一种用于治疗尖锐湿疣和扁平疣的药物组合物及其制备工艺

摘要

本发明公开了一种用于治疗尖锐湿疣和扁平疣的药物组合物及其制备方法，其原料组分如下：鸦胆子350g，红花50g，95％乙醇1000ml。制备工艺如下：称取过五号筛的鸦胆子细粉350g置有盖的容器中，再称取过五号筛的红花细粉50g放入容器中，加95％乙醇800ml，密闭，在常温暗处浸渍7天，并每天搅拌或振摇，倾出上清液，再加95％乙醇480ml，再浸渍7天，倾出上清液，用双层纱布过滤，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，并合并上清液，静止24小时，用定性滤纸过滤，加95％乙醇至1000ml即得。本发明主要用于尖锐湿疣和扁平疣的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于治疗尖锐湿疣和扁平疣的药物组合物及其制备工艺。

背景技术

尖锐湿疣(Condyloma auminatum，CA)，又称性病疣、生殖器疣，是一种常见的性传播疾病，由人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)感染所致，主要选择性感染皮肤和黏膜上皮所致鳞状上皮增生性疣状病变，与性接触传染密切相关的一种性传播疾病，也可自身接种及非性接触途径感染。长期的皮肤潮湿不洁、分泌物刺激、局部摩擦引起的皮肤慢性炎症损害时本病发生的主要诱因。HPV是一种感染皮肤表面和粘膜鳞状上皮的肿瘤病毒，在肛门生殖器肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。HPV有多种类型，引起本病的主要类型为HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，其中HPV16和18长期感染可能与癌变的发生有关。扁平疣亦是由HPV感染所致，且为皮肤科临床常见病之一。

据了解，近年来，尖锐湿疣在我国发病率剧增，仅次于淋病，居性病第二位，近年来受到广泛关注，应引起足够高的重视和警惕。我国性病麻风病控制中心公布2000年我国性病的发病趋势和流行特点表明，尖锐湿疣是我国第三高发STD，其发病率逐年升高，增长幅度为5.62％。申请人对2002～2005年门诊的3489例尖锐湿疣病人进行追踪记录，调查显示，其中男性74.92％，女性占25.08％；21～30岁年龄组占40.01％，31～40岁组占32.42％；已婚为主，占70.45％；职业以干部、职员居多，占25.25％；病例大多数是本地人员；传播途径以非婚性接触为主^[2]。

尖锐湿疣的潜伏期为1～6个月，通常为3个月。男性好发于冠状沟、包皮、龟头、系带、尿道口、阴茎体、肛周和阴囊。女性好发于大小阴唇、会阴、阴道口、阴道内、尿道内、宫颈、肛周等。临床表现典型者初起为针尖大的丘疹，呈淡红色、暗红色或污灰色，迅速变大形成柔软成簇的高起指状疣，亦可为乳头状隆起的小丘疹，逐渐增大变多，有时融合或相互重叠呈乳头状，甚至可发展成巨大的菜花状，根部常有蒂，湿润柔软，易发生糜烂、渗液，激发感染可带有恶臭。

尖锐湿疣发病数逐年增加，由于其复发率较高，这不仅增加患者罹患HPV相关恶性肿瘤(如宫颈癌)和其他STD的几率，也成为STD相关病原体在人群中传播的重要因素之一。其可能的复发原因有：存在HPV亚临床感染和潜伏感染；CA患者的细胞免疫功能存在异常；雌激素的作用；治疗不规范、性伴侣未治疗等。罹患尖锐湿疣与HIV感染密切相关，两者相互促进。尖锐湿疣组织质地较脆，易出血和发生糜烂，成为HIV易感因素之一。感染HIV后可导致机体免疫力下降，使患者HPV易感性增加。研究和防治尖锐湿疣，降低复发率是控制艾滋病疫情在我国蔓延的重要手段和策略之一。

CA治疗方法很多，主要以局部治疗为主，包括外用药物和物理治疗两方面。临床治愈并不困难。但复发率极高，最低复发率为25％。外用去除CA的药物用量过少未能去除疣体基底部；外用药物过量导致正常的皮肤、粘膜损伤，引起水肿、糜烂或溃疡，使病毒扩散；物理治疗范围过小，虽然去除了肉眼可见的疣体，但是在疣体周围亚临床感染的病灶未能清除；物理治疗深度不够，则未能清除疣体的基底部分；一些小的或者不典型的CA皮损在治疗中被忽视和遗漏，均能造成治疗不规范，可能与尖锐湿疣复发有着密切联系。故利用中医药对机体全身调整的优势，结合外治，通过提高机体免疫力是治疗CA的发展方向，对尖锐湿疣进行综合治疗以提高治愈率和减少复发率具有重要的临床价值。诸多医家运用中医药治疗CA在临床上已经取得了满意的效果，但目前开发成成品制剂投放市场的品种屈指可数。

中医认为该病的病机可用三个字来概括：湿、毒、瘀。其治法和药物主要也以清热解毒和化瘀散结类为主。治疗途径以外治熏洗坐浴和涂搽或内外治结合为主。从外用搽剂的情况来看，已经进入市场针对性强的、疗效好的、复发率低的中药成品制剂还十分缺乏，因此非常有必要开发这方面的中药新制剂。

