环介导恒温扩增技术快速检测链状亚历山大藻的方法

摘要

本发明涉及一种环介导恒温扩增技术快速检测链状亚历山大藻的方法，包括：(1)赤潮藻类的基因组DNA提取；(2)4条LAMP扩增引物：LZ-F31：5’-GTTTAATGCAAAGTAGCTTTCA-3’；LZ-B31：5’-CTTCAGCTTGTCCCAGTT-3’；LZ-FIP1：5’-CATCCAGGTTCAATGCAAAACAT-ATTTAATGCTGATTAGCATTGTTG-3’；LZ-BIP1：5’-GTTTACAACCTAAACATGGTTTCGTGTGCACATTTACAAATATCAACC-3’；(3)LAMP扩增反应体系；(4)LAMP扩增产物的检测。本发明的LAMP检测方法具有操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对链状亚历山大藻快速鉴定和检测。

说明书

技术领域

本发明属链状亚历山大藻的DNA分子检测领域，特别是涉及一种环介导恒温扩增技术快速检测链状亚历山大藻的方法。

背景技术

近年来，我们沿海多次发生赤潮危害，对渔业造成巨大经济损失，对环境和生态平衡也造成严重的影响。

链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)是一种有毒赤潮藻类，可产生麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poison)等毒素，对浮游动植物、甲壳类、贝类、鱼类等的存活、繁殖和发育存在非常不利的影响，食用被这种赤潮藻污染的鱼和贝类则会直接威胁人类的健康。链状亚历山大藻在我国南北海域都具有分布，因此，严密检测该藻种是海洋检测工作中的重要内容。据此进行赤潮的预测预报，对于减少水产养殖业损失，保护海洋生态环境，有着重要的实际意义。

传统的链状亚历山大藻的鉴别检测方法是形态观察，依赖于细胞结构的显微观察，对操作者有较高的专业要求，而且由于藻类之间相似程度较高，环境对藻类的形态也有较大影响，此方法存在较大的局限性。

现代分子生物学的进步使得各种技术应用到藻类鉴定中，如核糖体序列分析、RFLP、RAPD、PCR鉴定、荧光原位杂交等，从一定程度上提高了检测的水平，降低了检测难度。其中应用于亚历山大藻的鉴定的有PCR鉴定、荧光原位杂交等。但PCR技术的最低检测极限仍较高，检测时间较长(3个小时左右)，而且需要精密的仪器。由于提取的藻DNA模板中含有多糖、蛋白质等，会抑制PCR反应，检测效果不理想。荧光原位杂交技术也可用于亚历山大藻的检测，但操作步骤繁琐，仪器要求和操作要求高，费用成本大，同样难以方便地加以应用。实时荧光定量PCR检测也是近年来微藻检测的一个方向，这种方法非常灵敏，所需时间也不长(大概一个多小时)，但是所需实验仪器(荧光定量PCR仪)价格昂贵，实验操作要求也较高。

日本学者Notomi等于2000年开发了一种新的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)下保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。此反应不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，而且结果判定简单，既可以利用仪器检测或肉眼观察核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀判定，也可以采用肉眼观察反应液的颜色变化来迅速判定。

这种技术已经广泛应用到病原菌检测方面，取得理想的检测效果。但迄今为止，尚未见将该技术应用于对链状亚历山大藻检测鉴别的相关文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种环介导恒温扩增技术快速检测链状亚历山大藻的方法，该方法具有操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对链状亚历山大藻快速鉴定和检测，在赤潮的预测预报中发挥强大作用。

本发明的一种环介导恒温扩增技术快速检测链状亚历山大藻的方法，包括：

(1)赤潮藻类的基因组DNA提取

(2)LAMP扩增引物

(3)LAMP扩增反应体系

(4)LAMP扩增产物的检测。

所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系所用试剂为：2.5uL 10×buffer(内含2mM的MgSO4)，2个内引物LZ-FIP1和LZ-BIP1的终浓度均为1.6μM，两个外引物LZ-F31和LZ-B31的终浓度均为0.2μM，反应体系中另外还包含6mM MgSO4，0.6mM dNTP，0.6M Betaine(Sigma-Aldrich)，8U Bst DNA聚合酶，1uL DNA模板(45ng)；

