对虾黄头病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及对虾黄头病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法。试剂盒包括：采样管、内装蒸馏水的漂洗管、内装TE缓冲液的核酸变性管、内装扩增反应液和核酸染料的扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、FTA膜片及其快速干燥液等。本发明的检测方法具有比RT-PCR检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，且成本低，使用方便，检测更准确、快速、灵敏度极高，且对人和环境都非常安全，可以替代已有的相关检测方法如电镜观察法和RT-PCR检测法等。本发明不仅可在室内的实验室使用，也可在野外的生产现场使用，对加强对虾黄头病毒的流行病学监测以及对虾养殖水体监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体是对虾黄头病毒(Taura syndrome virus，简称YHV)的现场快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

对虾黄头病毒是基因组为正义链的单链RNA病毒，属于杆状套病毒科(Roniviridae)，淋巴病毒属(Okavirus)，该病毒主要感染斑节对虾(Penaeus monodon)、日本对虾(Marsupenaeus japonicus)、墨吉对虾(Fenneropenaeus merguiensis)、白滨对虾(Litopenaeus setiferus)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)及南极磷虾(Euphasia superba)等，其中以斑节对虾最为敏感，斑节对虾感染病毒后死亡率几乎为100％，该病毒曾引起澳大利亚、印度、越南、泰国等国家对虾养殖业的巨大损失。近年来随着我国斑节对虾养殖规模的扩大以及与南亚各国对虾贸易的增长，对虾YHV爆发性流行的风险也逐渐增加。为了避免我国对虾养殖业上个世纪90年代白斑综合症病毒病爆发悲剧的重现，应尽快建立对虾黄头病毒灵敏、准确、快速的现场检测技术，加强养殖水体的监测及对虾苗种、成虾检疫，以预防病毒感染，切断病毒传播，防止YHV的大规模爆发流行。

目前，YHV检测还主要依赖于组织病理学观察法、电子显微镜观察法和RT-PCR检测法。组织病理学观察法不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测，并且还局限于在实验室内进行；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低；YHV的RT-PCR检测法，虽然克服了前面几种方法的缺点，在实验室条件下能实现对YHV的相对快速、准确检测，但由于常规的RT-PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，使得RT-PCR检测法难以用于现场的快速检测，这大大限制了RT-PCR检测方法在生产中的推广应用。

进行养殖水体监测和对虾黄头病毒早期检测是对虾养殖中降低对虾黄头病毒流行风险、减少对虾发病导致巨额经济损失的有效手段，所以建立简单、快速、高灵敏的检查方法，并开发适于现场应用的对虾黄头病毒检测试剂盒就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是要提供一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的对虾黄头病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，以克服现有技术的不足。

首先，本发明利用针对YHV结构糖蛋白基因中保守区段设计的4条特异引物、一种反转录酶和一种等温扩增的DNA聚合酶，无需单独对目的核酸(RNA)进行反转录，在恒定温度下保温一段时间即可同步完成对目的核酸的反转录和扩增，实现对YHV的快速和高灵敏检测。为了进一步缩短检测时间、消除检测过程中可能发生的污染、简化检测步骤，使检测实验能够在生产现场开展，本发明对YHV的实验室检测方法进行了优化。在用FTA卡制备样品核酸的标准步骤中，需要将被样品匀浆液润湿的FTA膜片在室温下干燥至少一个小时，然后才能进行漂洗；本发明通过在被样品匀浆液润湿的FTA膜片上滴加亲水性且易挥发的醇类物质(主要是叔醇、伯醇和仲醇)，使润湿的FTA膜片在室温条件下仅需几分钟即可完成干燥过程，大大缩短了样品核酸制备的时间。在利用等温扩增方法检测病原时，目前普遍采用扩增反应结束后向反应管中添加核酸染料以判断检测结果的方法；由于等温扩增反应的产物量非常大，这种打开反应管再添加核酸染料的方法极易导致后续待检样品被污染而使检测结果出现假阳性；有报道和专利采用在扩增反应试剂中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除污染风险，但却增加了成本；本发明先将核酸染料粘附到扩增反应管的内侧上方或盖子内侧，等扩增反应结束后再通过上下反复震荡使扩增反应液和核酸染料混合，这样不打开扩增反应管就能完成扩增产物的染色，消除了打开扩增反应管再添加核酸染料过程中反应液可能溅出造成后续待检样品被污染的风险。在用FTA卡制备样品核酸的标准步骤中，需要用Whatman公司(英国)专门的纯化试剂反复漂洗FTA膜片；本发明无需专门的纯化试剂，采用普通的蒸馏水漂洗即可完成FTA膜片的纯化，不仅简化了检测的操作步骤，还降低了实验成本。为了使该检测方法在生产现场具有更强的实用性，本发明在上述优化整个检测方法的基础上，将检测YHV病毒所需的试剂及器材进行了组装，将之标准化、配套化，形成了检测试剂盒。

