抗CD19的抗体和抗CD5的抗体的新用途

摘要

本发明公开了抗CD19的抗体和抗CD5的抗体的新用途。本发明提供的新用途为抗CD19的抗体和抗CD5的抗体在制备检测糖皮质激素和抗病毒药物对迟发性出血性膀胱炎疗效的试剂中的应用。本发明中对水化、碱化及抗病毒治疗均无效的迟发性出血性膀胱炎患者，采取糖皮质激素联合抗病毒治疗，观察疗效，同时监测患者发病不同阶段外周血B淋巴细胞亚群变化。发现大部分病人对激素治疗有反应，且疗效与CD19+CD5+B细胞亚群比例明显相关。如果患者在某一阶段中CD19+CD5+B细胞亚群占总B细胞的比例显著高于发病时的比例，提示糖皮质激素辅助治疗可以取得比较好的疗效。本发明对于迟发性出血性膀胱炎患者的治疗具有重大意义。

说明书

技术领域

本发明涉及抗CD19的抗体和抗CD5的抗体的新用途。

背景技术

迟发性出血性膀胱炎(late-onset hemorrhagic cystitis，LOHC)是异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem celltransplantation，allo-HSCT)的常见并发症，严重LOHC常导致患者住院时间延长，痛苦增加。LOHC临床症状不一，轻者只表现为镜下血尿，重者可引起尿路阻塞，甚至会威胁到患者的生命。迟发性出血性膀胱炎的发生机制仍不明确。多数报道称病毒感染，如BKV、CMV、ADV等，尤其是BK病毒与LOHC的发生密切相关。然而，病毒感染引起LOHC的结论目前仅仅建立在LOHC患者同时存在病毒血症和/或病毒尿症，或膀胱粘膜上皮细胞可检测到病毒存在的基础上，至于病毒感染如何导致LOHC发生仍没有确切证据。另外，并不是所有病毒尿症、病毒血症患者均发生LOHC，而且在临床过程中，病毒血症或病毒尿症的清除并不一定使LOHC症状缓解。因此，HC可能尚存在其他致病因素。故对于LOHC患者，现仍无统一有效的治疗方案，一般仍以水化、碱化及支持治疗为主。像高压氧、膀胱内注射rhGM-CSF或透明质酸甚至膀胱切除等治疗均有有效报道，但并未得到一致肯定。难治性LOHC仍是造血干细胞移植领域的亟待解决的难题之一。

Leung等曾研究发现，自体造血干细胞移植和异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后患者尿BK病毒水平及高峰均相似，但LOHC仅发生在allo-HSCT患者，这说明BK病毒感染或许仅是HC发生的先决条件，而造血重建过程中的异基因免疫在HC发生中可能起到重要促进作用。

发明内容

本发明的目的是提供抗CD19的抗体和抗CD5的抗体的新用途。

本发明保护抗CD19的抗体和抗CD5的抗体在制备检测糖皮质激素和抗病毒药物对迟发性出血性膀胱炎疗效的试剂中的应用。

常用的糖皮质激素均可采用，如强的松、地塞米松、甲基强的松龙等。

常用的抗病毒药物均可采用，如磷甲酸钠、更昔洛韦等。

所述抗CD19的抗体可为商购的单克隆抗体或体外培养分泌抗CD19的单克隆抗体的杂交瘤细胞得到的单克隆抗体，如购自美国BD Biosciences公司产品目录号为340437的单克隆抗体。

所述抗CD5的抗体可为商购的单克隆抗体或体外培养分泌抗CD5的单克隆抗体的杂交瘤细胞得到的单克隆抗体，如购自美国BD Biosciences公司产品目录号为341089的单克隆抗体。

