用于预防和治疗骨转移或其它骨疾病的制剂和方法

摘要

本发明涉及包封双膦酸盐的红细胞悬液，其用作用于预防和治疗骨转移及其它骨髓疾病的药物。本发明还涉及包封双膦酸盐的红细胞悬液，其中这些红细胞已用试剂如BS3进行过化学处理从而促进靶向骨髓。

说明书

技术领域

本发明涉及用于治疗骨转移及其它骨疾病的制剂和药物。本发明还涉及预防和治疗的方法。

背景技术

双膦酸盐(bisphosphonate)是焦磷酸盐(结构P-O-P)的合成类似物，其中中心氧原子被碳原子替代。其化学结构可以由下式表示：

双膦酸盐可分为两类。

第一类包括在其侧链R¹和R²中不包含氮原子的“第一代”化合物。该类特别包括依替膦酸盐(etidronate)、氯膦酸盐(clodronate)和替鲁膦酸盐(tiludronate)。

第二类包括在其侧链R¹或R²之一中包含一个或多个氮原子的“第二代”和“第三代”化合物。第二代的那些包含具有氮原子或末端NH₂基团的脂肪族侧链。可以提及的有帕米膦酸盐(pamidronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)和奈立膦酸盐(neridronate)。第三代的那些具有包含氮原子的杂环核。可以提及的有利塞膦酸盐(risedronate)和唑来膦酸盐(zoledronate)(咪唑核)。

作为第一代、第二代和第三代的这种分类是本领域技术人员完全已知的。作为举例说明，可以提及的有T.Yuasa等，Current Medical Chemistry 2007，14：2126-2135和Selvaggi等，Crit.Rev.Oncol.Hematol.2005，56(3)：365-378；V.Stresing等，Cancer Letters 2007，257：16-35；R.Graham G.Russell等，Ann.N.Y.Acad.Sci.2007，1117：209-257。

在晚期癌症的情况下，骨转移是常见的。它们最常见于多发性骨髓瘤、乳腺癌和前列腺癌中，但也存在于黑素瘤和膀胱癌、肺癌和肾癌的情形中。

在对骨癌患者进行的治疗性处理中，双膦酸盐是必需的。因此，使用氯膦酸盐、帕米膦酸盐、唑来膦酸盐和伊班膦酸盐。

然而，双膦酸盐在高剂量下可以是有毒的。它们还可经历相当程度的肾清除。例如，对于唑来膦酸盐而言，通过肾脏进行的清除产生肾毒性，使得必须对人临床使用的剂量进行小心监督，可发现它们低于治疗骨转移的有效剂量。因此，唑来膦酸盐的临床剂量是在动物中测定的有效剂量的10至40分之一(J.Green，Oncologist 2004，9：3-13)。

L.Rossi等(Journal of Drug Targeting，February 2005，13(2)：99-111)描述了将氯膦酸盐包封在红细胞中，以及其用于耗尽巨噬细胞的用途。他们还描述了在乙醇胺和牛血清白蛋白的存在下，用ZnCl₂和BS3处理红细胞。该作者证实了小鼠中脾巨噬细胞的耗尽。该研究既没有涉及也没有预计红细胞作为双膦酸盐载体在骨应用中的用途。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提出用于在骨髓水平递送双膦酸盐的溶液，从而限制肾清除和避免目前限制这些活性成分效力的毒性问题。

本发明的一个目的也是提出这样的溶液，其可增加骨髓水平的双膦酸盐的生物利用度。

本发明的一个目的也是提出这样的溶液，与游离形式相比，其可降低对于给定治疗而言所施用的双膦酸盐的量。

本发明的一个目的也是提出这样的溶液，其可增加可施用剂量，而不会遇到游离形式之毒性的限制问题。

因此，本发明的一个主题是包封双膦酸盐的红细胞悬液，其用作靶向骨髓和使所述双膦酸盐进入骨髓、限制或甚至清除任何毒性(特别是肾毒性)风险的药物。

本发明的一个主题还是包封双膦酸盐的红细胞悬液，其用作使双膦酸盐进入骨髓的载体，特别是用于治疗或预防骨疾病如骨转移。

根据定义，术语“双膦酸盐”涵盖所有的双膦酸类及其盐和衍生物，特别是第一代、第二代和第三代的双膦酸类及其盐和衍生物。因此，该术语涵盖双膦酸盐、双膦酸(biphosphonic acid)和二膦酸(diphosphonic acids)。