发明内容

本发明所要解决的问题是：如何提供一种用于治疗尖锐湿疣和扁平疣的药物组合物及其制备工艺，该祛疣搽剂克服了现有技术中的偏见，具有良好的治疗效果。

本发明所提出的技术问题是这样解决的：提供一种用于治疗尖锐湿疣和扁平疣的药物组合物，其特征在于，其原料组分如下：

鸦胆子            300～400g

红花              30～70g

95％乙醇          900～1200ml

按照本发明所提供的用于治疗尖锐湿疣和扁平疣的药物组合物，其特征在于，其原料组分如下：

鸦胆子            350g

红花              50g

95％乙醇          1000ml

一种用于治疗尖锐湿疣和扁平疣的药物组合物的制备工艺，其特征在于，具体步骤如下：称取过五号筛的鸦胆子细粉300～400g置有盖的容器中，再称取过五号筛的红花细粉30～70g放入容器中，加95％乙醇800ml，密闭，在常温暗处浸渍5～9天，并每天搅拌或振摇，倾出上清液，再加95％乙醇480ml，再浸渍5～9天，倾出上清液，用双层纱布过滤，压榨残渣使其浸出残液，并合并上清液，静止20～28小时，用定性滤纸过滤，加95％乙醇至900～1200ml即得。

一种用于治疗尖锐湿疣和扁平疣的药物组合物的制备工艺，其特征在于，具体步骤如下：称取过五号筛的鸦胆子细粉350g置有盖的容器中，再称取过五号筛的红花细粉50g放入容器中，加95％醇800ml，密闭，在常温暗处浸渍7天，并每天搅拌或振摇，倾出上清液，再加95％乙醇480ml，再浸渍7天，倾出上清液，用双层纱布过滤，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，并合并上清液，静止24小时，用定性滤纸过滤，加95％醇至1000ml即得。

按照本发明所提供的用于治疗尖锐湿疣和扁平疣的药物组合物，其特征在于，其剂型为搽剂。

本发明的有益效果：本发明所选配方具有降低人乳头瘤病毒的DNA拷贝数的作用，对人乳头瘤病毒的杀灭作用，适于尖锐湿疣以及由人类乳头瘤病毒所引起的各种疣的治疗，毒副作用小，疗效独特，治愈率高，复发率低。

附图说明

图1是本发明的一种实施例的制备工艺流程图；

图2祛疣搽剂对HPV-DNA作用结果。

具体实施方式

下面结合实施例以及实验对本发明作进一步描述：

本发明所提供的用于治疗尖锐湿疣和扁平疣的药物组合物，原料组分如下：

鸦胆子            300～400g

红花              30～70g

95％乙醇          900～1200ml

称取过五号筛的鸦胆子细粉300～400g置有盖的容器中，再称取过五号筛的红花细粉30～70g放入容器中，加95％乙醇800ml，密闭，在常温暗处浸渍5～9天，并每天搅拌或振摇，倾出上清液，再加95％乙醇480ml，再浸渍5～9天，倾出上清液，用双层纱布过滤，压榨残渣使其浸出残液，并合并上清液，静止20～28小时，用定性滤纸过滤，加95％醇至900～1200ml即得。

以下是本发明的具体实施例

实施例1

原料组分：

鸦胆子            350g

红花              50g

95％乙醇          1000ml

称取过五号筛的鸦胆子细粉350g置有盖的容器中，再称取过五号筛的红花细粉50g放入容器中，加95％乙醇800ml，密闭，在常温暗处浸渍7天，并每天搅拌或振摇，倾出上清液，再加95％乙醇480ml，再浸渍7天，倾出上清液，用双层纱布过滤，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，并合并上清液，静止24小时，用定性滤纸过滤，加95％乙醇至1000ml即得。流程图如图1所示。

实施例2

原料组分：

鸦胆子        300g

红花          30g

95％乙醇      800ml

称取过五号筛的鸦胆子细粉300g置有盖的容器中，再称取过五号筛的红花细粉30g放入容器中，加95％乙醇800ml，密闭，在常温暗处浸渍5天，并每天搅拌或振摇，倾出上清液，再加95％乙醇480ml，再浸渍9天，倾出上清液，用双层纱布过滤，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，并合并上清液，静止24小时，用定性滤纸过滤，加95％乙醇至800ml即得。

实施例3

鸦胆子        400g

红花          70g

95％乙醇      1200ml

称取过五号筛的鸦胆子细粉400g置有盖的容器中，再称取过五号筛的红花细粉70g 放入容器中，加95％乙醇800ml，密闭，在常温暗处浸渍9天，并每天搅拌或振摇，倾出上清液，再加95％乙醇480ml，再浸渍5天，倾出上清液，用双层纱布过滤，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，并合并上清液，静止24小时，用定性滤纸过滤，加95％乙醇至1200ml即得。

组分说明：

1、鸦胆子：

鸦胆子为果实类药材，含有挥发油、黄酮、蒽醌、皂甙等成分；种子中含有多种苦木苦味素类成分：鸦胆子苦素(Bruceine)A、B、C、D、E、F、G及鸦胆子苦醇(Brusatol)，鸦胆子甙(Bruceoside)A、B、鸦胆子甙等。此外，含植物毒蛋白，即鸦胆子毒素(Brutoxin)；生物碱：鸦胆子碱(Brucamarin)等。鸦胆子种仁中含脂肪油，油中含油酸、三油酸甘油酯、亚油酸、软脂酸、硬脂酸、二十六烷酸及鸦胆子酸(Brucedic acid，为羟基脂肪酸)。该品种生产工艺中采用乙醇浸泡，各类成分均可溶出。

2、红花：

红花主要含红花黄色色、红花甙、黄酮等成分，另含有脂肪油(棕榈酸、硬脂酸、花生酸、亚油酸、亚麻酸等)。

本发明主要用于尖锐湿疣和扁平疣的治疗，现代医学指出尖锐湿疣和扁平疣是由人乳头瘤病毒(HPV)感染所致；中医理论则认为疣是风湿热邪客于肌表，或兼内动肝火，使脏腑气机失常，经络受阻，气血不和，腠理不密复感外邪，凝聚肌肤而致病。鸦胆子中有效成分鸦胆子油具有抗HPV的作用，能使瘤组织细胞发生退行性改变或坏死，治疗疣及乳头状瘤有效；红花具有活血通经、散瘀止痛的功效，其有效成分包括色素类、黄酮类、脂肪酸等。处方中主药的有效成分多能溶于乙醇。尖锐湿疣好发于性器官黏膜处，扁平疣病变主要在皮肤，好发于面部及手背部，均适宜采用外用制剂治疗。因此采用乙醇为溶剂，制成外用搽剂(祛疣搽剂)，临床试用结果表明：这种剂型携带使用方便，患者依从性好。因此将剂型定为搽剂。

