罗非鱼苗良种场提供，为出膜1天的同一批奥尼罗非鱼仔鱼。实验前先将仔鱼放在50升的塑料桶内驯养2天，驯养期间不投喂饵料。 

将奥尼罗非鱼鱼苗分成1个对照组和4个实验组，其中对照组所用的饲料配方是鱼粉46％，麦芽根15％，茨粉19％，酵母3％，大豆卵磷脂1％，胆碱0.5％，磷酸氢钙0.5％，复合维生素0.4％，合矿物盐0.6％，纤维素8％，豆油1％，褐藻酸钠1％，明胶4％，实验组1所用的饲料配方是鱼 粉41％，实施例1得到的鱿鱼小肽5％，麦芽根15％，茨粉19％，酵母3％，大豆卵磷脂1％，胆碱0.5％，磷酸氢钙0.5％，复合维生素0.4％，复合矿物盐0.6％，纤维素8％，豆油1％，褐藻酸钠1％，明胶4％，实验组2所用的饲料配方是鱼粉41％，实施例2得到的鱿鱼小肽5％，麦芽根15％，茨粉19％，酵母3％，大豆卵磷脂1％，胆碱0.5％，磷酸氢钙0.5％，复合维生素0.4％，复合矿物盐0.6％，纤维素8％，豆油1％，褐藻酸钠1％，明胶4％，实验组3所用的饲料配方是鱼粉36％，实施例1得到的鱿鱼小肽10％，麦芽根15％，茨粉19％，酵母3％，大豆卵磷脂1％，胆碱0.5％，磷酸氢钙0.5％，复合维生素0.4％，复合矿物盐0.6％，纤维素8％，豆油1％，褐藻酸钠1％，明胶4％，实验组4所用的饲料配方是鱼粉36％，实施例2得到的鱿鱼小肽10％，麦芽根15％，茨粉19％，酵母3％，大豆卵磷脂1％，胆碱0.5％，磷酸氢钙0.5％，复合维生素0.4％，复合矿物盐0.6％，纤维素8％，豆油1％，褐藻酸钠1％，明胶4％。将相应的饲料配方在高水分条件下混匀呈浆状，50℃负压(0.097mPa)干燥，破碎，过筛，颗粒大小为60～80μm，得到的饲料置于20℃冰箱备用。 

饲养鱼苗桶里放置气石，24h充气，每天换水50％，吸出桶底废物，并用恒温棒控制温度为27℃。每天投喂仔鱼体重10％的配合饵料3次；实验周期21天，重复3次。 

死亡率和增重率按下面方法计算： 

在实验开始和结束时分别测量奥尼罗非鱼的体重(精确到0.001g)，以及鱼苗数量。 

死亡率＝(实验开始时鱼苗数量-实验结束时鱼苗数量)/实验开始时育苗数量×100％ 

绝对增重率＝(实验结束时鱼苗重量(g)-实验开始时鱼苗重量(g))/实验天数 

结果是，对照组中鱼苗的死亡率是53％±8％，绝对增中率0.0053±0.0012g/天，实验组1中鱼苗的死亡率是42％±10％，绝对增中率0.0062±0.0005g/天，实验组2中鱼苗的死亡率是45％±10％，绝对增中率0.0068±0.0011g/天，实验组3中鱼苗的死亡率是38％±2％，绝对增中率0.0075±0.0015g/天，实验组4中鱼苗的死亡率是39％±6％，绝对增中率0.0069±0.0012g/天。