((2S,4R)-4,6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基羧酸酯及使用2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的制备方法

摘要

本发明涉及((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基羧酸酯以及它们的制备方法。此外，本发明涉及一种制备他汀类尤其是罗苏伐他汀及其衍生物的方法，其中上面提及的化合物用作中间体。

说明书

发明领域

本发明涉及((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基羧酸酯及其制备方法。此外，本发明涉及他汀类(statins)尤其是罗苏伐他汀及其衍生物的制备方法，其中以上提及的化合物用作中间体。

发明背景

((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基羧酸酯是他汀类合成中合适的中间体。他汀类，其代表性的实例可以选自罗苏伐他汀、西立伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀、达伐他汀或它们的类似物或者普伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀或它们的类似物，共享分别由连接到芳族或脂环族母核(core)的庚烯酸或庚酸部分(游离酸、盐或内酯)所定义的特征结构。他汀类的生物活性与它们的立体化学密切相关，特别是与在所述庚烯酸或庚酸部分的手性原子处的构型密切相关。

在WO 2006/134482中，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)催化的醛醇(aldol)加成步骤包括在一种生成阿托伐他汀的方法中。

JP 2005229858公开了一种制备((4R，6S)-4，6二羟基四氢-2-吡喃酮的方法，其中在存在DERA的情况下使苄氧基乙醛与乙醛反应。酶催化的反应时间为12h。

WO 05/118794涉及DERA酶的改进。经分离的突变体酶可以用于具有高多样性取代基的2，4-双脱氧己糖或2，4，6三脱氧己糖的制备。

已描述过DERA突变体催化立体特异性醛醇缩合反应(Tetrahedron Letters 2004，45，2439-2441)。所述DERA突变体在催化活性方面显示相对的改进，并因此与野生型DERA相比提高了收率。所述酶催化的反应时间为6天。由该酶催化得到的一种产物被推荐用于阿托伐他汀的合成。

在Proc.Nat.Acad.Sci.USA 2004，101(16)5788-5793中进一步描述了用于催化立体特异性醛醇缩合反应的DERA，显示所述酶方法提高体积产率(volumetric productivity)。还描述了所使用的底物对酶活性的抑制作用。所述酶催化的反应时间为3h。从该酶催化得到的产物被推荐用于阿托伐他汀或罗苏伐他汀的合成。

由2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)催化的三种醛底物的立体特异性醛醇缩合反应并非平等地接受所有的取代乙醛作为DERA的底物(Am.Chem.Soc；117，29，(1995)第7585页)，并且某些底物对DERA活性显示出抑制作用。所述酶催化的反应时间为6天。

在WO2007/039287A1中，描述了一种经由碘代内酯合成的内酯化他汀侧链中间体VI的合成，其需要6个有机合成步骤。在该多步骤合成中，第4步为确定所述碘代内酯中间产物的立体化学的内酯形成步骤。该内酯形成步骤仅提供了相对低的立体选择性。以化学计算量使用的一些试剂如I-化合物、Ag-化合物、格氏(Grignard)试剂以及对映体纯起始化合物是相当昂贵的。所述6个步骤的有机合成(如下所示)得到19％总收率：

本发明的目标是提供作为有效制备他汀类的构建单元的中间体化合物以及方法。

发明内容

所述目标通过以如下的方法提供((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基羧酸酯得以实现，该方法需要少数合成步骤，显示相对短的反应时间以及得到高总收率的具有与对映体和非对映体过量有关的高的立体化学纯度的产品。本发明另一目标是使用便宜的起始原料以及简单的设备来制备以上提及的羧酸酯。

本发明的一个方面是一种制备式IV化合物的方法

其中R₁＝烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，分别并独立地被取代或未被取代，该方法包括使乙醛和其中R₁如上所定义的式III R₁CO₂CH₂CHO的醛与催化醛醇缩合的酶相接触的步骤。通过优选使用催化连续(sequential)醛醇缩合反应的酶，可减少获得IV的反应步骤的数目。

优选地，所述底物选自如下式III化合物，其中R₁＝C₁-C₆烷基或烷氧基，分别并独立地被取代或未被取代。选择这种合适的酶底物能够使反应时间显著缩短并提供显著提高的反应立体选择性。适当选择底物还使得所述底物被控制，因为所述酶反应在含水介质中进行。此外，对IV的酯部分进行选择，其优选是不被水裂解的。因此，更优选R₁＝CH₃。特别地，优选选择适当的酶底物以提供具有99.8％或以上对映体过量和/或98％或以上非对映体过量的式IV化合物。高的对映体过量和非对映体过量是一个显著的进步，因为所述产物的纯化和分离更为容易且收率因此更高。优选的是，所述酶为2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA，EC 4.1.2.4)。筛选不同类型的DERA酶以发现具有更宽底物特异性的酶可能是有用的。此外，可以将DERA酶加以剪切(tailored)用于具体的底物。为此，可以测试不同的突变体DERA酶。更具体来讲，所述醛缩酶选自DERA 01、DERA 02、DERA 03、DERA 04、DERA 05、DERA 06、DERA 07、DERA 08、DERA09、DERA 10、DERA 11、DERA 12、DERA 13、DERA 14、DERA 15、DERA 16、DERA 17、DERA 18、DERA 19、DERA 20、DERA 21、DERA22以及DERA 23或者相对于任何所述醛缩酶的氨基酸序列具有至少大约70％的氨基酸序列同一性的醛缩酶。更具体地，所述醛缩酶选自DERA 01、DERA 02、DERA 05、DERA 12以及DERA 13，并且尤其是其中所述醛缩酶相对于SEQ ID NO：2氨基酸序列具有至少大约70％氨基酸序列同一性或者其中所述醛缩酶相对于SEQ ID NO：5氨基酸序列具有至少大约80％氨基酸序列同一性或者其中所述醛缩酶相对于SEQ ID NO：11氨基酸序列具有至少大约80％氨基酸序列同一性或者其中所述醛缩酶相对于SEQ ID NO：25氨基酸序列具有至少大约80％氨基酸序列同一性。或者其中所述醛缩酶相对于SEQ ID NO：27氨基酸序列具有至少大约80％氨基酸序列同一性。

在一个优选实施方案中，使乙醛和式III R₁CO₂CH₂CHO的醛接触的步骤通过使乙醛和所述的式III的醛与分别过表达生物学活性形式的醛缩酶的微生物或微生物的部分相接触来完成。进行所述接触步骤来催化醛醇缩合。根据该实施方案，醛缩酶过表达的生物体作为全细胞催化剂使用。另外，使用醛缩酶过表达的生物体作为全细胞催化剂的可能性使得与Proc.Nat.Acad.Sci.USA 2004，101(16)5788-5793中所描述的方法相比降低了生产成本，因为省去了酶制备以及产物纯化中的数个步骤。此外，与其他酶制品相比，细胞环境的稳定作用允许使用更高底物浓度，因为对酶活性具有更低影响。这就使得能够以更低的酶载量实现更高的体积产率，其显著降低了生产成本。令人惊讶地，使用醛缩酶过表达的生物体作为全细胞催化剂，保持了式IV化合物的高对映体和非对映体过量。