本发明的对虾黄头病毒现场快速高灵敏检测试剂盒包括：

(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，内装蒸馏水；

(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；

(4)扩增检测管，内装扩增反应液和核酸染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1～2μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.1～0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.0mM，MgCl₂ 4～10mM，Betaine(甜菜碱)0.6～1.2M，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO₄ 1～4mM，(NH₄)₂SO₄ 6～12mM，Triton X-100 0.05％～1.0％，反转录酶1～20U，Bst DNA聚合酶2～20U；核酸染料为分子生物学研究中常用的核酸染料，包括但不限于SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldView^TM、GeneFinder^TM等；且核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内侧；

(5)阴性对照管，内装无对虾黄头病毒核酸的FTA膜片；

(6)阳性对照管，内装吸附了对虾黄头病毒核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；

(8)FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管分别封装于无菌袋中；

上述YHV现场快速高灵敏检测试剂盒中所述的扩增引物是根据YHV结构糖蛋白基因保守区序列设计的，其核苷酸序列如下：

上游引物1：5′-AGTAGCAAATTGTAGCAAGAAGCCTTTTCCTTCCTCTTATCTACTTTACTCTC

下游引物1：5′-CCTCACATTCTCTGGACGCATTTTTATTGTACGGATTGTGTTGTT

上游引物2：5′-TGCGGGGCTTATTTCTGA

下游引物2：5′-AGCGAACTTAGATGACAAGA

用本发明上述检测试剂盒检测对虾YHV的方法，按下列步骤进行：

(1)取样品对虾组织约0.02～1.0g置于采样管中，用研磨棒将样品对虾组织磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品对虾组织将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置1～20min；

(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3～5min以洗涤FTA膜片；

(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于55～65℃条件下保温40～70min；

(6)将扩增检测管上下反复甩动1-3min，使扩增反应液与粘附于扩增检测管管壁或管盖上的核酸染料充分混匀；

(7)用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部，用眼睛观察反应液，如果反应液呈现绿色则表示该样品的YHV检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的YHV检测结果为阴性。

在上述步骤中，从第(4)步开始应将作为阴性对照的无对虾黄头病毒核酸的FTA膜片、作为阳性对照的吸附了对虾黄头病毒核酸的FTA膜片，以及吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应。

本发明的积极效果在于：在试剂盒中汇集YHV现场快速检测所需的FTA膜片、TE缓冲液、扩增反应液、核酸染料等试剂和研磨棒、牙签、吸管等器材，使得YHV的检测能够快速有序地进行，实现了检测过程的程序化和标准化，使得操作规范、不易出错；本发明依据优选的YHV结构糖蛋白基因保守区序列所设计的扩增引物能有效检测YHV的所有毒株，而与其他病毒的结构糖蛋白基因又无同源性，检测特异性非常好；采用醇类物质对取样后的FTA膜片进行快速干燥处理，使得样品核酸的制备时间大大缩短；采用内置核酸染料，在反应结束后无需打开反应管即可直接对反应液进行染色，避免了打开反应管再添加核酸染料使后续待检样品被扩增产物污染而造成假阳性的结果，从而大大提高了该方法在检测中应用的可靠性。本发明将目的核酸(RNA)的反转录和扩增结合起来同步进行，节省了时间，仅需1.5～2小时就可完成对虾YHV的检测；并且检测过程无需昂贵的仪器设备如离心机、PCR仪和凝胶成像系统，仅需水浴锅或金属浴甚至更简单的保温装置即可；而且检测结果非常容易判别；与对虾YHV已有检测技术相比，本发明的检测方法成本非常低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高，可以替代对虾黄头病毒之前的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和RT-PCR检测法；本发明的检测试剂盒不仅可在实验室内使用，也可在野外的生产现场使用，对加强YHV的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 对虾黄头病毒现场快速高灵敏检测试剂盒

