增强的产乙醇和丁醇微生物以及使用该微生物制备乙醇和丁醇的方法

摘要

本发明涉及具有增强的产乙醇和丁醇能力的重组微生物以及使用该微生物制备乙醇和丁醇的方法，更具体地说，本发明涉及具有增强的产乙醇和丁醇能力的重组微生物以及使用该微生物制备乙醇和丁醇的方法，其中编码CoA转移酶的基因和编码乙醇/乙醛脱氢酶的基因被引入到所述微生物中。根据本发明的通过代谢途径的操作得到的重组微生物能够专门产生丁醇和乙醇而不产生任何副产物，因此作为生产工业溶剂和运输燃料的微生物是有用的。

说明书

技术领域

本发明涉及具有增强的产乙醇和丁醇能力的重组微生物以及使用该微生物制备乙醇和丁醇的方法，更具体地说，本发明涉及具有增强的产乙醇和丁醇能力的重组微生物以及使用该微生物制备乙醇和丁醇的方法，其中编码CoA转移酶的基因和编码乙醇/乙醛脱氢酶的基因被引入到所述微生物中。

背景技术

目前，乙醇和丁醇作为工业溶剂有着巨大的市场，并且使用它们作为用于运输工具诸如汽车及类似物的燃料的可能性正被实现，因此预期，对于乙醇和丁醇的需要持续增加。

传统上，乙醇(C₂H₅OH)通过发酵淀粉或者糖来制备，近来大多数酒精饮料通过这种方法制备。但是，除了酒精饮料制备以外，目前正在通过合成方法制备乙醇，包括使用从作为原材料的石油得到的乙烯(ethene)：硫酸水解法，其中将乙烯吸收到硫酸中产生乙醇的硫酸酯，然后水解产生乙醇与二乙醚；以及直接水解法，其中通过接触使用固体磷酸催化剂接触允许气相中的乙烯与水蒸气反应，由此导致直接合成乙醇。但是，这些方法具有的缺点在于，其以石油作为基本原料，在硫酸水解法的情况下，需要大规模的厂房用于大量硫酸的浓缩和循环。

同时，丁醇(C₄H₉OH)的全世界产量被估计为大约110万吨/每年。现全部可从市场上购买的丁醇都通过化学合成产生。与乙醇的情况相同，丁醇的化学合成也使用石油作为原料产生丙烯，丙烯通过氧化步骤合成丁醇。这种使用石油作为原料的涉及高温高压的方法在成本和能量方面都是不足的(Tsuchida等人，Ind.Eng.Chem.Res.，45：8634，2006)。也就是说，通过石油化学的乙醇和丁醇生产存在的问题是生产过程中，排出了大量有害废物、废水和废气(包括一氧化碳)，尤其是具有将化石燃料用作基本原料的限制。

如上所述，迄今为止生产的大多数丁醇通过化学合成产生。尽管由于油价升高以及相关环境问题，全世界范围内对生物乙醇和生物丁醇的兴趣已经迅速增加，但还没有专门有效生产生物乙醇和生物丁醇的例子。

迄今为止，大多数通过发酵生产丁醇和乙醇的方法使用梭菌(Clostridium)，在一种情况下，通过引入3种基因以制备质粒(pFNK6)：将编码乙酰乙酸脱羧酶的基因(adc)，编码CoA转移酶A的基因(ctfA)以及编码CoA转移酶B的基因(ctfB)引入到载体中并使用abc启动子构建人造操纵子，然后将质粒引入到丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824中，从而与野生型相比将丙酮、丁醇和乙醇的产量分别增加95％、37％和90％(Mermelstein等人，Biotechnol.Bioeng.，42：1053，1993)。存在另一种情况，其中与野生型相比，aad(乙醇/乙醛脱氢酶)的克隆和过表达导致与丙酮产量相比丁醇和乙醇产量相对提高(Nair等人，J.Bacteriol.，176：871，1994)。另外，已经尝试将buk(丁酸激酶)和pta(磷酸转乙酰基酶)失活作为基因功能失活的方式，并且报道了pH 5.0以上其buk基因被失活的菌株(PJC4BK)发酵导致了丁醇产量的显著增加，达到16.7g/l(Harris等人，Biotechnol.Bioeng.，67：1，2000)。但是，pta的失活被报道在溶剂生产方面与野生型相比没有显示差别(Harris等人，Biotechnol.Bioeng.，67：1，2000)。此外，将通过随机突变得到的作为突变菌株的贝氏梭状芽胞杆菌(Clostridium beijerinckii)BA101使用麦芽糊精(maltodextrin)作为碳源进行发酵，并报道产生了18.6g/l的丁醇(Ezeji等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，63：653，2004)。但是，上述结果是生产丁醇和乙醇以及作为副产品的丙酮的例子，具有的缺点在于在不除去丙酮的情况下，由于丙酮的性质，它们不能用作燃料。