本发明的另一方面是一种制备式IV化合物的方法

其中R₁＝烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其分别地并独立地被取代或未被取代，该方法包括使乙醛和其中R₁如上所定义的式III R₁CO₂CH₂CHO的醛与分别过表达生物学活性形式的醛缩酶的微生物或微生物的部分相接触的步骤。进行所述接触步骤来催化醛醇缩合。根据本发明的该方面，醛缩酶过表达的生物体作为全细胞催化剂使用。

优选地，全细胞催化剂形式的酶为2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA，EC 4.1.2.4)。

本发明的另一方面是一种制备式IV化合物的方法

其中R₁＝烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其分别地并独立地被取代或未被取代，该方法包括使乙醛和其中R₁如上所定义的式III R₁CO₂CH₂CHO的醛与催化醛醇缩合的酶相接触的步骤，其中所述酶是以全细胞催化剂的形式，其中所述全细胞催化剂是过表达生物学活性形式的醛缩酶的微生物。

本发明的另一方面是一种制备式XV化合物的方法

其中R₄＝OCOR₁(其中R₁如上所定义)、氯化物、氢、烯丙氧基以及苄氧基，其分别地并独立地被取代或未被取代，该方法包括使乙醛和其中R₄如上所定义的式XIV R₄CH₂CHO的醛与分别过表达生物学活性形式的醛缩酶的微生物或微生物的部分相接触的步骤。进行所述接触步骤，从而催化醛醇缩合。根据本发明的该方面，醛缩酶过表达的生物体作为全细胞催化剂使用。

优选地，全细胞催化剂形式的酶是2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA，EC 4.1.2.4)。

本发明的另一方面是一种制备式XV化合物的方法

其中R₄＝OCOR₁(其中R₁如上所定义)、氯化物、氢、烯丙氧基以及苄氧基，其分别地并独立地被取代或未被取代，该方法包括使乙醛和其中R₄如上所定义的式XIV R₄CH₂CHO的醛与催化醛醇缩合的酶相接触的步骤，其中所述酶是全细胞催化剂的形式，其中所述全细胞催化剂是过表达生物学活性形式的醛缩酶的微生物。

当使用全细胞催化剂形式的酶时，显著更低的生产成本得以实现，因为省去了酶制备以及产物纯化中的数个步骤。此外，与其它酶制品相比，细胞环境的稳定作用允许使用更高的底物浓度，因为对酶活性具有更低的影响。此外，当使用全细胞催化剂形式的酶时，获得了高的对映体和非对映体过量。

本发明的方法方面可以在其中用于醛缩酶-催化的醛醇缩合的pH保持在4.5到10、优选5到10，尤其是其中pH用缓冲剂保持在5到8、优选5到7的pH范围内的反应条件下有效地实现。合适的pH值导致更短的反应时间。在另一方面中，合适的pH减少底物和/或产物分解。缓冲剂使得能够将pH值调整到恒定水平，其有助于恒定就pH值而言的反应条件。为此，所述缓冲剂优选是磷酸盐缓冲剂。或者，通过在pH调节泵的帮助下自动加入酸或碱可以实现精确的pH控制。

本发明的另一方面是醛缩酶用于使式III R₁CO₂CH₂CHO(其中R₁如上所定义)的底物与乙醛在生成式IV化合物(其中R₁如上所定义)的醛缩酶催化的醛醇缩合条件下反应的用途，所述反应包括使乙醛和式IIIR₁CO₂CH₂CHO的醛相接触的步骤。具体来讲，所述醛缩酶是2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶。更具体地，醛缩酶选自如上所述的DERA 01到DERA 23。特别地，所述醛缩酶包含于活的全细胞内，或者包含于失活的全细胞内，或者包含于均化的(homogenized)全细胞内，或者包含于无细胞抽提物内，或者是经纯化的酶，或者是固定化的，或者是细胞外表达的蛋白质的形式。

本发明的另一方面是一种制备式V化合物的方法

其中R₁＝烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其分别地并独立地被取代或未被取代，该方法包括通过氧化将式IV化合物转变为式V化合物的步骤。用于氧化的反应物应是廉价且提供高收率的。因此，所述氧化优选使用Br₂和BaCO₃进行。

特别是，提供具有99.8％或以上对映体过量和/或98％或以上非对映体过量的式V化合物。

本发明的另一方面是一种制备式III’R₂CO₂CH₂CHO的醛的方法，其中R₂为烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基(其分别地并独立地被取代或未被取代)，但正丙基、环己基、苯基、吗啉、吡咯烷和咪唑除外，该方法包括以下步骤

a.)使式II R₂CO₂CH₂CH＝CHCH₂O₂CR₂的化合物，

其中R₂如上所定义，与溶剂以及与臭氧相接触，和

b.)水解步骤a)得到的臭氧化物。

臭氧分解以高收率提供所述醛的廉价生产。特别是，在(Z)-和/或(E)-位除H之外具有两个相同的取代基的(Z)-和/或(E)-烯烃提供高的分子经济学(molecular economics)，因为在水解之后获得2个需要的产物，而在(Z)-和/或(E)-位除H之外具有两个不同的取代基的(Z)-和/或(E)-烯烃的转化提供一个需要的产物和一个废弃的产物。特别地，步骤a)的溶剂是二氯甲烷。优选地，R₂是C₁-C₆烷基或烷氧基，但正丙基、环己基除外。更优选地，R₂为CH₃。优选的是在-50到-90℃的温度下、更优选在大约-80℃下进行步骤a)。此外，优选的是通过将步骤a)所得到的臭氧化物与甲硫醚相接触来进行步骤b)。特别地，步骤b)在-80℃至室温之间的温度下进行。

通过使(Z)-和/或(E)-丁-2-烯-1，4-二醇与其中R₂如上所定义的式IR₂CO₂COR₂的酸酐反应，且如实施例1步骤1所描述那样或者如现有技术合成方法(J.Org.Chem.1956，21，328-331)，来获得式II化合物。

本发明的另一方面是式IV或V的化合物

或

其中R₁＝烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其分别地并独立地被取代或未被取代。优选其中R₁＝分别地并独立地被取代或未取代的C₁-C₆烷基或烷氧基，以及特别是其中R₁＝CH₃的式IV或V的化合物。