双膦酸盐的非限定性实例包括：依替膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、帕米膦酸盐(特别是二钠形式的帕米膦酸盐)、阿仑膦酸盐、伊卡膦酸盐、伊班膦酸盐、奈立膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐。

优选地，本发明使用包含至少一个氮原子的双膦酸盐，例如第二代和第三代双膦酸盐。特别地，对于第二代，选择以下化合物：帕米膦酸盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐和奈立膦酸盐。第三代的那些具有包含氮原子的杂环核。应当提及的有利塞膦酸盐和唑来膦酸盐(咪唑核)。

本发明特别涉及包封双膦酸盐的红细胞悬液，其用作用于预防和治疗表明可以应用双膦酸盐的骨和骨髓病变的药物。可提供治疗靶向病变的最佳剂量，至于治疗方案不再受到与游离形式的双膦酸盐相关毒性的限制。

因此，所述用途可涉及预防或治疗骨转移、恶性高钙血症、佩吉特病和骨质疏松症。

更特别地，本发明为包封双膦酸盐的红细胞悬液，其用作用于预防和治疗骨转移的药物。

本发明还涉及包含包封双膦酸盐的红细胞悬液的药物，其用作用于预防和治疗这些骨或骨髓疾病特别是骨转移的药物。

本发明还涉及包封双膦酸盐的红细胞悬液在制备用于预防和治疗这些骨或骨髓疾病特别是骨转移的药物中的用途。

本发明还涉及包封双膦酸盐的红细胞悬液，其用作使双膦酸盐进入骨髓的载体，用于治疗或预防骨转移。

优选地，双膦酸盐的包封通过称为裂解-再封(lysis-resealing)的方法进行。

所述双膦酸盐通常在pH为7.2至7.6、优选7.4的缓冲溶液(例如PBS)中制备。

根据该方法的一个特征，首先，通过使红细胞接受低渗条件来进行红细胞的裂解。红细胞膨胀，开孔。然后，加入双膦酸盐，其渗透到红细胞的内部。优选地，逐渐加入双膦酸盐溶液，然后，将该混合物孵育例如10到60分钟，通常为约30分钟。接着，重建等渗条件，从而再封或再闭合所述孔，使得红细胞稳定地包封双膦酸盐。

根据本发明的一个有利的特征，在促进靶向骨髓的情况下，用化学试剂处理红细胞。该化学试剂促进对骨髓的吞噬细胞(巨噬细胞和树突细胞)的识别。

所述化学处理针对包封双膦酸盐的红细胞进行。

一种适于人临床使用的优选的化学试剂是双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(bis(sulphosuccinimidyl)suberate)，缩写为BS3或BS³；CAS82436-77-9)。有利地使用该试剂的溶液。

本发明的一个目的还是红细胞悬液或包含该悬液的药物，所述悬液包含包封双膦酸盐的红细胞以及膜，该膜已使用化学试剂(优选BS3)处理过，以便促进被骨髓的吞噬细胞所识别。BS3优选单独使用，不包含任何其它化学试剂或生物制剂，比如ZnCl₂。根据第一个实施方案，所述双膦酸盐是第一代双膦酸盐。根据第二个实施方案，所述双膦酸盐是第二代双膦酸盐。根据第三个实施方案，所述双膦酸盐是第三代双膦酸盐。双膦酸盐的非限定性实例包括：依替膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、帕米膦酸盐(特别是二钠形式的帕米膦酸盐)、阿仑膦酸盐、伊卡膦酸盐、伊班膦酸盐、奈立膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐。根据一个实施方案，所述双膦酸盐选自：依替膦酸盐、替鲁膦酸盐、帕米膦酸盐(特别地是二钠形式的帕米膦酸盐)、阿仑膦酸盐、伊卡膦酸盐、伊班膦酸盐、奈立膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐。