所述步骤(3)中的LAMP扩增反应体系的条件为：反应温度63℃，反应时间60min；

所述步骤(4)中的LAMP扩增产物检测，反应管内可见到大量白色沉淀产生则呈阳性；或加2μL 100×SYBR Green I于反应管中，反应管呈现绿色为阳性，反应管内颜色不变为阴性。

本发明针对链状亚历山大藻核糖体间隔区的6个区域设计了4条特异性引物，利用这组引物成功检测到链状亚历山大藻基因组DNA，并对其反应程序和反应体系进行了优化，建立起一种简单快速的微藻检测技术。

利用本实验优化体系对链状亚历山大藻进行了LAMP扩增，得到了理想的扩增产物，同时以其他7种藻类(环状异帽藻、微小亚历山大藻、米氏凯伦藻、利玛原甲藻、卡氏前沟藻、角毛藻、赤潮异湾藻)为阴性对照实验，只有链状亚历山大藻为特异性扩增，其他藻类呈现阴性反应。另外，对扩增终产物进一步进行酶切分析，并与以外引物F3和B3为引物PCR扩增的片段相比较，均与预期结果相吻合，说明本发明所设计引物为链状亚历山大藻的特异性引物。

有益效果

本发明的LAMP检测方法具有操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点，适合对链状亚历山大藻快速鉴定和检测，在赤潮的预测预报中发挥强大作用。

附图说明

图1为链状亚历山大藻LAMP检测电泳图；

图2为链状亚历山大藻LAMP检测SYBR Green I染色图；

其中，1，2两株链状亚历山大藻，3环状异帽藻，4赤潮异湾藻，5卡氏前沟藻，6利玛原甲藻，7角毛藻，8微小亚历山大藻，9米氏凯伦藻。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

链状亚历山大藻LAMP扩增引物的设计

(1)链状亚历山大藻的基因组DNA提取

把培养至对数期的链状亚历山大藻细胞液分装至2mL离心管，离心，倒掉上清，加入600μL提取液(100mmol/L Tris-Hcl，100mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2％CTAB，2％β-巯基乙醇)，65℃水浴1h。加入等体积PCI抽提液(体积比，苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，混匀，4℃，12500rpm离心10min。转移上清液至新离心管中，加入RNase至终浓度为1μg/mL，37℃放置30min。PCI重复抽提一次，4℃，12500rpm离心10min。把水相转移至新离心管中，加入2倍体积无水乙醇，室温下放置8-12min，静置沉淀DNA。在4℃，12500rpm离心20min。弃上清液，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次。DNA溶于无菌水，待用。

(2)PCR扩增引物设计及扩增后目标基因序列的获得

将步骤(1)提取到的链状亚历山大藻基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，以核糖体DNA转录单元内间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)为目标基因序列；

扩增引物为：

LH2：5’-AGGTGAACCTGCGGAAGGATC-3’；

Dlam：5’-CCTGCAGTCGACA(T/G)ATGCTTAA(A/G)TTCAGC(A/G)GG-3’；

分别对应于18S rDNA3’末端和24S rDNA 5’末端区域；

扩增体系：反应总体系为50μL，其中包括5μL 10×PCR反应缓冲液，4μL MgCl₂(25mmol/L)，0.4μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，2μL dNTP(2.5mml/L)，2μL基因组DNA(45μg/mL)，加ddH₂O补足体积。

扩增后的目的基因序列：

GCCAACTGCATGCTAATGATATTGTGGGCAACTGTAAGCATGTATTGCAATGGACTTGCACTTGCCCTGGGCAGCATGATTTGTTTTTCAAGCATGTGTGCTGTAGCGTGTGATGTGTTGTGTAAACTGTTTGCATTTCTCTAGTTGCTGCAACACTTATGTTTTGCAAGGAATGTCTTAGCTCAATAAATGATGAAGAATGCAGCAACATGCAATATGCATTGCGAATTGCAGAATTCCGTGAGCTAACAGATGTTTGAATGTTACTTGTACCTTTGGGATATTCTTGAAGGTTTGCTTGGTTTAATGCAAAGTAGCTTTCATATACATTTAATGCTGATTAGCATTGTTGTGAACAATAAAGGTCAATGTTTTGCATTGAACCTGGATGTCATACAGTTGTTTACAACCTAAACATGGTTTCGTGGGGCAGACCTGTTTCGTCATTTGATGGTTGATATTTGTAAATGTGCACAACTGGGACAAGCTGAAGACTTGCATATGCTAAGCGTGAAGTGAAGCACATAAACCCGCTGAATTTAAGCATCTGTCGACTGCAGGA；