存在使用重组微生物生产乙醇和丁醇而没有丙酮产生的情况，所述微生物通过将aad(乙醇/乙醛脱氢酶)引入到丙酮丁醇杆菌(Clostridium acetobutylicum)突变菌株中来构建，该突变菌株缺失所有adc(编码乙酰乙酸脱羧酶的基因)、ctfA(编码CoA转移酶A的基因)、ctfB(编码CoA转移酶B的基因)和aad(编码乙醇/乙醛脱氢酶的基因)的功能；但是，该方法具有的问题在于产量低，因为丁醇和乙醇的终浓度分别为84mM和8mM(Nair等人，J.Bacteriol.，176：5843，1994)。含有另一种生产丁醇的情形，其通过将携带了丙酮丁醇杆菌(Clostridium acetobutylicum)基因的重组载体引入到大肠杆菌菌株中(Shota等人，Metab.Eng.，In Press，2007)，但产生的丁醇的最大浓度很低，浓度为552mg/l，使其不可能工业应用。

因此，存在对于开发可高效产生丁醇或者乙醇和丁醇混合物并且不产生副产物诸如丙酮，使它们可直接作为燃料使用的微生物的迫切需要。

因此，本发明的发明人付出了极大努力来开发以乙醇和丁醇合成途径为基础的能够高产量生产乙醇和丁醇并且不产生副产物的微生物(图1)，结果，通过克隆来自丙酮丁醇杆菌ATCC 824的两种酶：(1)编码CoA转移酶的ctfAB，所述转移酶分别将乙酸和丁酸转化成乙酰CoA和丁酰CoA，以及(2)编码乙醇/乙醛脱氢酶的adhE1，所述转移酶分别将乙酰CoA和丁酰CoA转化成乙醇和丁醇，并将克隆的基因引入到不能产生有机溶剂的宿主微生物中构建了重组微生物，并确认重组微生物在产生高浓度的乙醇和丁醇的同时不产生作为副产物的丙酮，由此完成了本发明。

发明内容

因此，本发明的主要目的在于提供高效产生丁醇或者乙醇/丁醇混合物并且不产生副产物的重组微生物，以及构建该重组微生物的方法。

本发明的另一目的在于提供使用所述重组微生物制备乙醇和丁醇的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了构建具有增强的产生乙醇和丁醇能力的重组微生物的方法，所述方法包括将编码将乙酸和丁酸分别转化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶的基因和/或编码将乙酰CoA和丁酰CoA分别转化成乙醇和丁醇的基因引入到宿主微生物中，所述宿主微生物具有编码在乙酰CoA转化成丁酰CoA的生物合成途径中参与的酶的基因。

本发明还提供了具有增强的产生乙醇和丁醇能力的重组微生物，所述微生物具有引入或扩增到宿主微生物中的编码将乙酸和丁酸分别转化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶的基因；和/或编码将乙酰CoA和丁酰CoA分别转化成乙醇和丁醇的基因，所述宿主微生物具有编码在乙酰CoA转化成丁酰CoA的生物合成途径中参与的酶的基因。

另外，本发明提供了制备乙醇和/或丁醇的方法，所述方法包括培养所述重组微生物的步骤和从培养液中回收乙醇和/或丁醇的步骤。

通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将更加明确。

附图说明

图1是显示没有产生乙醇和丁醇的能力的丙酮丁醇杆菌退化菌株的代谢途径(A)，以及用于在通过将ctfAB和adhE1引入到退化菌株中构建的重组菌株中合成乙醇和丁醇的代谢途径(B)的示意图。