根据用BS3处理的方法的一个特征，使包封双膦酸盐的红细胞悬液与BS3接触合适的一段时间，其可以特别地为约10分钟至约1小时。该时间段有利地为约15分钟至约45分钟，优选约20至约40分钟，典型地为30分钟的水平。

根据用BS3处理的方法的另一个特征，所述孵育优选地在环境温度下，特别是18至25℃的温度下进行。

根据用BS3处理的方法的另一个特征，用合适的缓冲剂例如PBS预洗涤包含双膦酸盐的红细胞悬液。

根据另一个特征，在用BS3溶液接触之前，使利用BS3处理的红细胞悬液的浓度为约0.5×10⁶至约5×10⁶个细胞/μl，通常为约1×10⁶至约3×10⁶个细胞/μl。

根据另一个特征，使用BS3的溶液来获得BS3在所述悬液中的最终浓度为约0.1至约6mM，优选约0.5至约3mM，通常为约1mM。特别地可以使用约2mM的BS3溶液。优选地，使用优选地包含葡萄糖和磷酸盐缓冲剂的BS3缓冲溶液以获得期望的BS3最终浓度，特别地为约1mM。根据一个特征，所述BS3缓冲溶液的pH有利地为约7.2至约7.6，优选约7.4。根据另一个特征，所述BS3缓冲溶液的摩尔渗透压浓度为约280至约320mOsm。

所述孵育可以通过使用试剂(如Tris-HCl)来终止，然后离心该混合物，洗涤细胞，并将其重悬于合适的缓冲液如SAG-BSA中。在离心之前，将该混合物在环境温度下孵育几分钟，特别是1至10分钟。

所述悬液可以是即用型的(ready for use)，并且可具有适于无需稀释而施用的血细胞比容。

其也可以按照在施用前必须进行稀释的方式包装。

根据本发明，所述即用型悬液的血细胞比容有利地为约40％至约70％，优选约45％至约55％，更优选约50％。

在其用于稀释的形式中，血细胞比容可以高，特别地为约60％至约90％。

所述悬液优选地包装成约10至约250ml的体积。所述包装优选地为适于输血类型的血袋。对应于医学处方的包封量的双膦酸盐优选全部包含在血袋中。

例如，对应于一个剂量(例如一个血袋)的悬液包含1至40mg的双膦酸盐，特别是2至10mg的双膦酸盐。

根据本发明的一个特征，将待施用的红细胞悬于可药用盐水溶液(例如红细胞的标准介质，特别是包含NaCl和一种或多种选自葡萄糖、右旋糖、腺嘌呤和甘露醇的成分(例如SAG-甘露醇或ADsol)的溶液)中。该溶液能够保存红细胞，并且还可包含防腐添加剂，例如L-肉碱。

因此，本发明的目的是一种预防或治疗骨转移或其它骨疾病的方法。该方法包括向患者施用根据本发明的制剂或药物。

根据本发明，所述制剂或药物的施用是通过静脉内或动脉内注射进行的，优选地通过从血袋等滴注。所述施用通常在臂部静脉内或通过中心导管(central catheter)进行。

特别地施用约10至约250ml的本发明制剂(一个剂量)。从50ml以上，优选使用滴注。

治疗包括根据已确定的方案施用一个剂量或几个剂量。所述方案可提供以在所推荐疗程中每月一次、每两月一次、每三月一次、每半年一次(semestrial)或每年一次的频率进行数次施用。

将活性成分包封在红细胞中的技术是已知的，本文优选的裂解-再封的基本技术描述在本领域技术人员可以参考的专利EP-A-101 341和EP-A-679 101中。根据该技术，向透析元件(例如透析袋或透析筒)的第一个隔室连续地供给红细胞悬液，而第二个隔室则包含相对于红细胞悬液低渗的水溶液，以便裂解红细胞；接着，在再封单元中，在双膦酸盐存在下，通过升高渗透压和/或胶体渗透压诱导红细胞再封，然后，回收包含双膦酸盐的红细胞悬液。根据本发明的一个特征，优选进行已包含待包封的双膦酸盐的红细胞悬液的裂解。