本发明的再一个方面是一种制备他汀或其衍生物的方法，该方法包括以下步骤：

a)在4-位的羟基基团上用保护基R₃(其中R₃是保护基，优选选自独立地被取代或未被取代的甲硅烷基、苄基、烷基和乙酰基，更优选R₃选自任选取代的C₁-C₈三烷基甲硅烷基、C₁-C₈二烷基芳基甲硅烷基、C₁-C₈烷基二芳基甲硅烷基，其中烷基可以是相同的或不同的，更优选保护基是叔丁基二甲基甲硅烷基)保护式V化合物

其中R₁＝烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其分别地并独立地被取代或未被取代；以得到式VI化合物

b)使所述式VI化合物在足以生成他汀类或其药学上可接受的衍生物的条件下反应。

特别是，提供具有99.8％或以上对映体过量和/或98％或以上非对映体过量的式VI化合物。

在制备他汀类或其衍生物的方法中，优选的是根据VI转化为醛以及与适当的盐或其它衍生物的魏悌息(Wittig)偶联以得到他汀类或其衍生物来设定步骤b)的条件。更优选地，所述魏悌息偶联步骤包括以下步骤：

b1)从式VI化合物提供具有式VIII的醛

b2)提供具有式IX的盐

其中Rx、Ry和Rz是相同或不同的并选自任选取代的C₁-C₈烷基或C₃-C₆环烷基或C₁-C₈烯基或者C₅-C₆环烯基或芳基，

并且X为阴离子，优选卤素或羧酸根阴离子，更优选氯离子、溴离子或三氟醋酸根；

以得到式X化合物

b3)随后将化合物X转化为罗苏伐他汀或其盐。

所述的从式VI化合物提供具有式VIII的醛的步骤b1)经由式VII化合物进行，

其中R₃如上所定义。

特别是，提供具有99.8％或以上对映体过量和/或98％或以上非对映体过量的式VII化合物。

本发明的再一个方面是一种制备他汀类或其衍生物的方法，其包括以下步骤：

a)制备式IV化合物

其中R₁＝烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基(其分别地并独立地被取代或未被取代)，其包括使乙醛和其中R₁如上所定义的式III R₁CO₂CH₂CHO的醛与催化醛醇缩合的酶相接触的步骤。

b)通过氧化将所述式IV化合物转化为式V化合物

其中R₁如上所定义

c)在4-位的羟基基团上用保护基R₃(其中R₃是保护基，优选独立地选自被取代或未被取代的甲硅烷基、苄基、烷基和乙酰基，更优选R₃选自任选取代的C₁-C₈三烷基甲硅烷基、C₁-C₈二烷基芳基甲硅烷基、C₁-C₈烷基二芳基甲硅烷基，其中烷基可以是相同的或不同的，更优选保护基是叔丁基二甲基甲硅烷基)保护所述式V化合物，以得到式VI化合物

d)使所述式VI化合物在足以生成他汀类或其药学上可接受的衍生物的条件下反应，其中步骤d)的条件根据VI转化为醛以及与适当的盐或其它磷衍生物的魏悌息偶联以得到他汀类或其衍生物来设定，优选地，所述魏悌息偶联步骤包括以下步骤：

b1)从式VI化合物提供具有式VIII的醛

b2)提供具有式IX的盐

其中Rx、Ry和Rz是相同或不同的并选自任选取代的C₁-C₈烷基或C₃-C₆环烷基或C₁-C₈烯基或者C₅-C₆环烯基或芳基，

并且X为阴离子，优选卤素或羧酸根阴离子，更优选氯离子、溴离子或三氟醋酸根；

以得到式X化合物

b3)随后将化合物X转化为罗苏伐他汀或其盐。

发明详述

在下文中，将通过优选实施方案以及实施例同时参考附图更详细地描述本发明，然而，应当注意，这些实施方案、实施例以及附图仅以说明性目的给出，而不应该以任何方式限制本发明。

图1显示根据实施例6的酶促反应的反应曲线。

本发明提供式IV化合物，其是化学通式如下的((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基羧酸酯：

其中R₁＝烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其分别地并独立地被取代或未被取代。

式IV化合物的特征，尤其是当R₁为C₁-C₆烷基或烷氧基(其分别地并独立地被取代或未被取代)时，并特别是当R₁为CH₃时，在于其具有所需要的立体化学，避免了随后中间体的后续分离。因此，中间体化合物IV的提供使得能够进行连续的选择性氧化步骤或者合适的官能修饰，例如包括6-位羟基基团的第一个氧化步骤，任选的4-位羟基基团的第二个氧化步骤，以及另外或可选地，在所述R₁酰基残基裂解之后在甲氧基基团上的第三个氧化步骤。

本发明提供使用取代乙醛R₁CO₂CH₂CHO(式III)化合物以及乙醛在醛缩酶催化的醛醇缩合反应中生成相应的内半缩醛(lactole)IV的酶促方法，如以下流程图所给出的：

其中R₁选自烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其分别地并独立地被取代或未被取代。根据本发明的结构IV在2位和4位具有严格限定的立体异构现象(stereoisomery)，而其它手性中心可以以形成差向异构体混合物的两种可能性存在。

如文中所用，术语“醛缩酶-催化的醛醇缩合条件”是指可以被醛缩酶催化的任何本领域已知的醛醇缩合条件，如文中所描述的。特别是，所述醛缩酶-催化的醛醇缩合条件是使得所需产物生成并累积的条件。这些条件包括：一方面，所述醛缩酶是以足以能够进行连续缩合的载量提供的活性酶；另一方面，所述底物和乙醛以显示对所述醛缩酶活性具有最小抑制作用的量存在于反应中；再一方面，反应的温度、pH、溶剂成分、搅拌以及持续时间允许所需产物的累积；又一方面，所述条件对产物稳定性不具有不利影响。具体地，那些条件由实施例中所公开的值限定。

对上述式III化合物的醛缩酶活性意味着特定的酶被分离和/或被纯化，或者被固定或在活细胞内，或者包含在失活的全细胞内，或者包含在均化的细胞物质中，或者在无细胞抽提物中，其将催化上述式III化合物与乙醛的反应，以得到IV。

如文中所用，术语“足以生成他汀类(尤其是罗苏伐他汀)或其药学上可接受盐的条件”是指那些在本领域描述过的用于获得所需他汀类化合物的方法，包括在本文中所描述的那些方法。

如文中所用，术语“过表达生物学活性形式的醛缩酶的生物体”是指具有在强启动子控制下的醛缩酶表达，并且其中醛缩酶以高水平表达(与野生型(w.t.)表达对照相比较)并且细胞内或细胞外累积的任何生物体。制备这种生物体的方法是本领域技术人员所熟知的。