图2是含有ctfAB和adhE1的重组载体pIMP1::adhE1.ctfAB的基因图谱。

具体实施方式

在本发明中，为了开发以乙醇和丁醇合成途径为基础的能够高产量产生乙醇/丁醇并且不产生副产物诸如丙酮的微生物(图1)，克隆了来自丙酮丁醇杆菌ATCC 824的下列两种酶：(1)编码CoA转移酶的ctfAB，所述转移酶分别将乙酸和丁酸转化成乙酰CoA和丁酰CoA，以及(2)编码乙醇/乙醛脱氢酶的adhE1，所述转移酶分别将乙酰CoA和丁酰CoA转化成乙醇和丁醇，然后将克隆的基因引入到具有编码在乙酰CoA转化成丁酰CoA的生物合成途径中参与的酶的基因并且不具有产生有机溶剂诸如丙酮的能力的宿主微生物中，由此构建了重组微生物。

因此，本发明涉及构建具有增强的产乙醇和丁醇能力的重组微生物的方法，所述方法包括将编码将乙酸和丁酸分别转化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶的基因，和/或编码将乙酰CoA和丁酰CoA分别转化成乙醇和丁醇的酶的基因引入或者扩增到宿主微生物中，所述宿主微生物具有编码在乙酰CoA转化成丁酰CoA的生物合成途径中参与的酶的基因。

本发明还涉及构建具有增强的产乙醇和丁醇能力的重组微生物，其具有被引入或者扩增到宿主微生物中的编码将乙酸和丁酸分别转化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶的基因，和/或编码将乙酰CoA和丁酰CoA分别转化成乙醇和丁醇的酶的基因，所述宿主微生物具有编码在乙酰CoA转化成丁酰CoA的生物合成途径中参与的酶的基因。

在本发明中，这里使用的术语“扩增”广义上指的是如下过程：相关基因的一些碱基的突变、替换或者缺失，和插入；或者引入来自其他微生物的编码相同酶的基因以增加相应酶的活性。

在本发明中，所述用于将乙酰CoA转化成丁酰CoA的生物合成途径优选[乙酰CoA→乙酰乙酰CoA→3-羟基丁酰CoA→丁烯酰CoA→丁酰CoA]。

在本发明中，宿主微生物优选具有被阻断的丙酮生物合成途径，因此丙酮产量低于有机溶剂总产量的10％。在所述丙酮生物合成途径中adc(编码乙酰乙酸脱羧酶的基因)可被缺失，但不限于此。并且所述宿主微生物优选得自梭菌属，但不限于此，只要其具有将乙酰CoA转化成丁酰CoA的生物合成途径即可。

在本发明中，将乙酸和丙酮酸分别转化成乙酰CoA和丁酰CoA的酶优选为CoA转移酶；并且编码CoA转移酶的基因为ctfAB。而且，分别将乙酰CoA和丁酰CoA转化成乙醇和丁醇的酶优选为乙醇/乙醛脱氢酶；并且编码乙醇/乙醛脱氢酶的基因为adhE1。本发明仅仅使用来自丙酮丁醇杆菌ATCC 824的ctfAB和adhE1作为例子，但来自其他微生物的基因也可被使用而没有限制，只要它们在将它们引入其中的宿主细胞中表达并具有相同活性即可。

在本发明的实施例中，使用的宿主微生物为缺少巨大质粒(megaplasmid，携带127个基因，包括编码乙酰乙酸脱羧酶的基因，编码CoA转移酶的基因和编码乙醇/乙醛脱氢酶的基因)的丙酮丁醇杆菌的突变株M5。丙酮丁醇杆菌的突变株M5是其丙酮生物合成途径被阻断的微生物(图1)。在本发明中，仅仅丙酮丁醇杆菌M5被用作其丙酮生物合成途径被阻断的梭菌属宿主微生物的例子，但丙酮丁醇杆菌1NYG、4NYG、5NYG和DG1(Stim-Herndon，K.P.等人，Biotechnol./Food Microbiol.，2：11，1996)、丙酮丁醇杆菌ATCC 824型IV、M3、M5、2-BB R、2-BB D、RifB12、RifD10、RifF7以及丁酸梭菌(C.butyricum)ATCC 860(Clark，S.W.等人，Appl.Environ.Microbiol.，55：970，1989)也可被使用。在本发明中，可以确定当通过将携带所述ctfAB和adhE1的重组载体(pIMP1::adhE1.ctfAB)引入到所述宿主微生物中构建重组微生物M5(pIMP1::adhE1.ctfAB)并进行培养时，其在产生了高浓度的丁醇/乙醇的同时几乎不产生丙酮。