包封双膦酸盐的红细胞悬液可以特别地通过下述方法获得，所述方法也是本发明的一个主题：

1-将红细胞沉淀(pellet)悬于血细胞比容水平大于或等于65％的等渗溶液中，在+1至+8℃之间冷却，

2-恒定地保持在+1至8℃温度下的裂解步骤，包括使血细胞比容水平大于或等于65％的红细胞悬液和已冷却至+1至+8℃的低渗裂解溶液进入透析袋或透析筒(优选透析筒)，

3-包封步骤，在保持在+1至+8℃的温度下，向裂解的悬液中加入(优选逐渐加入)双膦酸盐溶液，优选地，孵育期特别地为10至60分钟，通常为约30分钟，和

4-在较高的温度(特别是+30至+42℃)下和在高渗溶液的存在下，进行再封步骤。

作为一个优选的变化形式，可以从WO-A-2006 016247中描述的方法得到启发，其使得可有效、可再重现、安全和稳定地包封双膦酸盐。因而，包封双膦酸盐的红细胞悬液可以通过下述方法获得，其也是本发明的一个主题：

1-将红细胞沉淀悬于血细胞比容水平大于或等于65％的等渗溶液中，在+1至+8℃之间冷却，

2-使用来自相同红细胞沉淀的红细胞样品测量渗透脆性，对于步骤1和2而言可按照任何顺序(包括平行)进行，

3-裂解步骤，特别地在同一室内，在恒定地保持在+1至+8℃的温度下，包括使血细胞比容水平大于或等于65％的红细胞悬液和已冷却至+1至+8℃的低渗裂解溶液通过进入透析袋或透析筒(优选透析筒)内；将裂解参数调节为之前测量的渗透脆性的函数，和

4-包封步骤，在保持在+1至+8℃的温度下，向裂解的悬液中加入(优选逐渐加入)双膦酸盐溶液，优选地，孵育期特别地为10至60分钟，通常为约30分钟，以及

5-在较高的温度(特别是+30至+42℃)下和在高渗溶液的存在下，在第二室中进行再封步骤。

术语“内化”(“internalization”)意指双膦酸盐渗透到红细胞内部。

特别地，对于透析而言，将红细胞沉淀悬于大于或等于65％、优选大于或等于70％的高血细胞比容水平的等渗溶液中，并且将该悬液冷却至+1至+8℃，优选+2至+6℃，通常约+4℃。根据一个特别的实施方案，所述血细胞比容水平为65％至80％，优选70％至80％。

当测量时，在悬液中存在或不存在双膦酸盐的情况下，恰好在裂解步骤之前，有利地测量红细胞的渗透脆性。红细胞或包含其的悬液有利地处在接近或等同于所选用于裂解的温度。根据本发明的一个有利的特征，快速进行渗透脆性的测量，即，在采集样品之后不久立即进行所述裂解步骤。优选地，采集样品和开始裂解之间的时间段小于或等于30分钟，甚至更优选地小于或等于25分钟，甚至小于或等于20分钟。

关于其中进行裂解-再封步骤的方法、关于所测量和考虑的渗透脆性，本领域技术人员可以参照WO-A-2006/016247以获得进一步详细描述。该文件通过引用并入本文。

现在通过作为非限定性实施例的实施方案，更加详细地描述本发明。

I-实施例1：将唑来膦酸盐包封在小鼠和人红细胞中的方法

Ia-材料：

对于透析：透析筒(Gambro 280纤维)

测定：在根据下述方法制备样品之后，通过高效液相色谱法(HPLC)进行红细胞中唑来膦酸盐的测定。用2.5体积的水裂解包封唑来膦酸盐的红细胞(RBC)，然后，通过用12％三氯乙酸沉淀蛋白质和膜来萃取唑来膦酸盐。

为了评估已被包封的唑来膦酸盐的量，测定红细胞(包封前)、用BS3处理或未处理的最终产品RBC-Zol和RBC-LR，以及在D0和D1时的其上清液。

为了提高唑来膦酸盐在C18载体上的保留时间，使用化合物四丁基硫酸氢铵作为离子对试剂。

仪器：Shimadzu UFLC

柱：Gemini C185μ110A 250×4.6mm ID

温度：40℃

注射体积：40μl

UV检测：220nm

流速：0.7ml/分钟

流动相A：8mM K₂HPO₄-(1.39g/l)，2mM Na₂HPO₄-(0.1g/l)，7mM四丁基硫酸氢铵-(2.7g/l)