CD19+CD5+B淋巴细胞是人体“天然抗体”的重要来源，这些“天然抗体”为低亲和力的IgM抗体，具有多反应性，被认为是抵御病毒或细菌感染的第一道防线。这些抗体的多反应性也可识别自身抗原，在体内凋亡细胞的清除中起到重要作用。但这些抗体的自身反应性被认为与自身免疫病的发生相关，并且CD19+CD5+B淋巴细胞还可产生高水平IL-10，同时可增强抗原提呈能力。在人类和动物模型中，均证实了循环中CD19+CD5+B淋巴细胞增加与自身免疫病的密切关系。本发明发现，随着LOHC的持续，部分抗病毒无效的患者CD19+CD5+B细胞比例明显升高，而予激素治疗后，治疗有效的患者大多为CD19+CD5+B细胞比例升高者。激素治疗后，激素治疗有效组患者CD19+CD5+B细胞比例较治疗前显著下降，恢复至发病时水平，无效患者于治疗前后无显著差异。对于激素治疗后达PR，但激素减量过程中LOHC症状再次加重的患者，或激素治疗后达CR，但激素减量后复发的患者，监测其CD19+CD5+B细胞比例仍可发现其与症状相关的升高，再次予激素治疗后症状好转的同时CD19+CD5+B细胞比例下降至最初发病时水平。

本发明中对水化、碱化及抗病毒治疗均无效的LOHC患者，采取了糖皮质激素治疗，观察其治疗反应，同时监测患者发病过程不同阶段外周血B淋巴细胞亚群变化，探讨其与激素治疗反应间的关系。结果发现大部分病人对激素治疗有反应，并且糖皮质激素的疗效与CD19+CD5+B细胞亚群比例明显相关。迟发性出血性膀胱炎患者如果在某一阶段中CD19+CD5+B细胞亚群占总B细胞的比例显著高于发病时CD19+CD5+B细胞亚群占总B细胞的比例(较发病时升高倍数中位值2.45倍，百分比中位值为24.26％)，提示糖皮质激素辅助治疗可以取得比较好的疗效。而没有明显升高者，则提示激素治疗效果不好。本发明对于迟发性出血性膀胱炎患者的治疗具有重大意义。

附图说明

图1(A)为步骤一治疗结束评估疗效时(即B、C组步骤二开始前)的A、B、C三组CD19+CD5+B细胞亚群比例；图1(B)为不同检测时间点(发病24小时内，步骤一治疗结束时(即B、C组步骤二开始前)，B、C组加激素后1周，A、B组CR时)CD19+CD5+B细胞亚群比例。

图2为B组CD19+CD5+B细胞亚群比例发病过程中的变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为数量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

HC分级(WHO标准)：I度：镜下血尿；II度：肉眼血尿；III度：肉眼血尿伴血块；IV度：肉眼血尿伴血块、尿道堵塞。

疼痛分级法(VRS)：0级：无痛；1级(轻度)：虽有疼痛但可以忍受，能正常生活，睡眠不受干扰；2级(中度)：疼痛明显，不能忍受，要求服用止痛剂，睡眠受到干扰；3级(重度)：疼痛剧烈，不能忍受，需要止痛药，睡眠受到严重干扰，可伴有植物神经紊乱或被动体位。

临床疗效评估(部分缓解和完全缓解均视为治疗有效)：

部分缓解(PR)：患者有症状好转的明确证据(如尿频患者每日排尿次数减少25％；尿痛分度下降；尿急消失)和/或II度以上膀胱炎级别下降。

完全缓解(CR)：血尿和尿路刺激症状(尿频、尿急、尿痛)消失，且之后超过一周未复发。

治疗失败：尿路刺激症状(尿频、尿急、尿痛)和血尿无改善甚至加重，或仅暂时改善。

以下实施例的整个治疗过程中，患者每天均进行水化和碱化。水化：静脉输液加饮水量达到3L·m^-2·d^-1。碱化：II-IV度膀胱炎患者每8小时或6小时静脉输注80ml 5％(质量百分含量)碳酸氢钠溶液，膀胱炎降至I度时改为每12小时静脉输注80ml 5％(质量百分含量)碳酸氢钠溶液或每日口服三次碳酸氢钠片(每次1g)；I度膀胱炎患者每12小时静脉输注80ml 5％(质量百分含量)碳酸氢钠溶液或每日口服三次碳酸氢钠片(每次1g)。