用于本发明的醛缩酶可以是对上述式III化合物具有醛缩酶活性的任何化合物。在本发明的一个实施方案中，所述醛缩酶是2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)。适当的DERA-醛缩酶的实例包括但不限于：DERA 01、DERA 02、DERA 03、DERA 04、DERA 05、DERA 06、DERA 07、DERA08、DERA 09、DERA 10、DERA 11、DERA 12、DERA 13、DERA 14、DERA 15、DERA 16、DERA 17、DERA 18、DERA 19、DERA 20、DERA21、DERA 22及DERA 23，它们通过在序列表中给出的它们的核苷酸序列或各自的密码子优化的核苷酸序列或氨基酸序列来确认。

一般来讲，任何本领域已知的DERA醛缩酶可用于所述反应，不管它们与以上所列出的DERA醛缩酶的序列同一性。本发明提供了用仅仅具有30.1％同一性的两种不同醛缩酶成功进行所述反应的实施例。但是，所述反应的收率可能取决于各醛缩酶底物特异性以及底物对各醛缩酶的抑制作用。

DERA 01是具有核苷酸序列SEQ ID NO：1或氨基酸序列SEQ ID NO：2的醛缩酶；DERA 01(E.Coli)可从Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA购得，目录编号91252。

DERA 02是具有核苷酸序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或氨基酸序列SEQ ID NO：5的醛缩酶；DERA 02描述于William A.Greenberg等，PNAS，(2004)，第101卷，第16期，5788页中

DERA 03是具有核苷酸序列SEQ ID NO：6或氨基酸序列SEQ ID NO：7的醛缩酶

DERA 04是具有核苷酸序列SEQ ID NO：8或氨基酸序列SEQ ID NO：9的醛缩酶

DERA 05是具有核苷酸序列SEQ ID NO：10或氨基酸序列SEQ IDNO：11的醛缩酶

DERA 06是具有核苷酸序列SEQ ID NO：12或氨基酸序列SEQ IDNO：13的醛缩酶

DERA 07是具有核苷酸序列SEQ ID NO：14或氨基酸序列SEQ IDNO：15的醛缩酶

DERA 08是具有核苷酸序列SEQ ID NO：16或氨基酸序列SEQ IDNO：17的醛缩酶

DERA 09是具有核苷酸序列SEQ ID NO：18或氨基酸序列SEQ IDNO：19的醛缩酶

DERA 10是具有核苷酸序列SEQ ID NO：20或氨基酸序列SEQ IDNO：21的醛缩酶

DERA 11是具有核苷酸序列SEQ ID NO：22或氨基酸序列SEQ IDNO：23的醛缩酶

DERA 12是具有核苷酸序列SEQ ID NO：24或氨基酸序列SEQ IDNO：25的醛缩酶

DERA 13是具有核苷酸序列SEQ ID NO：26或氨基酸序列SEQ IDNO：27的醛缩酶

DERA 14是具有核苷酸序列SEQ ID NO：28或氨基酸序列SEQ IDNO：29的醛缩酶

DERA 15是具有核苷酸序列SEQ ID NO：30或氨基酸序列SEQ IDNO：31的醛缩酶

DERA 16是具有核苷酸序列SEQ ID NO：32或氨基酸序列SEQ IDNO：33的醛缩酶

DERA 17是具有核苷酸序列SEQ ID NO：34或氨基酸序列SEQ IDNO：35的醛缩酶

DERA 18是具有核苷酸序列SEQ ID NO：36或氨基酸序列SEQ IDNO：37的醛缩酶

DERA 19是具有核苷酸序列SEQ ID NO：38或氨基酸序列SEQ IDNO：39的醛缩酶

DERA 20是具有核苷酸序列SEQ ID NO：40或氨基酸序列SEQ IDNO：41的醛缩酶

DERA 21是具有核苷酸序列SEQ ID NO：42或氨基酸序列SEQ IDNO：43的醛缩酶

DERA 22是具有核苷酸序列SEQ ID NO：44或氨基酸序列SEQ IDNO：45的醛缩酶

DERA 23是具有核苷酸序列SEQ ID NO：46或氨基酸序列SEQ IDNO：47的醛缩酶

所述醛缩酶包括相对于本文所描述的醛缩酶具有至少其大约50％、优选至少其70％的氨基酸序列同一性的醛缩酶。所述氨基酸序列同一性通过序列比对算法分析或通过肉眼观察(visual inspection)来确定。在一方面中，所述序列比对算法用设定为默认设置的Vector NTI 9.0(InforMax)的AlignX算法进行。

特别是，本发明提供一种制备式IV化合物的方法

其中R₁＝烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其分别地并独立地被取代或未被取代，该方法包括使乙醛和其中R₁如上所定义的式III R₁CO₂CH₂CHO的醛与催化醛醇缩合条件的酶相接触的步骤。

在一个优选实施方案中，所述醛缩酶选自DERA 01或DERA 02或DERA 05，或DERA 12，或DERA 13，或相对于所述那些具有至少大约90％氨基酸序列同一性的任何醛缩酶，或在另一实施方案中，其中所述醛缩酶在优选实施方案中选自DERA 06或DERA 17，或相对于所述那些具有至少大约80％氨基酸序列同一性的任何醛缩酶。

化合物IV在随后用于他汀类(尤其是罗苏伐他汀)的合成中特别有价值。

本文所描述的DERA醛缩酶可以通过本领域已知的任何方法来制备，包括但不限于，重组大肠杆菌(E.coli)中蛋白质表达的标准方法，例如在Sambrook和Russell，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，3^rd Ed.，Cold Spring Harbor，NY 2001中所描述的。已知DERA醛缩酶的改良形式可能是必要的或可以取决于克隆条件得到，并包括在本发明内。

本文所描述的DERA醛缩酶可以以任何生物学活性形式使用。

在一个实施方案中，所述醛缩酶是活性的并可以以活的全细胞催化剂的形式使用。在一个实施方案中，所述醛缩酶是活性的并可以以失活的全细胞催化剂的形式使用。

在一个实施方案中的全细胞催化剂是过表达生物学活性形式的醛缩酶的任何微生物或者微生物的部分。所述微生物可以是以活的或休眠的或失活的全细胞的形式存在。这些形式可以包括细胞悬液、细胞菌丝体、细胞糊状物(pastes)以及其中细胞未被故意物理地、化学地或生物学碎裂的微生物培养物的任何其它形式，这些形式还可以包括这类微生物或其部分的载体支持、固定或粘附的形式。

