利用小麦淀粉废水生产微生物絮凝剂的生产菌及生产方法

摘要

本发明涉及一种利用小麦淀粉废水生产微生物絮凝剂的生产菌及其生产方法。所述生产菌为芽孢杆菌-TY35(Bacillus sp.-TY35)，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010166。所述生产方法包括种子液的培养、絮凝剂的发酵生产和絮凝剂的提取。本发明的生产菌采用廉价的淀粉废水作为替代培养基来制备获得微生物絮凝剂，有效地利用了小麦淀粉废水，节省了传统培养基中的碳源成本，使得微生物絮凝剂的生产成本大大降低。本发明的生产方法生产微生物絮凝剂的产量高，产絮周期短，适用范围广，对废水的除浊、COD去除具有良好的效果。

说明书

技术领域

本发明属于环境工程中的废污水处理处置技术领域，涉及微生物絮凝剂的生产制备，具体是一种利用小麦淀粉废水生产微生物絮凝剂的生产菌及其生产方法。 

背景技术

目前，国内外对食品和发酵工业废水及生活污水常用的处理方法总体上可分为生物方法、物理方法和化学方法，对废水中不能以自然沉淀方法去除的胶体态、超胶体态和悬浮态的小颗粒污染物，一般通过投加絮凝剂使其脱稳，聚集成能够沉淀的大颗粒的矾花后进行去除。絮凝剂可以显著提高沉淀速度和处理效果，絮凝沉降法作为一种成本较低的水处理方法应用广泛，在水处理中占有极其重要的地位。絮凝沉降法处理效果的好坏很大程度上取决于絮凝剂的性能，目前的絮凝剂包括无机盐类(硫酸铝、氯化铝、氯化铁)、高分子聚合无机盐类(聚合氯化铝、聚合氯化铁)、以及高分有机聚合物(聚丙烯酰胺)产品，它们在水处理中取得了不错的效果。但上述各种絮凝剂的使用会对环境造成二次污染，如铝离子会对人类健康造成危害，聚丙烯酰胺难以降解，其单体丙烯酰胺具有较强的致癌作用。因此市场迫切需求高效、安全无毒、环保的絮凝剂。 

微生物絮凝剂(Microbial flocculants，MBF)是一类由微生物产生的具有絮凝作用的生物大分子，其与传统的絮凝剂相比，具有如下的独特优势：(1)易被微生物降解，无毒无害，安全性高；(2)无二次污染；(3)使用范围广，效果好；(4)具有除浊和脱色性能；(5)有的还具有受pH值影响小，热稳定性好，用量小等特点。微生物絮凝剂的主要成分有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA等，其具有使其他物质凝聚沉淀的性能。微生物絮凝剂一般通过细菌、真菌、酵母等微生物发酵、抽提、精炼而得到。迄今为止，已发现筛选的产MBF菌种类型包括霉菌、细菌、放线菌、酵母等。 

虽然微生物絮凝剂具备上述优势，但由于其培养基成本较高，合成效率低，微生物絮凝剂成本居高不下，大多数微生物絮凝剂的研究仍处在实验室研发阶段。因此，以廉价碳源作为培养基来生产微生物絮凝剂，能有效解决培养基成本过高的问题，从而为絮凝剂的商业化生产提供潜在的商机。近几 年，已陆续有这方面的报道，如刘晖等研究了青霉菌HHE-P7在酱油废水中产生微生物絮凝剂的絮凝特性，最佳絮凝条件为在1L高岭土水中投加10-15mL。董双石等以发酵法生物制氢反应器排放的废液为培养基，考察了复合型高效产絮菌F2-F6制取生物絮凝剂的最佳发酵条件。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种利用小麦淀粉废水生产微生物絮凝剂的生产菌，该生产菌采用廉价的淀粉废水作为替代培养基来制备获得微生物絮凝剂；同时本发明还提供了所述微生物絮凝剂的发酵生产方法。 

本发明的第一个目的通过以下的技术方案解决：利用小麦淀粉废水生产微生物絮凝剂的生产菌，其特征在于：该生产菌为芽孢杆菌-TY35(Bacillussp.-TY35)，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010166。 

本发明的第二个目的通过以下的技术方案解决：利用小麦淀粉废水生产微生物絮凝剂的生产方法，包括种子液的培养、絮凝剂的发酵生产和絮凝剂的提取，其特征在于： 

(1)、种子液的培养：经驯化培养的微生物絮凝剂生产菌(芽孢杆菌-TY35)接种至高压灭菌后的种子培养液中，在20～40℃条件下摇床培养10～20h，摇床转速为180r/min，至细菌浓度为1.0～5.0×10⁸CFU/mL； 