病原学检测：聚合酶链反应(PCR)方法检测血及尿中巨细胞病毒(CMV)、腺病毒(ADV)、EB病毒(EBV)抗原水平。血、尿只要有一个阳性，都视为阳性。

抗病毒治疗：更昔洛韦(5mg·kg^-1·d^-1)或磷甲酸钠(80-120mg·kg^-1·d^-1)；实施例中采用的给药方式为注射。

糖皮质激素治疗：给予强的松或地塞米松或甲基强的松龙，给药剂量见实施例；实施例中采用的给药方式为口服给药或静脉注射均可。

25例首次发生且未进行任何治疗的迟发性出血性膀胱炎(LOHC)患者，其中按预定方案处理的LOHC患者为24例(依次进行步骤一和步骤二的治疗)，因合并急性移植物抗宿主病(aGVHD)未按预定方案处理的LOHC患者为1例(直接进行步骤三的1的治疗)。

实施例、

25例确诊LOHC患者中，24例按预定流程处理。

由于初次病原学检测中，所有患者中只有9例CMV阳性，其余均为阴性，所以之后的病原学检测仅检测CMV。

一、抗病毒治疗

24例患者进行抗病毒治疗(17例给予磷甲酸钠；7例给予更昔洛韦)。第一周进行两次病原学检测：两次均为阴性的患者抗病毒治疗10-14天(每周进行两次血CMV病原学检测)，然后进行疗效评估；出现阳性结果的患者持续进行抗病毒治疗(每周进行两次病原学检测)，直至连续两次结果均为阴性，进行疗效评估。

24例患者中，6例患者抗病毒治疗有效，18例患者抗病毒治疗无效。治疗有效的患者作为A组；4例为给予磷甲酸钠的患者，2例为给予更昔洛韦的患者。

对于治疗有效的患者，继续进行抗病毒治疗至CR。A组中，中位起效时间为7.5天；最终5例患者达到CR，LOHC中位持续时间为19天(12-30天)；1例患者达到PR，但持续21天后加重至III度，至患者血液病复发死亡，膀胱炎持续。

二、糖皮质激素联合抗病毒治疗

对于抗病毒治疗无效的18例患者，进行糖皮质激素联合抗病毒治疗(即在原有抗病毒治疗的基础上，进行糖皮质激素治疗；糖皮质激素与抗病毒药物同时给药)。糖皮质激素治疗过程如下：

疗程一：体重＜50Kg，予地塞米松0.15mg/Kg·d；体重≥50Kg，予地塞米松7.5mg/d；地塞米松均可等量换算为强的松或甲基强的松龙，静脉或口服给药均可。7-10天后评估疗效；

疗程二：疗程一结束后，糖皮质激素减量：体重＜50Kg，予地塞米松0.1mg/Kg·d；体重≥50Kg，予地塞米松5mg/d。有效者每7天减原量的约1/3，至约地塞米松0.75-1mg/d一周后可直接停用；如激素减量过程中LOHC症状持续不好转或加重，可延缓减激素速度，如2周减量一次，或每周减原剂量的1/4-1/5；激素治疗无效者每3-5天减原量的约1/3-1/2，至地塞米松0.75-1.5mg/d一周后可直接停用。

疗程一结束时的评估疗效结果：15例患者治疗有效。治疗有效的患者划入B组；10例为继续给予磷甲酸钠的患者，5例为继续给予更昔洛韦的患者。B组中，加糖皮质激素至起效中位时间为3天(1-8天)；13例患者达CR，加糖皮质激素至达CR的中位时间为11天(6-23天)；2例患者达PR。