所述微生物优选选自细菌(Bacteria)和酵母(Yeast)。细菌(Bacteria)优选选自以下的属：埃希氏杆菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、芽胞杆菌属(Bacillus)以及乳酸杆菌属(Lactobacillus)，更优选使用大肠杆菌(Escherichia coli)。酵母(Yeast)优选选自以下的属：酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤氏酵母菌属(Pichia)、裂殖酵母菌属(Shizosaccharomyces)以及念珠菌属(Candida)。

在一个实施方案中，所述醛缩酶是活性的并可以以均化的全细胞催化剂的形式使用。在一个实施方案中，所述醛缩酶是活性的并可以以无细胞抽提物的形式使用。在一个实施方案中，所述醛缩酶是活性的并可以以通过本领域已知的任何方法纯化的酶的形式使用。在另一方面中，所述醛缩酶是活性的并可以以细胞外表达的蛋白质的形式使用。

对底物和反应条件加以选择以赋予用来制备用于他汀类生产的中间体的醛缩酶最佳活性。

根据在最佳反应条件下相应式IV化合物产物的稳定性选择式III化合物。特别是，产生具有最良好稳定性的产物的受体(acceptor)底物优选用于所述反应。

式III化合物还根据相应的式VI化合物来选择，这些具有经掩蔽的醛基团的产物是在WO 2007/039287A1中使得能够进行他汀类制备中的另外步骤的关键中间体，尤其是，产生具有醛基团的产物的底物是优选的。

具体地，式III化合物可以是乙酰基氧基乙醛(CH₃CO₂CH₂CHO)。

通常，醛缩酶将被提供于适当的容器或反应器中，并且式III化合物和乙醛将被分批或连续加入。

特别是，在水溶液中(特别是，以0.1g/L到30g/L的浓度范围)且任选地在存在盐(特别是，50到500mM的NaCl)的情况下制备醛缩酶。所述水溶液可以包含与水可混溶的有机溶剂(特别是，2到15％V/V浓度的二甲亚砜)，并可以被缓冲至pH 4.5到9、优选至pH 5到9、更优选至pH 6到9。

适当的缓冲剂可以从：酸、碱、盐或它们的混合物以及任何本领域已知的其它缓冲体系(除了具有伯、仲或叔氨基基团的那些)来制备。特别是，可以使用10到500mM浓度的磷酸盐缓冲液。所述水溶液还可以通过将所述醛缩酶加入到水中并在反应期间通过自动加入无机酸、碱、盐或它们的混合物保持pH来制备。

或者，在DERA过表达的细胞、特别是DERA过表达的大肠杆菌细胞的含水悬浮液中(特别是，以20g/L到300g/L细胞湿重的浓度范围，更特别是，以20g/L到200g/L细胞湿重的浓度范围)任选地在存在盐(特别是50到500mM浓度的NaCl)的情况下制备醛缩酶。所述含水悬浮液可以包含与水可混溶的有机溶剂(特别是2到15％V/V浓度范围的二甲亚砜)，并可以被缓冲至pH 4.5到9、优选至pH 5到9、更优选至pH 6到9。适当的缓冲剂可以从：酸、碱、盐或它们的混合物以及任何本领域已知的其它缓冲体系(除了具有伯、仲或叔氨基基团的那些)来制备。特别是，可以使用10到500mM浓度的磷酸盐缓冲液。所述含水悬浮液还可以通过将所述DERA过表达细胞加入到水中并在反应期间通过自动加入无机酸、碱、盐或它们的混合物保持pH来制备。

在所述方法方面中，可以将式III化合物连续地加入到所述反应混合物中，或者可选地将式III化合物以一批次或多批次加入到所述反应混合物中。在一方面中，加入到混合物中的底物的总量是这样的量，其使得所加入的式III化合物的总量将为每升反应混合物大约20mmol到每升反应混合物大约2mol，特别是每升反应混合物大约100mmol到每升反应混合物大约1.5mol，更特别是每升反应混合物大约200mmol到每升反应混合物大约700mmol。乙醛可以通过数种方式加入。在一方面中，乙醛以一批次或多批次或者连续地加入到反应混合物中。可以将乙醛与式III化合物预混合并加入到反应混合物中。加入到反应混合物中的乙醛的总量相对于受体底物(化合物III)为大约0.1到大约4摩尔当量，特别是大约1到大约3摩尔当量，更优选大约2到2.5摩尔当量。特别是，这使得产生最小浓度的不需要产物，尤其是式XII和XIII化合物，尽管式XII化合物通过一分子乙醛与一分子III反应得到以及式XIII化合物通过三分子乙醛反应得到。

在优选实施方案中，所述底物通过程序控制的泵在任何给定的反应时点以特定流速连续加入到反应混合物中。将其中所述底物不在反应混合物中累积的流速确定为最大流速。特别是，这使得产生最小浓度的不需要产物。更特别是，这种产物可以是式XII和XIII化合物。在另一实施方案中，底物的抑制作用可以使用修正的加入策略来进一步最小化。

或者，可以将醛缩酶加入到包含至少式III化合物或乙醛之一的反应混合物中。所述反应混合物被理解为包含溶剂以及至少醛缩酶或式III化合物或乙醛之一。

在一方面中，用于醛缩酶-催化反应的pH为大约5到10。在一个实施方案中，用于醛缩酶-催化反应的pH为大约5到大约8。特别是，所述pH将被适当的缓冲剂保持在5到7的范围内。

一些通常使用的缓冲剂可能通过限制醛缩酶-缩合中间体(尤其是第一缩合反应产物)的可用度而降低上述醛缩酶-催化反应的收率，因为它们可以与缓冲剂进行化学反应。我们发现双((三羟甲基)甲基氨基)丙烷(bis-tris propan)与所述中间体反应。可以发生类似反应的其它缓冲剂为双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(bis-tris)、三羟甲基甲基甘氨酸(tricin)、三羟甲基氨基甲烷(tris)、N，N-二羟乙基甘氨酸(bicin)或任何其它具有伯、仲或叔氨基基团的缓冲剂。因此，如果需要该调整，用于调整pH值的合适缓冲剂用酸、碱、盐或它们的混合物尤其是磷酸和氢氧化钠制得。

在一方面中，用于醛缩酶-催化反应的温度为大约20到大约70℃。在一个实施方案中，用于醛缩酶-催化反应的温度为大约25到大约60℃。在一个实施方案中，用于醛缩酶-催化反应的温度为大约30到大约50℃。

所述反应适于工业应用，因为其在数小时内完成。

在反应完成之后，通过向1体积反应混合物中加入至少大约1体积乙腈将所述酶从反应混合物去除。或者，所述酶通过任何本领域已知的沉淀法去除。在一个实施方案中，通过加入至少5％m/V硫酸铵进行沉淀。或者，所述IV通过本领域中已知的盐析法加以提取。特别是，所述盐析法通过向1体积反应混合物加入至少大约1体积乙腈和5％(m/V)NaCl进行。然后将混合物冷却到至少4℃并分离液相。然后将乙腈相蒸发从而得到IV的粗产物。或者，使用沉降技术尤其是离心法将全细胞催化剂从反应混合物去除。在另一方面中，可以通过过滤技术、尤其是通过微过滤将全细胞催化剂去除。