本发明的制备工艺为浸渍法，是根据处方中药物有效成分的理化性质所选择的方法：

处方中药物的有效成分多数能溶于乙醇，因此以95％乙醇为提取溶剂，以浸出物的含量(测定方法参照《中国药典》2005版附录X A)为评价指标，分别考察了浸渍法、渗漉法和回流提取法三种方法，具体方法如下，所得结果见表1：

浸渍法：取鸦胆子175g各3份粉碎成中粉，分别置3个有盖的容器中，另取红花25g各3份粉碎成中粉，置上述容器中(批号分别为：0904282，09051411，09051412)，分别加入95％乙醇400ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍7天，倾出上层液，再分别加入95％乙醇240ml，再浸7天，倾出上层液，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，分别加乙醇至500ml即得。

浸出物含量测定：分别精密量取三批滤液各20ml，置干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量(％)，取其三批醇溶性浸出物的含量(％)的平均值结果见表1

渗漉法：①称取鸦胆子175g各3份粉碎为中粉，分别置3个有盖的容器中，另取红花25g各3份粉碎为中粉，置上述容器中(批号分别为：0905142，0905191，0905192)②润湿：加入药粉1倍量的溶剂(95％乙醇200ml)，拌匀后，密闭放置24小时，使药粉充分的均匀润湿和膨胀③分别装筒：筒底部用脱脂棉花铺上，再加中粉铺上，加入润湿的药粉层层压实装入渗漉筒，并使松紧一致，上部用重物压紧④分别排气：药粉填装完毕，开渗漉筒下口，加入95％的乙醇至下口流出，上层95％乙醇浸渍药粉表面20cm，关闭下口⑤分别浸渍：浸渍放置24小时，使溶剂充分渗透扩散⑥分别渗漉：打开下口接收滤液，上部连续添加95％乙醇，以每分钟流出2ml的速度渗漉，收取滤液，每收取50ml，观察滤液色泽，作下记录，直至收取到500ml为止。按上述浸出物含量测定方法测定三批制剂的醇溶性浸出物的含量，取其平均值，结果见表1

回流提取法：将鸦胆子175g各3份粉碎成中粉，红花25g各3份粉碎成中粉(批号分别为：090526，090527，090528)，分别置圆底烧瓶中，加入95％乙醇640ml，分别按“回流提取法”装置，加热回流提取9小时，水浴温度80～85℃。回流完毕，冷却至室温，过滤，收集滤液465ml，再从滤器上加95％乙醇至500ml，搅匀即得，按上述浸出物含量测定方法测定三批制剂的醇溶性浸出物的含量，取其平均值，结果见表1

表1  三种提取方法所得浸出物含量比较

由表1可见：回流提取法和浸渍法得到的浸出物含量相对较高，而浸渍法的设备简单，操作方便，有利于规模化生产，综合考虑后选择浸渍法。

本发明的组分粉碎度对浸出物含量的影响：

分别取鸦胆子药材175g和红花药材25g各3份，按《中国药典》规定制取鸦胆子和红花粗粉(过二号筛)，中粉(过四号筛)，细粉(过五号筛)，分别加入95％乙醇400ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍7天，倾出上层液，再加入95％乙醇240ml，再浸7天，倾出上层液，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，加乙醇至500ml后，精密量取20ml，置干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量，以干燥品计算供试品在乙醇中的可溶性溶出物的含量(％)，考察药材粉碎度对浸出物含量的影响，所得结果见表2

表2  药材粉碎度对浸出物含量的影响

由表2可见，鸦胆子和红花的粉碎程度对浸出物含量有影响，其中细粉的提取效果最好，中粉次之，粗粉提取效果最差。因此宜用细粉进行提取。

本发明的工艺条件的筛选：

通过预试验，选择浸渍时间(A)，浸渍次数(B)和乙醇浓度(C)为考察因素，每个因素选择3个水平，以浸出物的含量作为评价指标，采用浸渍法，按L₉(3⁴)正交试验表进行试验(D为空白列)，因素水平见表2，正交试验结果见表3

表3  因素水平

表4  正交试验结果

正交试验方法

试验1：分别取鸦胆子药材175g和红花药材25g各3份(批号分别为：09060211，09060212，09060213)按《中国药典》规定制取鸦胆子和红花细粉(过五号筛)，加入85％乙醇640ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍7天，倾出上层液，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，加乙醇至500ml，制得三批药液，分别精密量取三批药液20ml，置干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量(％)，取其三批浸出物含量的平均值结果见表4；

试验2：分别取鸦胆子药材175g和红花药材25g各3份(批号分别为：09060221，09060222，09060223)按《中国药典》规定制取鸦胆子和红花细粉(过五号筛)，分别加入90％乙醇400ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍4天，倾出上层液，再加入90％乙醇240ml，再浸3天，倾出上层液，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，加乙醇至500ml。同上述浸出物含量测定方法测定三批制剂浸出物含量，取其平均值结果见表4；

试验3：分别取鸦胆子药材175g和红花药材25g各3份(批号分别为：09060231，09060232，09060233)按《中国药典》规定制取鸦胆子和红花细粉(过五号筛)，分别加入95％乙醇300ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍3天，倾出上层液，加入85％乙醇170ml，浸渍2天，倾出上层液，再加入乙醇170ml浸渍2天，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，加乙醇至500ml。同上述浸出物含量测定方法测定三批制剂浸出物含量，取其平均值结果见表4；