因此，在另一方面，本发明涉及制备乙醇和/或丁醇的方法，所述方法包括培养所述重组微生物并从培养液中回收乙醇和/或丁醇的步骤。

在本发明中，培养重组微生物和回收乙醇和丁醇的过程可使用常规培养方法以及发酵领域已知的用于乙醇/丁醇分离和纯化的常规方法来进行。另外，虽然乙醇和丁醇的回收常常在完成培养之后进行，但其可在培养过程中使用正确方法诸如气体剥离法(gas-stripping method)(Thaddeus等人，Bioprocess Biosyst.Eng.，27：207，2005)来进行以便提高产量。也就是说，在连续培养的同时在培养过程中回收产生的乙醇和丁醇也落入本发明的范围之内。

相反，虽然本发明仅仅示出了其中丁醇生物合成途径被阻断的情形，但存在有关通过在丙酮丁醇杆菌ATCC 824菌株中阻断丁酸生物合成途径来提高丁醇产生的报告(Harris等人，Biotechnol.Bioeng.，67：1，2000)；因此可以推断乙醇和丁醇的生产可通过阻断在图1的新陈代谢途径中将丁酰CoA转化成丁酸的生物合成途径来提高。作为替代方法，能够利用乙酸的基因诸如acs和atoDA的引入也可增加乙醇和丁醇的产量。

实施例

此后，将参照实施例对本发明进一步进行详细描述。但是应当理解的是，这些实施例仅用于说明的目的，而不解释为对本发明范围的限制。

尤其是，下列实施例示出了特定突变株丙酮丁醇杆菌M5作为能够产生有机溶剂的宿主菌株，但是本领域技术人员容易想到的是，具有将乙酰CoA转化成丁酰CoA的生物合成途径并且其有机溶剂生物合成途径被阻断的梭菌属或者其他属的其他微生物也可用作宿主菌株，并且相同的基因可被引入到用于乙醇和丁醇生产的宿主菌株中。

实施例1：含有编码乙醇/乙醛脱氢酶的adhE1基因和编码CoA转移酶的ctfAB基因的重组载体的制备

将分别具有序列号：3、序列号：4和序列号：5碱基顺序的丙酮丁醇杆菌ATCC 824的adhE1、ctfA和ctfB基因使用启动子及其转录终止序列一起克隆。首先使用丙酮丁醇杆菌ATCC 824的染色体DNA作为模板，使用序列1和序列2作为引物进行PCR(表1)，然后将得到的adhE1、ctfA和ctfB使用限制酶SalI切割并插入到使用相同限制酶切割的梭菌/大肠杆菌穿梭载体pIMP1(Mermelstein，L.D.等人，Bio/Technol.，10：190，1992)中，由此制备重组载体pIMP1::adhE1.ctfAB(表2)。来自丙酮丁醇杆菌ATCC 824的编码乙醇/乙醛脱氢酶和CoA转移酶的基因(adhE1、ctfAB)由此被克隆。

表1：PCR条件

分析克隆的来自丙酮丁醇杆菌ATCC 824的adhE1和ctfAB基因的碱基序列，并推导乙醇/乙醛脱氢酶和CoA转移酶的氨基酸序列。结果，丙酮丁醇杆菌ATCC 824的adhE1和ctfAB的DNA序列(序列3、序列4和序列5)和氨基酸序列(序列6、序列7和序列8)被鉴别。

实施例2：重组微生物的构建

M5(pIMP1::adhE1.ctfAB)菌株通过将在实施例1中构建的重组载体pIMP1::adhE1.ctfAB经电转化引入到丙酮丁醇杆菌M5菌株中来构建。首先，将实施例1的重组载体引入到含有表达枯草芽胞杆菌噬菌体(Bacillus subtilis Phage)Φ3T I甲基转移酶(Mermelstein等人，Appl.Environ.Microbiol.，59：1077，1993)的载体pAN1的大肠杆菌TOP10中以诱导其甲基化，使载体变得适于转化到梭菌中。从大肠杆菌中分离并纯化甲基化的载体，然后引入到缺少巨大质粒(携带176个基因，包括编码乙酰乙酸脱羧酶的基因，编码CoA转移酶的基因和编码乙醇/乙醛脱氢酶的基因)的丙酮丁醇杆菌M5的突变株(Cornillot等人，J.Bacteriol.，179：5442，1997)中，由此制备重组微生物。另外，将用作克隆载体的pIMP1引入到丙酮丁醇杆菌M5菌株中，由此制备M5(pIMP1)菌株。