本发明的试剂盒由以下部件组成(可检测4个样品的包装)：

(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，6个，每个管内装有1ml的蒸馏水；

(3)核酸变性管，6个，每个管内装有20μL的TE缓冲液(含10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.0)；

(4)扩增检测管，6个，每个管内装有25μL扩增反应液和1μL的核酸染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl₂ 8mM，Betaine(甜菜碱)1.2M，Tris-HCl 20mM，KCl10mM，MgSO₄ 2mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，TritonX-100 0.1％，反转录酶5U，BstDNA聚合酶8U；核酸染料成分为稀释10倍的GeneFinder^TM，且核酸染料已粘附固定于扩增检测管的管盖内侧。

(5)阴性对照管，1个，内装无对虾黄头病毒核酸的FTA膜片；

(6)阳性对照管，1个，内装吸附了对虾黄头病毒核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液，1管，内装500μL无水乙醇；

(8)FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装于无菌袋中；

(9)包装盒(1个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块上有小孔4×6个；

(10)使用说明书，1份。

实施例2 本发明的对虾黄头病毒等温扩增检测方法

使用实施例1中的检测试剂盒，按下列步骤进行：

(1)取样品对虾组织约0.1g置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置10min；

(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min；

(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于57℃条件下保温60min；

(6)将扩增检测管上下反复甩动2min，使扩增反应液与管盖上的核酸染料充分混匀；

(7)然后用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液聚于扩增检测管底部，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的YHV检测结果为阳性，如果呈现橙黄色则表示该样品的YHV检测结果为阴性。

在上述步骤中从第4步开始，应将无对虾黄头病毒核酸的FTA膜片、吸附了对虾黄头病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。

实施例3 使用本发明试剂盒检测养殖水体中病毒存在情况

使用实施例3中的检测试剂盒，按下列步骤进行：

(1)用80目筛绢过滤海水，将过滤物用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置10min；

(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min；

(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于57℃条件下保温60min；

(6)将扩增检测管上下反复甩动2min，使扩增反应液与管盖上的核酸染料充分混匀；

(7)然后用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液聚于扩增检测管底部，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的YHV检测结果为阳性，如果呈现橙黄色则表示该样品的YHV检测结果为阴性。

在上述步骤中从第4步开始，应将无对虾黄头病毒核酸的FTA膜片、吸附了对虾黄头病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。

实施例4 利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备对虾病毒核酸

为了验证本发明中快速核酸制备方法制备核酸的效果，分别利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法分别从感染YHV的对虾中制备对虾病毒核酸。

首先利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备对虾病毒核酸：

(1)取约10-20毫克的对虾附肢放入1.5mL离心管中，加入100μL份PBS缓冲液，用研磨棒将对虾附肢研磨成浆状；

(2)用吸液管将研磨的组织匀浆液加到FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加25μL；

(3)将加好样品的FTA卡室温放置干燥至少一个小时；

(4)用一个钻取工具从所上述干燥后的FTA卡上取下直径约2.0mm的圆片，放进1.5mL离心管中；

(5)在上述离心管中加入200μLFTA纯化试剂(Whatman产品编号：WG120204)，静置5分钟；

(6)用吸液管将离心管内的FTA纯化试剂全部吸出；

(7)重复步骤(5)——(6)两次；

(8)在上述离心管中加入200μLTE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH 8.0)，静置5分钟；