2例达PR的患者，分别在糖皮质激素减量至每日地塞米松3mg、0.75mg时，I度膀胱炎加重为II度，均再次予加糖皮质激素(地塞米松7.5mg/天)治疗，结果分别在糖皮质激素加量后3天、2天开始好转，分别在第2次糖皮质激素加量后7天、11天达到CR。

3例患者治疗无效。治疗无效的患者作为C组，均为继续给予磷甲酸钠的患者。

三、对合并aGVHD患者或复发患者进行治疗

1、对合并aGVHD患者进行治疗

1例患者发病时合并aGVHD，直接进行糖皮质激素联合抗病毒治疗(给予磷甲酸钠)，方法同步骤二，治疗7天起效，18天后达到CR，将其划入B’组。

2、对合并aGVHD患者或复发患者进行治疗

对于步骤一和步骤二中达到CR的患者，随访1-6个月，观察患者的复发情况。

B组2例患者复发，对其进行病原学检测，结果均为阴性。对该两个复发患者进行糖皮质激素治疗(未再抗病毒)，均在加糖皮质激素24小时内起效，7天达CR(此次LOHC为B’组)。

C组1例患者抗病毒及抗病毒联合治疗无效，因肾毒性停用抗病毒药物，仅采用水化、碱化及输血支持治疗，III度LOHC持续2月余后CR。CR持续17天后复发，复发时伴CMV血症，予抗病毒(磷甲酸钠)治疗，至病毒转阴后，膀胱炎未缓解；遂进行糖皮质激素联合抗病毒(磷甲酸钠)治疗，方法同步骤二，治疗7天起效，9天后达CR，该患者也划入B组。

根据步骤一至步骤三中患者的治疗情况，除去发病时合并aGVHD的患者，剩余的24例患者可根据不同阶段的疗效分为三组：

A组：步骤一的抗病毒治疗中，治疗有效的6例患者。

C组：步骤二的糖皮质激素联合抗病毒治疗中，治疗无效的3例患者。

B组：步骤二的糖皮质激素联合抗病毒治疗中，治疗有效的15例患者；和C组中复发后治疗有效的1例患者。

A、B、C三组患者的临床信息见表1。

表1患者的临床信息

表1中：采用Mann-Whitney’s U检验，组间比较均采用Mann-Whitney’s U检验，P值均＞0.05。＊Mean±s.d. # Median(range)；HSCT＝造血干细胞移植。

四、步骤一至三中的流式细胞仪检测

LOHC发病24小时内留取患者肝素抗凝外周血(每例患者留取4ml)，进行流式细胞仪检测。治疗过程中：每周留取患者肝素抗凝外周血(每例患者留取4ml)，直至LOHC达CR；另外，糖皮质激素治疗前、糖皮质激素治疗后1周、PR、CR或治疗过程中病情再次加重、复发时也留取肝素抗凝外周血(每例患者留取4ml)，进行流式细胞仪检测。如增加检测时间点与常规每周检测时间点相差≤1天，仅留取一次外周血。流式细胞仪检测内容：以CD19+细胞占淋巴细胞百分比代表总B细胞，CD19+CD5+/CD19+代表CD19+CD5+B细胞占总B细胞的比例，D19+CD23+/CD19+代表CD19+CD23+B细胞占总B细胞的比例，CD19+CD27+/CD19+代表CD19+CD27+B细胞占总B细胞的比例。4种单克隆抗体中3种购自美国BD Biosciences公司，包括：APC标记的抗CD19单抗(产品目录号340437)；PerCP-CY5.5标记的抗CD5单抗(产品目录号341089)；PE标记的抗CD23单抗(产品目录号341007)。FITC标记的抗CD27单抗购自美国eBioscience公司(产品目录号11-0279)。