本发明还提供一种用于获得由所述反应产生的纯内半缩醛的纯化方法。在一方面中，将乙腈从所述反应混合物蒸发，而后将所留下的水溶液冷冻干燥。在另一方面中，将经沉降的沉淀溶液或者全细胞催化剂混悬液的上清液冷冻干燥。然后将粉末残余物混悬在乙腈/异丙醚1∶1中。将混悬液过滤从而去除不溶的盐，并将滤液上载到硅胶柱上，使用乙腈/异丙醚1∶1作为流动相。在另一方面中，将来自盐析提取法的乙腈相蒸发，并将所剩余的油状物溶解于最小体积的乙腈/异丙醚1∶1中，并上载到硅胶柱上，使用乙腈/异丙醚1∶1作为流动相。

在一个具体实施方案中，本发明提供在醛缩酶-催化的醛醇缩合条件下CH₃CO₂CH₂CHO与乙醛生成((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯的反应，其中所使用的醛缩酶为在pH范围为5到10、尤其是5到8(如果需要，用酸、碱、盐或它们的混合物调整，特别是用磷酸和氢氧化钠调整)的适当溶剂(尤其是含水溶剂，其可以是水与可溶于水的有机溶剂的混合物)中的DERA 01、DERA 02，其中所述反应在大约35-40℃温度下进行，并且转化在1-6小时内完成。

通常，所使用的醛缩酶通过在Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular cloning：A laboratory Manual)第2版，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor中所描述的蛋白质表达方法加以制备。将基因编码的醛缩酶克隆入表达载体中，并将所述酶表达在适当的表达宿主中。

反应收率相对于加入到反应混合物中的式III化合物的总量计算，并且它们被确定为所分离的产物的摩尔数与加入到反应混合物中的式III化合物的摩尔数之间的比值。

本发明还提供制备式XV化合物的方法

其中R₄＝OCOR₁(其中R₁如以上所定义)、氯化物、氢、烯丙氧基及苄氧基，其分别及独立地被取代或未被取代，该方法包括使乙醛和其中R₄如上所定义的式XIV R₄CH₂CHO的醛与分别过表达生物学活性形式的醛缩酶的微生物或微生物的部分相接触的步骤。优选地，R₄是乙酸酯(acetate)、氯化物或氢，更优选R₄为乙酸酯。

进行所述接触步骤，从而催化醛醇缩合。因此，使用作为全细胞催化剂的醛缩酶过表达的生物体。全细胞催化剂形式的酶优选为如上所定义的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA，EC 4.1.2.4)。

所述全细胞催化剂优选选自过表达生物学活性形式的醛缩酶的细菌(Bacteria)和酵母(Yeast)。细菌(Bacteria)优选选自以下的属：埃希氏杆菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、芽胞杆菌属(Bacillus)以及乳酸杆菌属(Lactobacillus)，更优选使用大肠杆菌(Escherichia coli)。酵母(Yeast)优选选自以下的属：酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤氏酵母菌属(Pichia)、裂殖酵母菌属(Shizosaccharomyces)以及念珠菌属(Candida)。

在本发明的一个具体方面中，罗苏伐他汀可以根据WO 2007/039287A1从我们的式VI化合物开始如以下流程图所公开那样进行制备：

为了生产罗苏伐他汀或其它他汀类，式VI化合物经两个步骤(经由式VII化合物)转化为(2S，4R)-4-(保护的)-6-氧代-四氢-2H-吡喃-2-甲醛VIII或其水合物VIII’。醛VIII或其水合物VIII’可在魏悌息偶联条件下与适当的试剂反应，当需要时，接着氢化。

所述适当的试剂是下式的杂环或脂环衍生物(他汀类的骨架)：

或

其中A可以为键或O；

并且其中R_x、R_y和R_z相同或不同，且选自任选取代的C₁-C₈烷基或C₃-C₆环烷基或C₁-C₈烯基或者C₅-C₆环烯基或芳基；

且X是阴离子，优选卤素或羧酸根阴离子，更优选氯离子、溴离子或三氟醋酸根；

且选择Het使得其可形成他汀类的杂环或脂环骨架；

可以类似地制备其它HMG-CoA还原酶抑制剂(优选选自西立伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀、达伐他汀)。

所述他汀类的杂环或脂环骨架(Het)特别选自：

以下实施例用以说明本发明的方法，而并非意味着限制本发明的范围：

实施例1：乙酰氧基乙醛(III)：

步骤1：

将1，4-二羟基丁-2-烯(10mL，0.12mol，1当量)溶解于三乙胺(67mL，4当量)中。将所述溶液冷却至0℃并逐滴加入乙酸酐(I)(34mL，3当量)。将所得到的反应混合物升温至室温并搅拌过夜。

将所述溶液用1M H₃PO₄溶液(60mL)洗涤两次，用NaHCO₃1M溶液(60mL)洗涤两次。然后，将所述溶液用MgSO₄干燥并浓缩。使用高真空泵在70℃下将痕量的AcOH和Ac₂O去除。

得到为浅黄色至深色液体的纯的II(20.6g，100％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ5.65(m，2H)，4.58(m，4H)，1.97(s，6H)，¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ170.2，127.6，59.5，20.2。

步骤2：

将1，4-二乙酰氧基丁-2-烯(II)(1.7g，10mmol，1当量)溶解于二氯甲烷(0.17M)中。打开氧气(或干燥空气)喷头(大约10L/h)并将溶液冷却至-80℃。一旦到达-80℃，打开臭氧发生器并鼓入臭氧直到所述溶液变成蓝色。然后关闭臭氧发生器并鼓入氧气(或干燥空气)直到蓝色消失。鼓入氩气10min。移去喷头并在-80℃下将溶液保持在氩气下。逐滴加入甲硫醚(1.8mL，2.5当量)，并将反应物升至室温并搅拌20h。将反应物浓缩，得到1，4-乙酰氧基乙醛(III)与DMSO的2∶1混合物。所述收率被假定为定量的，无痕量1，4-二乙酰氧基丁-2-烯。产物不必进行任何进一步的纯化即可使用。(III)¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ9.51(s，1H)，4.59(s，2H)，2.10(s，3H)，2.58(s，DMSO)