试验4：分别取鸦胆子药材175g和红花药材25g各3份(批号分别为：09061111，09061112，09061113)按《中国药典》规定制取鸦胆子和红花细粉(过五号筛)，加入90％乙醇640ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍14天，倾出上层液，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，加乙醇至500ml。同上述浸出物含量测定方法测定三批制剂浸出物含量，取其平均值结果见表4；

试验5：分别取鸦胆子药材175g和红花药材25g各3份(批号分别为：09061121，09061122，09061123)按《中国药典》规定制取鸦胆子和红花细粉(过五号筛)，分别加入95％乙醇400ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍7天，倾出上层液，再加入95％乙醇240ml，再浸7天，倾出上层液，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，加乙醇至500ml，同上述浸出物含量测定方法测定三批制剂浸出物含量，取其平均值结果见表4；

试验6：分别取鸦胆子药材175g和红花药材25g各3份(批号分别为：09061131，09061132，09061133)按《中国药典》规定制取鸦胆子和红花细粉(过五号筛)，分别加入85％乙醇300ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍5天，倾出上层液，加入85％乙醇170ml，浸渍5天，倾出上层液，再加入乙醇170ml，浸渍4天，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，加乙醇至500ml，同上述浸出物含量测定方法测定三批制剂浸出物含量，取其平均值结果见表4；

试验7：分别取鸦胆子药材175g和红花药材25g各3份(批号分别为：09061211，09061212，09061213)按《中国药典》规定制取鸦胆子和红花细粉(过五号筛)，加入95％乙醇300ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍18天，倾出上层液，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，加乙醇至500ml。同上述浸出物含量测定方法测定三批制剂浸出物含量，取其平均值结果见表4；

试验8：分别取鸦胆子药材175g和红花药材25g各3份(批号分别为：09061221，09061222，09061223)按《中国药典》规定制取鸦胆子和红花细粉(过五号筛)，分别加入85％乙醇400ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍9天，倾出上层液，再加入85％乙醇240ml，再浸9天，倾出上层液，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，加乙醇至500ml，同上述浸出物含量测定方法测定三批制剂浸出物含量，取其平均值结果见表4；

试验9：分别取鸦胆子药材175g和红花药材25g各3份(批号分别为：09061231，09061232，09061233)按《中国药典》规定制取鸦胆子和红花细粉(过五号筛)，分别加入90％乙醇300ml，密闭，振摇，在常温暗处浸渍6天，倾出上层液，加入90％乙醇170ml，浸渍6天，倾出上层液，再加入乙醇170ml，浸渍6天，用双层纱布滤过，残渣用力压榨，使残液尽可能压出，合并上清液，静置24小时，用定性滤纸过滤，加乙醇至500ml，同上述浸出物含量测定方法测定三批制剂浸出物含量，取其平均值结果见表4。

正交试验结果与分析

通过极差分析，各因素对试验结果的影响顺序为A＞C＞B，最佳组合为A₂B₂C₃，即筛选出的最优的工艺条件为：浸渍时间为14天，浸渍次数为2次，乙醇浓度为95％。

药物组合物的质量标准

[性状]本品为黄色至黄绿色澄清液体。

[鉴别](1)取本品20ml，置蒸发皿中，水浴上蒸干，残渣加石油醚(60～90℃)20ml，分二次搅拌使溶解，静置，滤过(蒸发皿中残渣备用)，滤液蒸干，残渣加石油醚(60～90℃)5ml使溶解，作为供试品溶液。另取鸦胆子对照药材1g，加乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加石油醚(60～90℃)20ml，分二次搅拌使溶解，静置，滤过，滤液蒸干，残渣加石油醚(60～90℃)2ml使溶解，作为对照药材溶液。再取油酸对照品，加石油醚(60～90℃)制成每ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液及对照药材溶液各1～2μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(8.5∶1.8∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。置碘蒸气中熏至斑点显色清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)取本品15ml，置85℃水浴上蒸至近干，用石油醚(60～90℃)淌洗残渣两次，每次5ml，弃去石油醚液，残渣挥干石油醚，立即用25％甲醇适量溶解残渣并转移至10ml棕色量瓶中，用25％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。另取羟基红花黄色素A对照品，加甲醇制成每1ml含12μg的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-乙腈-0.2％磷酸溶液(21∶5∶74)为流动相；检测波长为403nm。分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图中，应呈现与对照品保留时间一致的色谱峰。

[检查]乙醇量不得低于88％

微生物限度取本品10ml，加入45℃含5％吐温80的pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10供试液。取1∶10供试液10ml加人100ml含1％吐温80的0.1％蛋白胨水中，混匀，采用薄膜过滤法(每膜用含1％吐温80的0.1％蛋白胨水300ml分次冲洗)进行细菌计数。采用常规法进行霉菌和酵母菌计数以及控制菌检查。按中国药典2005年版一部(附录XIII C)检验，应符合规定。

其他应符合搽剂项下有关的各项规定(中国药典2005年版一部附录IV)。

【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为367nm。理论板数按山柰素峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备精密称取山柰素对照品适量，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品15ml，置锥形瓶中，加入盐酸2ml，摇匀，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1ml含红花以山柰素(C₁₅H₁₀O₆)计，不得少于15.0μg。