1、糖皮质激素治疗中，治疗前CD19+CD5+B细胞亚群的比例与疗效密切相关

各组中，CD19+细胞百分比、D19+CD23+/CD19+、CD19+CD27+/CD19+的值见表2。

表2各组中，CD19+细胞百分比、D19+CD23+/CD19+、CD19+CD27+/CD19+的值

组间比较采用Mann-Whitney’s U检验，组内比较采用配对T检验，P值均＞0.05。

结果表明：各组之间及组内患者治疗前后等比较均无统计学差异。

步骤一治疗结束评估疗效时(即B、C组步骤二开始前)的A、B、C三组CD19+CD5+B细胞亚群比例见图1(A)。组间比较采用Mann-Whitney’s U检验，箱形图中黑色横线代表平均值。B组与A组、C组比较，CD19+CD5+B细胞亚群比例均有显著差异(P值分别为0.018、0.044)，B组的值显著大于A组、C组，而A组、C组比较差异无显著性。可见CD19+CD5+B细胞亚群的比例与糖皮质激素联合治疗的疗效密切相关。糖皮质激素联合治疗中，CD19+CD5+B细胞亚群的比例高的患者，治疗可以取得较好的疗效。

不同检测时间点(发病24小时内，步骤一治疗结束时(即B、C组步骤二开始前)，B、C组加激素后1周，A、B组CR时)CD19+CD5+B细胞亚群比例见图1(B)。组间比较采用Mann-Whitney’s U检验，组内比较采用配对T检验，箱形图中黑色横线代表平均值；白色条带代表A组(n＝6)，黑色条带代表B组(n＝16)，灰色条带代表C组(n＝3)。发病24小时内3组患者CD19+CD5+B细胞亚群的比例无明显差异；B组中，发病时与步骤一结束时比较，步骤一激素时CD19+CD5+B细胞亚群的比例(24.86％±15.30％)明显升高，较发病时(12.58％±14.70％)有显著差异(P＝0.022)。A组、C组中，发病时与步骤一结束时比较，CD19+CD5+B细胞亚群的比例没有显著差异。只有B组，后续的糖皮质激素联合治疗具有比较好的疗效。

2、激素治疗有效患者治疗后CD19+CD5+B细胞亚群比例下降

B组CD19+CD5+B细胞亚群比例发病过程中的变化见图2。采用配对T检验；箱形图中黑色横线代表平均值。与激素治疗前相比，B组患者激素治疗后达PR时其CD19+CD5+B细胞比例较治疗前显著下降(P＝0.003)，CR时较PR时进一步下降(P＝0.015)，PR及CR时较发病时则均无显著差异，而步骤一结束时(即步骤二开始前)较发病时显著升高。

分析B组2例PR后减糖皮质激素过程中再次加重的患者：其CD19+CD5+B细胞亚群的比例在第一次激素治疗前后均无明显变化，维持在发病时水平；但激素减量后再次加重时，CD19+CD5+B细胞亚群的比例较发病时明显升高，再次加糖皮质激素激素治疗后其CD19+CD5+B细胞水平亦随之下降，分别于CR后20天、43天降至发病时水平。

3、对复发者的检测和评价

B组2例复发者复发时CD19+CD5+B细胞亚群的比例分别为13.1％、26.82％，均较前次达CR时(分别为4.2％、4.04％)升高大于2.45倍，而糖皮质激素联合抗病毒治疗达到CR时，CD19+CD5+B细胞亚群的比例CR时均较加激素前下降(分别为4.42％、1.65％)。

综上所述，25例患者发生28次LOHC，抗病毒有效者(A组)6/28例次(21.43％)；对糖皮质激素联合抗病毒治疗有反应者(B组)19/28例次(67.86％)，其中16例次(B组)按预定流程处理，3例次(B’组)加糖皮质激素前未单独抗病毒治疗；对抗病毒及激素联合抗病毒治疗均无反应者(C组)3/28例次(10.71％)。