实施例2：醛缩酶的制备

已经使用寡核苷酸引物CGGGATCCACTGATCTGAAAGCAAGCAGCC和GCAAGCTTGCTGCTGGCGCTCTTACC(分别具有SEQ ID No.48和49)在使用从大肠杆菌K-12株分离的基因组DNA的PCR反应中扩增大肠杆菌基因deoC。用限制性内切酶BamHI和HindIII切割所述产物并已经将所得到的片段在琼脂糖凝胶电泳上加以分离并纯化。已经使用与前面提及的相同的限制性内切酶切割表达载体pQE30(Qiagene inc.，Valencia，CA，USA)并纯化。所述片段已经在T4连接酶反应中加以组装。用以上提及的连接反应转化感受态(Competent)大肠杆菌DH5α细胞。培养耐氨苄西林菌落并分离质粒DNA。所得到的构建物已经命名为pQE30DeraC并对所述基因序列的构象进行测序。表达醛缩酶的生物体已经通过转化具有载体pQE30DeraC的感受态大肠杆菌TOP10F′株(Invitrogen corp.，Carlsbad，CA，USA)制备。用于所述方法的方法描述于Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular cloning：A Laboratory Manual)第2版，NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor中并为技术人员所熟知。

将补充有氨苄西林(100μg/mL)的极品肉汤培养基(Terrific Broth media)(150mL，12g/L Bacto胰蛋白胨，24g/L Bacto酵母提取物，4mL/L甘油，2.31g/L KH₂PO₄，12.54g/L K₂HPO₄)用3mL TOP10F′PQE30DeraC过夜培养物接种。细胞生长(37℃，250rpm)直到OD₆₀₀达到近似0.8。用IPTG(1mM最终浓度)诱导蛋白表达并将细胞留置于相同的生长条件中，持续另外4h。通过离心法(10min，6000g，4℃)采集所述细胞沉淀物。除去上清液并以相同体积的缓冲液(50mM NaH₂PO₄，pH 7.0，300mM NaCl)置换。将所述沉淀物再悬浮并再次通过离心法(10min，6000g，4℃)收集。将上清液去除并将细胞贮存在-20℃备用。因此得到具有DERA 01的全细胞催化剂。

或者，将所述沉淀物再悬浮于溶解(lytic)缓冲液(50mM NaH₂PO₄，pH 7.0，300mM NaCl，2mM DTT)中，每1L所述缓冲液使用200g所述沉淀物。使用Branson数字超声波仪将细胞超声(3x15s)并通过沉降(10min，20000g，4℃)将细胞碎片去除。由此得到澄清的DERA 01水溶液。

实施例3：((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(IV)

将600mL DERA 01溶液、200mL反应缓冲液(50mM NaH₂PO₄，pH7.0，300mM NaCl，在水中)、100mL乙醛溶液(1.05M溶液，在反应缓冲液中)和100mL III’(500mM溶液，在反应缓冲液中)在搅拌的反应容器中混合，得到1L反应混合物。使用1M NaOH水溶液将所述混合物的pH值校正到7.0。将所述混合物在设置为37℃的温度控制浴中孵育3小时。在反应期间，在使用Synergy Fusion，250x4.6mm，4μm柱的具有ESI离子化的Triple-quadropole HPLC-UV-MS/MS系统上使用LC-MS分析来监测IV的产生。色谱条件如下：T_柱＝50℃，流量：1.5mL/min，V_inj＝50μl。以下面方式使用流动相：

A：在水中的0.1％(m/v)NH₄CH₃COO，pH＝6.5

B：Milli Q水

C：乙腈

线性梯度：

在反应期间已经观察到具有RT＝7.7+-0.5min以及质量为208(代表M+NH₄⁺)的峰面积的增长，但在各自用反应缓冲液替换反应混合物的一种组分的任何对照中却没有观察到这种情况。

用4L乙腈猝灭所述反应并加入50g NaCl。将混悬液冷却至0℃，并通过离心法(10min，6000g，4℃)将液相分离。称出上面的相并在减压下蒸发，得到8.4g浅黄色油状物(粗产物)。将所述粗产物在硅胶柱上纯化(流动相：乙腈/异丙醚＝1/1)。此后，在减压下将溶液蒸发从而得到2.4g产物IV。

(IV)：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ5.39(d，1H)，4.53(m，1H)，4.29(m，1H)，4.14(m，2H)，2.11(s，3H)，2.04-1.60(m，4H)，¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.8，91.7，68.1，66.8，63.3，33.9，20.7

实施例4：((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(IV)

将具有DERA 01的全细胞催化剂(300g)悬浮在750mL反应缓冲液(50mM NaH₂PO₄，pH 7.0，300mM NaCl，在水中)中，并在控制温度设置在37℃的搅拌容器中孵育。使用经校准的蠕动泵在2h反应时间内加入750mL底物溶液(630mM乙醛(III)，300mM在反应缓冲液中的溶液)。使用1M NaOH水溶液将pH控制在7.0。使所述反应再持续30min.，然后通过离心法(10min，6000g，4℃)将所述全细胞催化剂沉降。然后将上清液冷冻干燥从而得到19.4g浅黄色晶体(粗产物)。将所述粗产物在硅胶柱上纯化(流动相：乙腈/异丙醚＝1/1)。此后，在减压下将溶液蒸发从而得到7.4g产物IV。

(IV)：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ5.39(d，1H)，4.53(m，1H)，4.29(m，1H)，4.14(m，2H)，2.11(s，3H)，2.04-1.60(m，4H)，¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.8，91.7，68.1，66.8，63.3，33.9，20.7。

在所述反应期间，IV的生产使用LC-MS分析监控。在所述反应期间已经观察到质量为208(代表M+NH₄⁺)的峰面积的增长，并且2.5小时后用LC-MS对所述反应混合物定量分析显示存在13.1g/L IV。

实施例5：((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(IV)

将具有DERA 02的全细胞催化剂(3g)悬浮在6mL反应缓冲液(50mM NaH₂PO₄，pH 7.0，300mM NaCl，在水中)中。将2mL乙醛的溶液(2.1M溶液，在反应缓冲液中)和2mL III(1M溶液，在反应缓冲液中)在反应管中混合，得到10mL的反应混合物。使用1M NaOH水溶液将所述混合物的pH值校正到7.0。将所述混合物在控制温度设置在37℃的浴槽中孵育3小时。在所述反应期间，IV的生产使用LC-MS分析监控。在所述反应期间已经观察到质量为208(代表M+NH₄⁺)的峰面积的增长，但在各自用反应缓冲液替换反应混合物的一种组分的任何对照中却没有观察到这种情况，并且1小时后用LC-MS对所述反应混合物的定量分析显示存在8.7g/L IV。实施例6：((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(IV)