临床预实验报告

采用本发明所提供的药物组合物(祛疣搽剂)外用治疗尖锐湿疣，取得较好疗效，现将其临床预试验结果报告如下：

试验目的：观察该药物组合物(祛疣搽剂)外用治疗尖锐湿疣的疗效、疗程和不良反应等。

研究对象：选取符合卫生部尖锐湿疣诊断标准(2000年8月)的20岁至60岁初发或复发性患者，既往均有不洁性接触史和(或)性伴感染史，皮损醋酸白试验均为阳性。患者皮损均为外生殖器部位可见的中等以下大小的疣体，单个疣体直径＜5mm，疣体团块直径＜10mm，疣体数目＜15个，符合中国CDC制定的《性传播疾病临床诊疗指南(2007年)》尖锐湿疣患者自己用药治疗指征。患者均自愿加入本研究，并同意到医院复诊或电话随访。排除患有其它性传播疾病，局部合并有红斑、糜烂、溃疡等其它影响疗效观察的皮损，患有高血压、糖尿病、恶性肿瘤等其它疾病，以及不愿意外用药治疗的患者。

研究方法：按照上述研究对象的纳入和排除标准，选取研究对象进行祛疣搽剂外用治疗尖锐湿疣的疗效、疗程和不良反应等的观察。制备祛疣搽剂外用治疗尖锐湿疣的临床疗效观察表，由观察医生逐一填写表格内容，嘱患者签字同意进入观察治疗。由同一医生现场演示和说明上药方法和注意事项，并完成该患者的复诊观察或电话随访。

临床资料：2009年7月至10月来自我院皮肤性病科门诊的32例尖锐湿疣患者，均符合上述纳入排除标准。2例外地患者失随访，其余30例患者年龄23～43岁，平均31.4岁；皮损呈乳头状3例，菜花状17例，桑椹状1例，丘疹状8例，针尖大小1例；皮损数目1～10个，平均4.6个；皮损位于男性龟头3例，包皮4例，冠状沟11例，系带1例，尿道口4例，女性阴道口5例，大阴唇2例；皮损均无瘙瘁、疼痛等自觉症状。

治疗方法：疗前先用棉签头轻轻搔刮皮损至微红，用棉签头或牙签浸入祛疣搽剂药液，蘸取少量药液，点在皮损上。待药液干后重复上药2～3次，每天上药3次。嘱患者待药液干后方可穿好衣裤，且不要将药液涂到正常皮肤，若有药液溢到正常皮肤粘膜，立即用棉签沾干多余药液或在上药前在皮损周围涂少量尿素乳膏以保护正常皮肤粘膜。根据患者皮损大小和数量不同，每日用药量约0.05～0.15ml。

疗效判定标准：在治疗的7天以内，治愈：疣体全部脱落；显效：疣体部分脱落；无效：疣体未脱落。

结果：经复诊和电话随访，30例患者治愈27例，显效3例，无效0例；疗程(开始用药至疣体脱落的时间)2～7天，平均4.3天。有5例患者出现不良反应，表现为涂药时有轻微刺痛感，稍时即逝，4例出现红斑，1例出现糜烂，停药后对症治疗能够恢复，未留疤痕等。

采用该药物组合物(祛疣搽剂)治疗扁平疣100多例，痊愈显效率100％，病员反映安全、效果好。

毒理实验：

一、毒理试验项目

1、家兔皮肤(完整皮肤、破损皮肤)外用祛疣搽剂单次给药毒性实验

2、豚鼠外用祛疣搽剂主动皮肤过敏实验

3、家兔用药祛疣搽剂刺激(皮肤刺激、阴道刺激)实验

二、预试验及拟定毒理试验方案

1、家兔皮肤(完整皮肤、破损皮肤)外用祛疣搽剂单次给药毒性实验

根据祛疣搽剂的临床用药浓度(40％)和最高浓度(360％)的预试实验，结果为40％和360％的祛疣搽剂对皮肤家兔均未出现由药物毒性引起死亡；360％祛疣搽剂溶液对家兔皮肤有一定的不良反应，如：皮肤收缩、脱水、脱色和脱毛等；而40％祛疣搽剂未见明显的毒性反应。提示该药对完整和破损皮肤家兔的毒性较小。因此，“家兔皮肤(完整皮肤、破损皮肤)外用祛疣搽剂单次给药毒性实验”的剂量组别分别设计为3个组，即2个剂量药物组(临床浓度40％和委托方提供最高浓度360％的祛疣搽剂)和1个赋形剂对照组(95％乙醇溶液)。

(1)“家兔皮肤外用(完整皮肤)祛疣搽剂单次给药毒性实验”的方法

适应性饲养结束后，选取健康合格家兔12只，体重为2.0～2.5kg，雌雄各半，按体重分为3组(n＝4)，即药物组和对照组。给药前24h，将动物背部脊柱两侧毛脱去，去毛范围约相当于体表面积的10％左右，约150cm²，皮肤无破损。然后按表3中相应的供试品溶液均匀涂敷于整个脱毛区，24h内涂抹2次(每次间隔不少于4h)。每次给药待药液干后，用二层纱布覆盖，再用家兔固定衣进行固定后，放入笼中，单笼饲养。

第1次给药24h后，去除覆盖物，用温水去除残留的供试品。逐只观察、记录动物由药物毒性引起的毒性症状反应，主要包括动物体重变化、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等。给药后连续观察4h，以后每天观察1～2次，共14天。第1～3天每天称量动物体重1次，以后分别于第7天、14天各称量动物体重1次，死亡动物及时解剖，肉眼观察，记录。肉眼观察出现有异常，取其各主要脏器做病理组织学检查。反之，则不作组织病理学检查。