(3)LAMP扩增引物设计

对上述测定的序列进行Blast分析后，找到转录单元内间隔区ITS1和ITS2，分别以ITS1和ITS2区为靶序列设计引物，用Primer Explorer V4设计引物：

实施例2

链状亚历山大藻与阴性对照实验

(1)赤潮藻类的基因组DNA提取

共包括8种藻类的DNA提取：链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)、环状异帽藻(Heterocapsa circularisquama)，赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)，卡氏前沟藻(Amphidinium carterae)，利玛原甲藻(Prorocentrum lima)，角毛藻(Chaetoceros sp.)，微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)，米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)。

把培养至对数期的8种藻类(链状亚历山大藻，环状异帽藻，赤潮异湾藻，卡氏前沟藻，利玛原甲藻，角毛藻，微小亚历山大藻，米氏凯伦藻)的藻细胞液分装至2ml离心管，离心，倒掉上清，加入600μL提取液(100mmol/L Tris-Hcl，100mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCl，2％CTAB，2％β-巯基乙醇)，65℃水浴1h。加入等体积PCI抽提液(苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，混匀，4℃，12500rpm离心10min。转移上清液至新离心管中，加入RNase至终浓度为1μg/mL，37℃放置30min。PCI重复抽提一次，4℃，12500rpm离心10min。把水相转移至新离心管中，加入2倍体积无水乙醇，室温下放置8-12min，静置沉淀DNA。在4℃，12500rpm离心20min。弃上清液，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次。DNA溶于无菌水，待用。

(2)LAMP扩增引物

(3)LAMP扩增反应体系

LAMP扩增反应体系为25uL，包括：2.5uL 10×buffer(内含2mM of MgSO4)，2个内引物LZ-FIP1和LZ-BIP1的终浓度均为1.6μmol/L，两个外引物LZ-F31和LZ-B31的终浓度均为0.2μmol/L，反应体系还包括6mmol/L MgSO4，0.6mmol/L dNTP，0.6mol/LBetaine(Sigma-Aldrich)，8U Bst DNA聚合酶，8种DNA模板各1uL，反应温度为63℃，反应时间为60min；

(4)LAMP扩增产物的检测

a.LAMP产物特异性扩增的确认

取2μL反应后的LAMP产物于1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察，可见只有链状亚历山大藻有梯状条带出现，其他微藻没有扩增条带(见图1)；

b.由于LAMP反应产生白色焦磷酸镁沉淀，可肉眼直接观察，在本方法中阳性反应管内可见到大量白色沉淀产生；或加2μL 100×SYBR Green I于反应管中，阳性反应管呈现绿色，而阴性反应管内颜色不变，仍为橙色(见图2)。

SEQUENCE LISTING

<110>中国水产科学研究院东海水产研究所

<120>环介导恒温扩增技术快速检测链状亚历山大藻的方法

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

gtttaatgca aagtagcttt ca    22

 

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

cttcagcttg tcccagtt         18

 

<210>3

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

catccaggtt caatgcaaaa catatttaat gctgattagc attgttg                 47

 

<210>4

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>4

gtttacaacc taaacatggt ttcgtgtgca catttacaaa tatcaacc                 48

 

<210>5

<211>562

<212>DNA

<213>链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)

 

<400>5

gccaactgca tgctaatgat attgtgggca actgtaagca tgtattgcaa tggacttgca    60

cttgccctgg gcagcatgat ttgtttttca agcatgtgtg ctgtagcgtg tgatgtgttg    120

tgtaaactgt ttgcatttct ctagttgctg caacacttat gttttgcaag gaatgtctta    180

gctcaataaa tgatgaagaa tgcagcaaca tgcaatatgc attgcgaatt gcagaattcc    240

gtgagctaac agatgtttga atgttacttg tacctttggg atattcttga aggtttgctt    300

ggtttaatgc aaagtagctt tcatatacat ttaatgctga ttagcattgt tgtgaacaat    360

aaaggtcaat gttttgcatt gaacctggat gtcatacagt tgtttacaac ctaaacatgg    420

tttcgtgggg cagacctgtt tcgtcatttg atggttgata tttgtaaatg tgcacaactg    480

ggacaagctg aagacttgca tatgctaagc gtgaagtgaa gcacataaac ccgctgaatt    540

taagcatctg tcgactgcag ga                                             562