(2)、絮凝剂的发酵生产：取适量小麦淀粉废水，调节至9000mg/L≤CODcr≤30000mg/L(如CODcr＜9000mg/L，则添加适量淀粉，如CODcr＞30000mg/L，则加水稀释)，按照1～3g/L的比例添加玉米浆，然后用氨水调节pH至6.0～7.0(氨水同时作为补充氮源)，配制成液体发酵培养基；向液体发酵培养基中接种2～10％体积比的种子液，然后在100-250r/min，35℃的条件下通风发酵培养40～50h； 

(3)、絮凝剂的提取：将步骤(2)获得的发酵液在5000～8000r/min的条件下离心10～20min，收集上清液，按体积比加入3-4倍的无水乙醇，搅拌均匀并置于4℃下静置沉淀12h，然后在4000～6000r/min条件下离心，弃上清液，收集沉淀并真空干燥至恒重，得到固体微生物絮凝剂粗品。 

所述种子培养液为：取适量小麦淀粉废水，按照10～20g/L的比例向小麦淀粉废水中添加玉米浆，然后用氨水调节pH至6～7，在121℃灭菌20min。 

本发明与现有技术相比，优点在于： 

(1)、本发明中生产微生物絮凝剂生产的培养基是以高浓度的淀粉废水为碳源，添加少量的玉米浆和少量氨水，氨水既调节pH值又作为补充氮源，有效地利用了小麦淀粉废水，节省了传统培养基中的碳源成本，使得微生物絮凝剂的生产成本大大降低。 

(2)、利用本发明的生产方法生产微生物絮凝剂的产量高，产絮周期短，适用范围广，对废水的除浊、COD去除具有良好的效果。 

(3)、本发明既降低了微生物絮凝剂的生产成本，同时又解决高浓度小麦淀粉废水难以处理的问题，实现了废水资源化，同时该菌种可用于微生物净水剂、环境微生物制剂等领域，具有广阔的应用前景，适合大规模工业化生产和推广。 

具体实施方式

本发明微生物絮凝剂生产菌的筛选分离过程如下：淀粉废水污泥样品经稀释、富集培养，用30℃的电热恒温培养箱培养平板培养，反复划线获取单个菌落；对筛选培养基平板上生长旺盛、较有粘性的单个菌落，再进行多次划线分离，直至用镜检确定菌体为较纯的单菌落；利用絮凝效果实验对初筛的菌株进行复筛，最后获得菌株。该菌株在肉汤培养基生长为白色略偏黄，不规则菌落，有粘性，可利用淀粉，水解酪素，经镜检为杆状，产芽孢，初步鉴定为芽孢杆菌属，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010166。 

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 

本发明培养物样品的保藏： 

菌种：芽孢杆菌-TY35(Bacillus sp.-TY35)；保藏日期：培养物样品于2010年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010166；保藏地址：中国武汉  武汉大学。 

本发明使用的设备：5L的机械搅拌发酵罐(南京润泽生物工程设备有限公司生产)；离心机(上海安亭科学仪器厂制造，型号TGL-16C)；真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号BPH-6063)；紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司生产，型号UV-2800AH)。 

实施例1 

小麦淀粉废水取自江苏联海生物科技有限公司，其CODcr为9620mg/L，pH为4.25。 

(1)、种子液培养： 

(a)种子培养液：取适量小麦淀粉废水，按照10g/L的比例向小麦淀粉废水中添加玉米浆，然后用氨水调节pH至6.5，在121℃灭菌20min； 

培养条件：挑取斜面保藏的生产菌(芽孢杆菌-TY35)，接种于种子培养液中，在35℃条件下培养20h，摇床转速180r/min，至细菌浓度约为1.0×10⁸CFU/mL，将此作为接种时的种子液； 

(2)、絮凝剂的发酵生产： 

(a)液体发酵培养基：5升发酵罐装入3.5升小麦淀粉废水，按照1.1g/L的比例向小麦淀粉废水中添加玉米浆，然后用氨水调节pH至6.5，在121℃灭菌20min； 

(b)向液体发酵培养基接种5％体积比的种子液，然后在200r/min，35℃的条件下通风发酵培养48h，通风量为0.4-1.0v/v/m； 

(3)、絮凝剂的提取：取100mL步骤(2)获得的发酵液，在8000r/min的条件下离心10min，收集上清夜，得到液体絮凝剂粗品；按体积比加入4倍的无水乙醇，搅拌均匀并置于4℃下静置沉淀12h，然后在4000r/min条件下离心，弃上清液，收集沉淀并真空干燥至恒重，得到固体微生物絮凝剂粗品0.64g，发酵液中絮凝剂含量为6.4g/L。 

(4)、高岭土絮凝试验： 

(a)在80mL浓度为4g/L的高岭土悬浮液中，加入5mL 1％CaCl₂溶液，2mL液体絮凝剂粗品，再加蒸馏水至100mL，调节pH值至7.0，倒入150mL烧杯中，放在磁力搅拌器上快速搅拌3min，静置5min后，用吸管吸取一定深处的上清液，用紫外可见分光光度计在550nm的波长下测定吸光度A； 