(9)用吸液管将离心管内的TE缓冲液全部吸出；

(10)重复步骤(8)——(9)两次；

(11)将上述离心管内的圆片在室温下干燥大约一个小时，圆片即可用于核酸的扩增了。

利用本发明中快速核酸制备方法按下面的步骤制备对虾病毒核酸：

(1)取约10-20毫克的对虾附肢放入1.5mL离心管中，用研磨棒将对虾附肢研磨成浆状；

(2)用吸液管将研磨的组织匀浆液加到3个FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加5μL；

(3)将3个FTA卡上分别滴加100μL甲醇、无水乙醇和异丙醇，室温放置3～5分钟；

(4)用一个钻取工具从所上述3个FTA卡上分别取下直径约2.0mm的圆片放进1.5mL离心管中；

(5)在上述离心管中加入800μL灭菌水，剧烈震荡3分钟；

(6)取出离心管内的圆片即可用于核酸的扩增了。

从上述过程中可以看出，采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法大约需要2个多小时才能完成核酸制备，而采样本发明的快速核酸制备方法大约只需要6～10分钟就可以完成核酸制备；所以与Whatman-FTA卡标准核酸制备方法相比，本发明的快速核酸制备方法具有操作简单、快速的优点。

实施例5 Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备对虾病毒核酸的效果对比

用实施例4中Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备的对虾病毒核酸分别作为模板，进行等温扩增反应，每个扩增反应中含25μL扩增反应液，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.5μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.3μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.5mM，MgCl₂ 7mM，Betaine(甜菜碱)1.3M，Tris-HCl20mM，KCl 10mM，MgSO₄ 2mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，TritonX-100 0.1％，反转录酶2U，BstDNA聚合酶8U；等温扩增反应条件为：58℃保温60分钟，然后90℃保持5分钟；最后将每个反应管中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果发现，利用本发明快速核酸制备方法(制备核酸过程中分别采用了甲醇、无水乙醇和异丙醇等挥发性醇类作为快速干燥液)制备的核酸均可以有效用作等温扩增反应的模板，并且扩增效果好于采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备的核酸的扩增效果。

本发明中所述的FTA膜片是英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片；将FTA卡片裁切成尺度为长×宽不小于1毫米×1毫米的纸片或打孔成直径不小于1毫米的纸片即可制成FTA膜片。

本发明所使用的试剂和材料：引物由上海生物工程有限责任公司合成；乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜喊(Betaine)、dATP、dGTP、dCTP和dTTP、KCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂、Triton X-100购自上海生物工程有限责任公司；无水乙醇、甲醇、异丙醇等购自国药集团化学试剂北京有限公司；等温扩增用的Bst DNA聚合酶、反转录酶等购自NEB公司；核酸染料GeneFinder^TM购自厦门百维信生物科技有限公司。

引物序列表

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>对虾黄头病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法

<160>4

<210>1

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据对虾黄头病毒结构糖蛋白基因序列和等温扩增引物设计

要求而设计，用作对虾黄头病毒等温扩增检测的上游引物1

<400>1

agtagcaaat tgtagcaaga agccttttcc ttcctcttat ctactttact ctc 53

<210>2

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据对虾黄头病毒结构糖蛋白基因序列和等温扩增引物设计

要求而设计，用作对虾黄头病毒等温扩增检测的下游引物1

<400>2

cctcacattc tctggacgca tttttattgt acggattgtg ttgtt 45

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据对虾黄头病毒结构糖蛋白基因序列和等温扩增引物设计

要求而设计，用作对虾黄头病毒等温扩增检测的上游引物2

<400>3

tgcggggctt atttctga 18

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据对虾黄头病毒结构糖蛋白基因序列和等温扩增引物设计

要求而设计，用作对虾黄头病毒等温扩增检测的下游引物2

<400>4

agcgaactta gatgacaaga 20