试验结束后，处死动物进行解剖，观察，肉眼观察，记录。肉眼观察出现有异常，取其各主要脏器做病理组织学检查。反之，则不作组织病理学检查。

(2)“家兔皮肤外用(破损皮肤)祛疣搽剂单次给药毒性实验”方法

适应性饲养结束后，选取健康合格家兔12只，体重为2.0～2.5kg，雌雄各半，按体重均分为3组(n＝4)，给药前24h，将动物背部脊柱两侧毛脱去，去毛范围约相当于体表面积的10％左右，约150cm²，用16号针头在脱毛区作“#”字划破皮肤，以渗血为度，左右两侧皮肤的破损程度应基本一致。然后按表4中相应的供试品溶液均匀涂敷于整个脱毛区，24h内涂抹2次(每次间隔不少于4h)。每次给药待药液干后，用二层纱布覆盖，再用家兔固定衣进行固定后，放入笼中，单笼饲养。

第1次给药24h后，去除覆盖物，用温水去除残留的供试品。逐只观察、记录动物由药物毒性引起的毒性症状反应，主要包括动物体重变化、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等。给药后连续观察4h，以后每天观察1～2次，共14天。第1～3天每天称量动物体重1次，以后分别于第7天、14天各称量动物体重1次，死亡动物及时解剖，肉眼观察，记录。肉眼观察出现有异常，取其各主要脏器做病理组织学检查。反之，则不作组织病理学检查。

试验结束后，处死动物进行解剖，观察，肉眼观察，记录。肉眼观察出现有异常，取其各主要脏器做病理组织学检查。反之，则不作组织病理学检查。

2、豚鼠外用祛疣搽剂主动皮肤过敏实验

根据《中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光过敏反应)研究的技术指导原则》和本中心“主动皮肤过敏性试验”的要求：供试品一般设2个剂量组，即祛疣搽剂一组为40％祛疣搽剂溶液(临床浓度)，祛疣搽剂二组为祛疣搽剂一组的4倍，即160％祛疣搽剂溶液；阴性对照组(95％乙醇赋形剂对照组)和阳性对照组(2，4-二硝基氟苯)。

(备注：2，4-二硝基氟苯1％的致敏浓度和0.1％的激发浓度；其余组别致敏和激发采用相同浓度)。

动物适应性饲养结束后，选取健康合格豚鼠80只，雌雄兼用，按体重均分4组，阴性对照组(n＝20)、祛疣搽剂一组(n＝20)、二组(n＝20)和阳性对照组(n＝20)，在给药前1天背部两侧脱毛^【5.7】，脱毛区应不小于3×3cm²。分别在第0、第7和第14天时候局部给药进行致敏，在动物脱毛区均匀涂抹供试品0.2ml，待药液干后，用二层纱布(3cm×3cm)覆盖，再用无刺激性胶布加以固定。保留6小时后用温水清洗给药局部。

激发：末次给供试品致敏后13天，动物右侧背部皮肤脱毛。第14天将供试品0.2ml涂于脱毛区，保留6小时后用温水清洗给药局部，观察72小时内皮肤过敏反应情况，并按皮肤过敏反应评分标准进行评分。

3、家兔用药祛疣搽剂刺激(皮肤刺激、阴道刺激)实验

(1)皮肤刺激实验(包括完整和破损皮肤)

剂量设计理由：根据《中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则》要求和该药的临床实际运用，结合祛疣搽剂的急性毒性实验可知：家兔完整皮肤和破损皮肤24h内2次接受一定量祛疣搽剂，高浓度的祛疣搽剂(浓度为360％，给药体积为8ml/次，2次)对皮肤有一定的不良反应，例如：皮肤萎缩、脱色、脱毛等，而低浓度(临床浓度为40％，给药体积为8ml/次，2次)对家兔皮肤未见不良反应。因此，该药的皮肤刺激实验剂量为：2个药物组(40％和160％的祛疣搽剂溶液)和一个赋形剂对照组，同时采用同体左右侧自身对比法，每次临床制剂相同浓度0.5ml均匀涂抹于皮肤，每天1次。

a.完整皮肤刺激实验方法：适应性饲养结束后，选用健康合格家兔12只，体重2.0～2.5kg，雌雄各半。试验前24小时对给药区(通常在背部)进行脱毛处理。去毛范围左、右各3cm×3cm。给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不宜进行实验。称重。

取祛疣搽剂溶液(40％和160％)0.5ml直接均匀涂布于一侧已去毛的皮肤上，待药液干后，用二层纱布(2.5cm×2.5cm)覆盖，再用无刺激性家兔固定衣加以固定；另一侧涂布等量(95％乙醇)赋形剂做阴性对照。贴敷4小时后，除去供试品并用温水清洁给药部位，连续14天在同一部位给药(每次给药时间相同)。

在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。按观察指标给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。在每次去除药物后1小时以及再次贴敷前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后30～60分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过14天。对出现中度及中度以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行组织病理学检查，并提供病理照片。

b.破损皮肤刺激实验方法：适应性饲养结束后，选用健康合格家兔12只，体重2.0～2.5kg，雌雄各半。试验前24小时对给药区(通常在背部)进行脱毛处理。去毛范围左、右各3cm×3cm。并在脱毛区给药部位划“井”字并以渗血为度，两侧“井”字大小应该一致。

取祛疣搽剂溶液(40％和160％)0.5ml直接均匀涂布于一侧已去毛的皮肤上，待药液干后，用二层纱布(2.5cm×2.5cm)覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布等量(95％乙醇)赋形剂做阴性对照。贴敷4小时后，除去供试品并用温水清洁给药部位，连续14天在同一部位给药(每次给药时间相同)。

在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。按表7给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。在每次去除药物后1小时以及再次贴敷前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后30～60分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过14天。对出现中度及中度以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行组织病理学检查，并提供病理照片。

首先计算每一观察时间点各组原发性刺激积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物刺激积分均值即累积刺激指数，按评分标准进行刺激强度评价。