(b)同时以2ml蒸馏水代替2ml液体絮凝剂粗品，进行上述的相同操作，测得吸光度A0； 

(c)根据公式E＝(A0-A)/A0×100％计算出絮凝率。式中：E-絮凝率，单位为％；A0-无絮凝处理的光密度；A-絮凝处理后的光密度。 

经测定，试验结果：高岭土悬浮液中加入液体絮凝剂粗品处理后，絮凝率达94％。该液体絮凝剂粗品经沸水煮沸5分钟后，采用同样方法测定絮凝率为91.4％，可见本发明获得的微生物絮凝剂的热稳定性较强。 

实施例2 

小麦淀粉废水CODcr为18500mg/L，pH值为4.10。 

小麦淀粉废水取自江苏联海生物科技有限公司，其CODcr为18500mg/L，pH为4.10。 

(1)、种子液培养： 

(a)种子培养液：取适量小麦淀粉废水，按照15g/L的比例向小麦淀粉废水中添加玉米浆，然后用氨水调节pH至6.5，在121℃灭菌20min； 

培养条件：挑取斜面保藏的生产菌(芽孢杆菌-TY35)，接种于种子培养液中，在36℃，摇床转速180r/min条件下培养15h，至细菌浓度约为2×10⁸CFU/mL，将此作为接种时的种子液； 

(2)、絮凝剂的发酵生产： 

(a)液体发酵培养基：5升发酵罐装入3.5升小麦淀粉废水，按照2.1g/L的比例向小麦淀粉废水中添加玉米浆，然后用氨水调节pH至6.5，在121℃灭菌20min； 

(b)向液体发酵培养基接种8％体积比的种子液，然后在250r/min，35℃的条件下通风发酵培养42h，通风量为0.4-1.0v/v/m； 

(3)、絮凝剂的提取：取100mL步骤(2)获得的发酵液，在7000r/min的条件下离心15min，收集上清夜，得到液体絮凝剂粗品；按体积比加入3.5倍的无水乙醇，搅拌均匀并置于4℃下静置沉淀12h，然后在5000r/min条件下离心，弃上清液，收集沉淀并真空干燥至恒重，得到固体微生物絮凝剂粗品1.04g，发酵液中絮凝剂含量为10.4g/L。 

(4)、高岭土絮凝试验： 

试验方法同实施例1，经测定，试验结果：加入液体絮凝剂粗品絮凝处理后的高岭土悬浮液的絮凝率达96.4％。 

实施例3 

小麦淀粉废水取自江苏联海生物科技有限公司，其CODcr为28500mg/L，pH值为4.0。 

(1)、种子液培养： 

(a)种子培养液：取适量小麦淀粉废水，按照20g/L的比例向小麦淀粉废水中添加玉米浆，然后用氨水调节pH至6.5，在121℃灭菌20min； 

培养条件：挑取斜面保藏的生产菌(芽孢杆菌-TY35)，接种于种子培养液中，在36℃，摇床转速180r/min条件下培养14h，至细菌浓度约为5×10⁸CFU/mL，将此作为接种时的种子液； 

(2)、絮凝剂的发酵生产： 

(a)液体发酵培养基：5升发酵罐装入3.0升小麦淀粉废水，按照3.0g/L的比例向小麦淀粉废水中添加玉米浆，然后用氨水调节pH至6.5，在121℃ 灭菌20min； 

(b)向液体发酵培养基接种6％体积比的种子液，然后在200r/min，35℃的条件下通风发酵培养45h，通风量为0.4-1.0v/v/m； 

(3)、絮凝剂的提取：取100mL步骤(2)获得的发酵液，在6000r/min的条件下离心20min，收集上清夜，得到液体絮凝剂粗品；按体积比加入3倍的无水乙醇，搅拌均匀并置于4℃下静置沉淀12h，然后在6000r/min条件下离心，弃上清液，收集沉淀并真空干燥至恒重，得到固体微生物絮凝剂粗品1.26g，发酵液中絮凝剂含量为12.6g/L。 

(4)、高岭土絮凝试验： 

试验方法同实施例1，经测定，试验结果：加入液体絮凝剂粗品絮凝处理后的高岭土悬浮液的絮凝率达97.2％。 

实施例4：对比试验 

选用实施例3制备的微生物絮凝剂分别对城市污水(取自无锡城北污水处理厂)、饮食废水(取自江南大学第三食堂下水道)和染料废水(取自张家港金陵纺织有限公司印染废水)进行絮凝处理，即在100mL的各种废水中分别添加实施例3制备的液体絮凝剂粗品2mL，然后测定絮凝率和CODcr去除率，结果如表1所示： 

表1微生物絮凝剂对实际废水的絮凝效果 

从表1可以看出，实施例3制备的微生物絮凝剂对三种实际废水均有良好的絮凝除浊效果。实验中观察到，微生物絮凝剂对城市污水的效果最佳，处理5min即可形成大的絮团并迅速下沉，30min后水质清澈透明，絮凝率可高达93.1％。