流动相B：甲醇

Ib-方法：

将红细胞离心，然后在PBS中洗涤三次。用PBS使悬液的血细胞比容达到70％，之后开始透析。针对低摩尔渗透压裂解缓冲液以2ml/分钟的流速((逆流15ml/分钟)透析RBC。将离开柱的裂解的RBC分成两个相等的体积。将溶液(0.8mg/ml的唑来膦酸)逐渐加入(十次)到一体积的透析红细胞中，达到0.4mg/ml的最终浓度。

作为对照，用逐渐加入的一体积的PBS稀释另一体积的透析红细胞。在4-8℃下孵育两种悬液30分钟。

通过加入高摩尔渗透压的溶液(0.1体积)再封所述红细胞，并在37℃下培养30分钟。在含有葡萄糖的PBS中洗涤所述再封的细胞三次。用补充有或未补充有BSA(6％)的SAG-甘露醇或者包含葡萄糖的PBS使悬液的血细胞比容达到50％，或者直接以高血细胞比容(80％)贮存所述悬液，以便构成最终产品RBC-Zol(唑来膦酸盐)和RBC-LR(没有唑来膦酸盐的裂解-再封对照)。

II-实施例2：用双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS³)对包含唑来膦酸盐的红细胞进行化学处理

如实施例1所述获得包含唑来膦酸盐的红细胞悬液。将该悬液洗涤几次，之后稀释至1.7×10⁶个细胞/μl，接着，使其与2mM的BS³溶液接触(所述BS³溶液包含50mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和0.09％的葡萄糖)，以获得1mM的BS³最终浓度。在环境温度下孵育该红细胞30分钟，然后，通过加入一体积的20mM Tris、140mM NaCl来终止反应。在离心5分钟之后，用含有葡萄糖的PBS洗涤红细胞一次，然后用补充有或未补充有BSA(6％)的SAG-甘露醇洗涤一次。在补充有或未补充有BSA(6％)的SAG-甘露醇或含有葡萄糖的PBS中，使所述红细胞的血细胞比容达到50％，或者将其直接以高血细胞比容(80％)贮存。

III-实施例1和2的结果：

a)在人RBC中的包封

下表给出了对用人红细胞(RBC浓缩袋)进行的4个包封实验的评价。

在D1时对最终产品RBC-Zol的分析获得的细胞数据(表1)证实负载的RBC保持了接近于袋RBC的细胞特征，并且没有经受任何特别的损伤。

表1：

红细胞的血红蛋白浓度(MCHC)仍然令人满意，其值大于25g/dl。这证明在该方法期间红细胞内含量损失很小。细胞外血红蛋白低于2g/dl，因此，所获得的最终产品具有可注射的性质。1mM BS3组的收率导致细胞损失17％。然而，最终产品的整体细胞产率都与工业生产相适应(＞55％)。

与所述袋的红细胞的平均红细胞体积(MCV)(97μm³)相比，透析步骤导致RBC-Zol红细胞的平均红细胞体积降低(80-88μm³)。

有关包封唑来膦酸盐的数据在表2中给出。

表2

唑来膦酸盐具有包封在RBC中的临界尺寸，所要观察的最重要标准是与细胞外的比例相比，在D1时包封在RBC中的化合物的量。在没有对红细胞膜进行特别处理的情况下进行了三次实验，结果表明在D1时唑来膦酸盐的包封令人满意(最终产品中68％到83％的唑来膦酸盐包封在RBC中)。采用BS3处理，包封率为71％。

表3显示了有关包含唑来膦酸盐的人红细胞的稳定性数据。在制备的当天(D0)和第二天(D1)，测量细胞外的血红蛋白、悬液的血细胞比容以及细胞内和细胞外唑来膦酸盐的量。