将56.6g III(92％)在1070mL反应缓冲液(50mM NaH₂PO₄，pH 7.0，150mM NaCl)中稀释。用NaHCO₃盐将该溶液的pH值调整到6.2。将510mL具有DERA 01的全细胞催化剂(700g/L加入到上述溶液中，并再次用NaHCO₃盐将pH值校正到6.2。将混合物在设定在37℃以及800rpm恒定搅拌的控温的2-L生物反应器中孵育3小时。将120mL稀释在反应缓冲液中的乙醛(45.4g)用程序控制的泵如下表所述在3小时内连续加入到所述反应混合物中：

在反应期间，pH未予校正且任其缓慢降至5.5的最终值。使用GC分析(色谱柱：DB-1100％二甲基聚硅氧烷；温度程序：起始温度：50℃，起始时间：5min，温度速率：10℃/min，最终温度：215℃，最终时间：10min；进样器：分流/不分流进样器，载气：氦，初始流速：10mL/min；检测器：火焰离子化检测器，检测器温度：230℃；色谱溶液：1-5mg IV/mL乙腈)通过监测保留时间5.17min(化合物III)、14.04min(化合物XII)、14.44min化合物(化合物XIII)和20.35min(化合物IV)来监控IV的产生。反应曲线示于图1中。

3小时后用GC对所述反应混合物的定量分析显示35.3g/L IV，67.7％摩尔收率。从实施例6中所描述得到的物质的进一步合成步骤中的化合物的对映体纯度分析显示99.8％或以上的对映体过量，这表明该物质具有非常高的对映体纯度。从实施例6中所描述的物质得到的进一步合成步骤中的化合物的非对映体纯度分析显示98％或以上的非对映体过量，这还表明IV的高非对映体纯度。

实施例7：((2S，4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(V)

将((2S，4R)-4，6-二羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(IV)(1当量)在水中的溶液冷却至0℃。加入碳酸钡(1.4当量)，接着逐滴加入Br₂(1.2当量)，并将所述反应在室温下搅拌过夜。用NaCl将所述溶液饱和并用EtOAc萃取四次。将所合并的有机相用MgSO₄干燥并浓缩。使用快速色谱法纯化(己烷/丙酮＝75/25到55/45)，得到((2S，4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(V)。

(V)：¹H NMR(300MHz，丙酮-d₆)δ4.88(m，1H)，4.45(d，J＝3.0Hz，1H)，4.38(六重峰，J＝3.0Hz，1H)，4.23(dd，J＝3.5Hz，J＝12.0Hz，1H)，4.16(dd，J＝5.5Hz，J＝12.1Hz，1H)，2.68(dd，J＝4.3Hz，J＝17.5HZ，1H)，2.51(dddd，J＝0.8Hz，J＝2.0Hz，J＝3.3Hz，J＝17.5Hz，1H)，2.03(s，3H)，1.91(m，2H)，¹³C NMR(75MHz，丙酮-d₆)δ170.8，169.7，74.2，66.5，62.7，39.1，32.3，20.6。

实施例8：((2S，4R)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(VI)

将((2S，4R-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(V)(1.88g，10mmol，1当量)溶解于无水DMF(2mL，1M)中。顺序加入咪唑(0.88g，1.3当量)和TBDMSCI(1.66g，1.1当量)并搅拌所述反应物直到所述反应完成。将反应混合物在水(20mL)与乙醚(20mL)之间分配。用乙醚(20mL)萃取水相一次。将所合并的有机相用少量水(10mL)、HCl 1N(20mL)以及盐水(20mL)洗涤两次。将溶液用MgSO₄干燥并浓缩从而以定量收率得到((2S，4R)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(VI)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ4.93(m，1H)，4.37(五重峰，J＝3Hz，1H)，4.30(dd，J＝3Hz，J＝12Hz，1H)，4.21(dd，J＝5Hz，J＝12Hz，1H)，2.62(d，J＝4Hz，2H)，2.11(s，3H)，1.84-1.80(m，2H)，0.89(s，9H)，0.09(2s，6H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ170.4，169.1，73.3，65.5，63.0，38.9，32.2，20.5，17.7，-5.1，-5.2。

实施例9：经由酶促反应将((2S，4R)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(VI)转化为(4R，6S)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-酮(VII)

将((2S，4R)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(VI)(50g，纯度80％；132.4mmol)加入到磷酸盐缓冲液(P.B.S.)pH＝5.20(1.5L)中，将所述溶液升温至37℃。然后分次(6次，8g+3x4g)加入胰酶粉末(0.5当量质量；20g)。同时，监测pH并通过每小时加入NaHCO₃溶液(1M)进行调节从而保持pH在4.85与4.95之间。在第一次加入酶之后，将反应物搅拌9小时。

将加入到粗混合物中。将溶液经由滤出。回收浅黄色液体。用1.5L EtOAc洗涤过滤器上的固体。将滤液搅拌5分钟。将两层分离。用EtOAc(1.5L)将水相再萃取一次。在40℃下在减压下将所合并的有机相部分蒸发并将产物从甲基环己烷中重结晶从而得到82％为白色晶体的(4R，6S)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-酮(VII)。所述反应的转化率几乎是定量的(＞98％)，具有小于0.1％的对映异构体。

用于测定对映异构体的GC分析以DCM溶液(2-3mg/mL)在Betadex120柱上使用分流/不分流进样器和FID检测器进行。

化合物VII的NMR分析未显示存在非对映异构体(即使用在检测限的高扫描累积)，这表明在VII中的非对映异构体水平低于1％。

实施例10：经由化学反应将((2S，4R)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(VI)转化为(4R，6S)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-酮(VII)

将((2S，4R)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)甲基乙酸酯(VI)(0.625g，纯度80％，1.65mmol)溶解在THF(8mL)和MeOH(8mL)中。加入锡催化剂(tBu₂SnClOH)₂(94mg，0.1当量)并将所述反应物搅拌过夜。将反应物浓缩并通过快速色谱法纯化从而得到纯的(4R，6S)-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-酮(VII)(126mg，30％)。发现VII含有小于0.1％的对映异构体。

用于测定对映异构体的GC分析以DCM溶液(2-3mg/mL)在Betadex120柱上使用分流/不分流进样器和FID检测器进行。

化合物VII的NMR分析未显示存在非对映异构体(即使在检测限高扫描累积)，这表明在VII中的非对映异构体水平低于1％。

经由酶促反应以及经由化学反应将化合物VI转化为化合物VII，得到了具有极好的对映体纯度(不需要的对映异构体少于0.1％)的产物，而且未观察到采用这两种方法所制备的化合物VII的对映体纯度的差异。同样地，所制备的化合物VII的非对映体纯度是高的，不需要的非对映异构体少于1％。因此，所述对映体以及非对映体过量来源于较早的合成步骤(例如，来源于醛缩酶催化的化合物III向化合物IV的转化)。