制备M5感受态细胞(competent cell)用于如下转化：首先，将M5菌株接种到10ml的CGM(表2)中并培养至OD为0.6。将培养液接种到60ml的2X YTG培养基(每升含有Bacto蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl 4g和葡萄糖5g)中至浓度为10％并将细胞培养4-5小时。使用转化缓冲液(EPB，270mM蔗糖15ml，686mM NaH₂PO₄110μl，pH 7.4)将微生物细胞洗涤两次，然后悬浮在2.4ml的相同缓冲液中。将由此制备的600μl的M5感受态细胞(competent cell)与25μl重组质粒DNA混合，将混合物装载到具有4mm电极间隙的试管中，然后在2.5kV和25μF下进行电击，接着在1ml的2X YTG培养基中立即悬浮以在37℃培养3小时；由此通过涂布在含有40μg/ml红霉素的固体2X YTG培养基上选择转化体。

表2：CGM培养基的组分

  组分  浓度(g/l)  葡萄糖  80  K₂HPO₄·3H₂O  0.982  KH₂PO₄  0.75  MgSO₄  0.348  MnSO₄·H₂O  0.01  FeSO₄·7H₂O  0.01  (NH₄)₂SO₄  2  NaCl  1  天冬氨酸  2  PABA(对氨基苯甲酸)  0.004  酵母提取物  5

实施例3：使用重组微生物M5(pIMP1::adhE1.ctfAB)生产乙醇/丁醇

将实施例2中制备的重组微生物M5(pIMP1::adhE1.ctfAB)进行培养以便检查其性能。将30ml的含有10ml CGM培养基的测试管进行灭菌，在超过80℃的温度下取出，填充氮气，并在厌氧室内冷却至室温。然后，将40μg/ml红霉素加入到培养基中，并接种重组微生物，然后在厌氧条件下37℃预培养至600nm处的吸收值为1.0。将含有100ml具有所述组分的培养基的250ml烧瓶灭菌，所述培养基接种6ml所述预培养液，并在厌氧条件下37℃进行第二次预培养至600nm处的吸收值为1.0。然后，将含有具有所述组分的2.0L培养基的5.0L发酵罐(LiFlus GX，Biotron Inc.，Kyunggi-Do，Korea)灭菌，并在冷却至室温的同时在从灭菌后高于80℃的温度开始在超过10小时的时间段以0.5vvm补充氮气；然后将40μg/ml红霉素加入到培养基中，接着接种100ml的第二次预培养液在37℃下200rpm培养60小时。通过自动供给5N NaOH将pH保持在5.5，同时在整个培养过程中以0.2vvm(空气体积/工作体积/分钟)补充氮气。

使用葡萄糖分析仪(model2700STAT，Yellow Springs Instrument，Yellow Springs，Ohio，USA)测定培养基中的葡萄糖；并在不同时间点取出等份的培养基以便使用装备有填充柱(Supelco Carbopack^TM BAW/6.6％PEG 20M，2m×2mm ID，Bellefonte，PA，USA)的气相色谱(Agillent 6890N GC System，Agilent Technologies Inc.，CA，USA)测定其中产生的丙酮、乙醇和丁醇的浓度。

如在表3中显示的那样，结果显示对照菌株M5(pIMP1)不产生乙醇和丁醇，而重组菌株M5(pIMP1::adhE1.ctfAB)产生高浓度的乙醇和丁醇并且几乎不产生丙酮(低于0.5g/l)。此外发现，除产生终浓度高的乙醇和丁醇之外，产率也得到提高。

同时，已知在丙酮丁醇杆菌ATCC 824菌株的情况下，丙酮产量大约为总有机溶剂产量的28％(Harris等人，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，27：322，2001)；但在本发明的重组菌株的情况下，发现丙酮产量不到大约5％，表明其产量可以忽略。

表3：通过重组微生物生产有机溶剂

工业实用性

如上面详细描述的那样，本发明具有通过特定基因的引入和扩增提供具有高产量的产乙醇和丁醇能力的重组微生物的效果。基于代谢途径的操作，根据本发明的重组微生物不仅显示几乎不产生副产物诸如丙酮，而且增强了单位时间内乙醇和丁醇的产量。因此，本发明的微生物对于乙醇/丁醇的工业生产来说是有用的。

虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，本领域技术人员容易想到的是，本说明书仅仅用于优选实施方式，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由随附的权利要求书及其等同物来限定。