观察到D0至D1之间细胞外唑来膦酸盐的增加。这可能与D0至D1之间细胞外血红蛋白的增加以及细胞损失(血细胞比容率)有关。因此，唑来膦酸盐向细胞外介质中的释放基本上来自透析后没有适当再封的红细胞的破裂，而不是来自通过红细胞膜的被动或主动渗透。结果表明在各种条件下均贮存良好。

b)在小鼠RBC中的包封

下表给出了对用小鼠红细胞(全血)进行的3个包封实验的评价。如同对人RBC一样，RBC-Zol保持了接近于全血的细胞特征。

表4

红细胞血红蛋白浓度(MCHC)非常令人满意。细胞外血红蛋白高于人RBC的情形，因为小鼠红细胞脆性更大。透析过程得到RBC-Zol红细胞的平均红细胞体积(43-46μm³)，其在不同实验间是一致的。

表5显示了有关小鼠RBC包封唑来膦酸盐的数据(在D1时测量)。最终悬液为血细胞比容为80％的浓悬液。

表5

结果表明在D1时的包封令人满意。

V-实施例3：用BS³处理靶向骨髓的证实：

通过在柱中的低渗透析方法，将荧光染料FITC-葡聚糖(70kDa)包封在小鼠红细胞(OF1小鼠)中。预离心血液，然后在PBS中洗涤3次。在所加最终浓度8mg/ml的FITC-葡聚糖的存在下，使血细胞比容达到70％，之后开始透析。针对低摩尔渗透压浓度的裂解缓冲液以流速2ml/分钟((逆流15ml/分钟)透析RBC。通过加入高摩尔渗透压浓度的溶液再封离开柱的裂解的RBC，并且在37℃下孵育30分钟。在含有葡萄糖的PBS中洗涤两次之后，将RBC稀释至1.7×10⁶个细胞/μl，之后使其接触包含50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和0.09％葡萄糖的10mMBS³溶液。在环境温度下孵育所述红细胞30分钟，然后，通过加入一体积的20mM Tris、140mM NaCl来终止反应。在离心5分钟之后，用含有葡萄糖的PBS洗涤RBC一次，然后用补充有BSA(6％)的SAG-甘露醇洗涤一次。使红细胞的血细胞比容达到50％，以便构成最终产品，在D1时，将所述最终产品注射到小鼠中。在注射后1小时30分钟，处死小鼠，接着，将从股骨分离的骨髓放置到Tissue-Tek中，用于在液氮中冷冻。切成10μm的冰冻切片进行免疫组织化学分析。在丙酮中固定之后，进行双标记，证实为FITC(DAB，褐色)和F4/80巨噬细胞(新品红，红色)。

在显微镜下对切片的观察表明巨噬细胞和葡聚糖共存(colocalization)。观测结构证实巨噬细胞通过红细胞的吞噬作用引入了葡聚糖。

流式细胞仪分析(FC500Beckman Coulter)给出了下述信息。

表6：在将RBC静脉内注射到小鼠之后1小时30分钟骨髓中荧光细胞的百分数

  处理  总荧光细胞数  RBC-葡聚糖  5.3％  RBC-葡聚糖-BS3  7.4％

流式细胞计数分析表明，在注射后1小时30分钟，在BS3处理和未处理的情形中，约7％和5％的骨髓细胞有荧光。

表7显示已吞噬了处理或未处理的红细胞的吞噬细胞的百分数。

  处理  F4/80巨噬细胞  树突细胞  RBC-葡聚糖  5.2％  7.9％  RBC-葡聚糖-BS3  9.5％  16.3％

与不进行处理相比，BS3处理通过骨髓中RBC的吞噬作用诱导更快更多的摄取。

结论

·唑来膦酸盐可稳定地包封在RBC中，所述RBC可以已经用BS3膜进行处理或未处理。

·包封量在很大程度上与临床使用量相一致。包封实验(用1mMBS3处理)显示获得了包含56.1μg/ml唑来膦酸盐的最终产品。因此，需要给人输注约71ml的RBC-Zol以便获得4mg等同物。

·用1mM BS3处理可靶向骨髓细胞。

所有这些都证实了RBC作为唑来膦酸盐靶向骨髓之载体的用途及其在骨转移或其它骨疾病中的用途。