(2)阴道刺激性实验

剂量设计理由：根据《中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则》要求和该药的临床实际运用，结合祛疣搽剂的急性毒性实验可知：家兔完整皮肤和破损皮肤24h内2次接受一定量祛疣搽剂，高浓度的祛疣搽剂(浓度为360％，给药体积为8ml/次，2次)对皮肤有一定的是不良反应，例如：皮肤萎缩、脱色、毛细、脱毛等，而低浓度(浓度为40％，给药体积为8ml/次，2次)对家兔皮肤未见不良反应。因此，该药的阴道刺激实验剂量为：2个药物组(40％和160％的祛疣搽剂溶液)和一个赋形剂对照组。每只家兔1ml，每天1次。

实验方法：适应性饲养结束后，选用健康合格雌性家兔(没有生产和没有怀孕，外生殖器无损伤的雌性动物)18只，体重2.5～3.0kg，按体重分为3组。即祛疣搽剂一组、二组和赋形剂对照组。

实验前，将动物取俯卧位固定。用18号橡胶导尿管，在距导管尖端7.5cm做出标记，用液体石蜡润滑后，插入阴道至标记处投药。完成后，缓慢撤出导管，不要试图关闭或封闭阴道口。然后将吸有药物(加温，使温度接近体温)的注射器插入阴道给予。每只家兔1ml。每天1次，连续给药14天，每次给药与粘膜接触不少4小时。

每天观察给药后临床表现(如体重、疼痛症状等)、阴道有无充血、水肿、分泌物(如血、粘液/粪便)等现象(按阴道刺激性打分标准)，给药后动物的死亡和尸检情况。在最后一次阴道刺激性观察后，家兔用致死剂量的戊巴比妥钠实施安乐死，对阴道(上、中、低三段分别打分，计算平均值)肉眼观察，按阴道刺激性打分标准打分计算平均值，并按阴道切片显微镜分级标准做病理组织学检查等，并提供病理照片。

抗炎实验：

1实验材料

1.1供试品和对照品

1.1.1供试品

祛疣搽剂：本品为黄棕色半透明溶液，标示量：100ml含原药材40g，由四川省医学科学院·四川省人民医院药剂科提供，批号：090716，溶剂为乙醇，批号为090715。

贮存条件：密闭干燥保存。

临床拟用量为：1滴/日。

临床拟用给药途径：外用。

剩余配置供试品的处理：倒入本实验室废液桶。

1.1.2对照品

氯化钠注射液(0.9％)：四川科伦药业股份有限公司，批号：K081202B。

祛疣搽剂纯溶剂：为无色透明溶液，由四川省医学科学院·四川省人民医院药剂科提供(批号：090716。

醋酸氟轻松软膏：为白色乳膏，规格：10g：2.5mg，用法用量：涂于患处，2次/日，天津太平洋制药有限公司生产，批号：090408。

1.2实验系统及选择理由

根据小鼠耳肿胀造模要求选用KM小鼠，饲养于开放系统。

根据大鼠足趾肿胀造模要求选用SD大鼠，饲养于开放系统。

1.3实验动物

1.3.1品系：KM小鼠。                    等级：一级。

性别：全雄。                           购入数量：60只。

购入时体重范围：19-23g。

来源：四川大学实验动物中心。           许可证号：SCXK(川)-10-2006

1.3.2品系：SD大鼠                      等级：一级。

性别：全雄。                           入数量：60只。

购入时体重范围：240-280g。

来源：四川大学实验动物中心。           许可证号：SCXK(川)-10-2006

1.4动物饲养与管理

1.4.1动物房

四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室普通动物房。

实验动物使用许可证号：实验动物使用许可证号：SYXK(川)2008-016，四川省实验动物管理委员会颁发。

温度21℃-26℃，相对湿度40％-70％，10/14小时明暗交替照明。

1.4.2饲料名称

全价颗粒饲料：由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。

1.4.3饮水

名称：自来水(符合国家安全饮用标准)。

来源：该实验室。

1.5仪器，设备及器材

电子天平，打孔器，木平板，测容积玻璃容器，移液枪，注射器等。

1.6实验用的溶媒及其它试剂

无菌蒸馏水。

二甲苯溶液：天津市富宇精细化工有限公司，批号：090703。

角叉菜胶(进口分装)：现配成1％混悬液。

1.7供试品和对照品的剂量设计依据，剂量水平，给药途径，频率和期限

1.7.1小鼠耳肿胀实验：根据供试品的临床拟用量为1滴/日，供试品设三个剂量组分别为祛疣搽剂高剂量组(100ml含原药材40g)、祛疣搽剂中剂量组(100ml含原药材20g)、祛疣搽剂低剂量组(100ml含原药材10g)，同时设生理盐水组，溶剂组，醋酸氟轻松软膏组，各组均为外用，每天一次，每次50ul，连续3天。

1.7.2大鼠足趾肿胀实验：根据供试品的临床拟用量为1滴/日，供试品设三个剂量组分别为祛疣搽剂高剂量组(100ml含原药材40g)、祛疣搽剂中剂量组(100ml含原药材20g)、祛疣搽剂低剂量组(100ml含原药材10g)，同时设生理盐水组，溶剂组，醋酸氟轻松软膏组，各组均为外用，每天一次，每次100ul，连续3天。

2.实验方法

2.1小鼠耳廓二甲苯致炎实验

2.1.1实验动物分组

将60只小鼠按体重随机分为6组，每组10只，分别为：生理盐水组、溶剂组、醋酸氟轻松软膏组、祛疣搽剂高、中、低剂量组。

2.1.2给药

生理盐水组：每只小鼠用生理盐水按50ul/只涂布于右耳耳廓内外；溶剂组：每只小鼠用祛疣搽剂纯溶剂按50ul/只涂布于右耳耳廓内外；醋酸氟轻松软膏组：将软膏均匀涂布于右耳耳廓内外面；祛疣搽剂高、中、低剂量组：分别用祛疣搽剂高、中、低溶液按50ul/只涂布于右耳耳廓内外；以上各组均每日一次，连续3日。

2.1.3耳廓肿胀的测定

末次给药30min后，对所有小鼠右耳耳廓正反两面均匀涂布二甲苯致炎，40ul/只，1h后处死动物，沿耳廓基线剪下两耳，于同一部位用打孔器冲下耳片(直径7mm)，称重，按下式计算右耳肿胀率：肿胀率(％)＝[(右耳片质量-左耳片质量)/左耳片质量]×100％。

2.2大鼠足趾肿胀实验

2.2.1实验动物分组

将60只大鼠按体重随机分为6组，每组10只，分别为：生理盐水组、溶剂组、醋酸氟轻松软膏组、祛疣搽剂高、中、低剂量组。

2.2.2给药

生理盐水组：每只大鼠用生理盐水按100ul/只涂布于右后足趾背部；溶剂组：每只大鼠用祛疣搽剂纯溶剂按100ul/只涂布于右后足趾背部；醋酸氟轻松软膏组：将软膏均匀涂布于大鼠右后足趾背部；祛疣搽剂高、中、低剂量组：分别用祛疣搽剂高、中、低溶液100ul/只涂布于大鼠右后足趾背部；以上各组均每日一次，连续3日。

2.2.3足趾肿胀的测定

末次给药前用记号笔在大鼠右后踝关节做一标记，将大鼠右后肢侵入三通管容器，使标记与液平面重叠，多余的液体流入侧管，该液体的容积即为大鼠给药前的正常足趾容积。末次给药1h后，全部大鼠右后肢足趾皮下注射1％新鲜角叉菜胶混悬液0.1ml/只致炎，随后在5min、30min、1h、2h、4h、6h按上述方法测定大鼠足趾容积，记录结果，并分别计算肿胀率：肿胀率(％)＝[(致炎后足趾容积-致炎前足趾容积)/致炎前足趾容积]×100％。

2.3.统计分析

实验数据采用SPSS17.0进行统计分析，数据用表示。

3.实验结果

表1.祛疣搽剂对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

注：*表示与生理盐水组比较P＜0.05。

表2.祛疣搽剂对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的影响

注：*表示与生理盐水组比较P＜0.05。

4.结论

在本实验条件下，高剂量祛疣搽剂能够抑制小鼠耳廓肿胀及角叉菜胶所致的大鼠足趾肿胀，具有抗炎作用。

人乳头瘤病毒(HPV)杀灭作用的实验：

1.实验目的考察祛疣搽剂在体外对HPV的杀灭作用

2实验材料

2.1标本：临床尖锐湿疣标本，来自于四川大学华西医院泌尿外科。

2.2、药物：祛疣搽剂，为棕黄色半透明溶液，标示量：100ml含原药材40g，由四川省医学科学院·四川省人民医院药剂科提供(本发明)，批号：090716；溶剂为乙醇，批号为090715。

2.3试剂：人乳头瘤病毒(6，11型)核酸定量检测试剂盒(包括DNA提取液，HPV PCR反应液，Taq酶，临界阳性质控品，阴性质控品，阳性定量参考品，强阳性质控品)，购于中山大学达安基因股份有限公司，批号：国药准字S2006097；其余试剂均为分析纯。

2.4仪器：荧光定量PCR仪(ABI7500)，台式微量低温离心机(BECKMANCOULTER Microfuge 22R)。

3实验方法

3.1提取DNA

3.1.1阴性质控品处理

取出阴性质控品，8,000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1min；12,000rpm离心5min，备用。

3.2.2标本处理

用适量灭菌生理盐水清洗送检组织沾带的血液；取约50mg组织分别加入不同剂量的祛疣搽剂和生理盐水(见表1)，置4℃冰箱24小时后匀浆，12,000rpm离心5min；去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1min；12,000rpm离心5min，备用。

  分组  组织(mg)  祛疣搽剂(ml)  生理盐水(ml)  1(低剂量)  50  0.2  0.8  2(中剂量)  50  0.4  0.6  3(高剂量)  50  0.8  0.2  4(阴性对照)  50  0  1.0

3.2.3临界阳性质控品处理(同阴性质控品)。

3.3.4强阳性质控品处理(同阴性质控品)。

3.4.5阳性定量参考品处理：8,000rpm离心数秒，备用。

3.2PCR扩增

3.2.1试剂准备：按比例(HPV6，11PCR反应液40μl/人份+Taq酶3μl/人份)取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中，备用。

3.2.2加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品(包括标本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品)上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8,000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

3.3.3PCR扩增条件

93℃2min

93℃45s    55℃60s    10个循环

93℃30s    55℃45s    30个循环

4实验结果(统计学处理：One-Way ANOVA)

表1祛疣搽剂对HPV-DNA作用后HPV的基因拷贝数

  药物剂量  第一次试验  第二次实验  第三次实验  1(低剂量)  2.48×10⁸  2.49×10⁸  2.45×10⁸  2(中剂量)  2.42×10⁸  2.46×10⁸  2.44×10⁸  3(高剂量)  2.33×10⁸  2.31×10⁸  2.27×10⁸  4(阴性对照)  2.48×10⁸  2.46×10⁸  2.49×10⁸

图2祛疣搽剂对HPV-DNA作用结果(与阴性组比较，^*p＜0.01)

结果表明，在祛疣搽剂高剂量时对HPV-DNA的基因拷贝数有降低，与阴性对照组比较有显著性差异。

5实验结论：高剂量祛疣搽剂作用于人乳头瘤病毒的后其HPV的基因拷贝数有明显的降低，说明高剂量祛疣搽剂有抑制人乳头瘤病毒的作用。