从中药中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法以及筛选得到的SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂

摘要

本发明提供了一种从中药中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法以及由此方法筛选出的抑制剂。筛选方法包括如下：A.测定来自单味中药的多种提取物的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性；B.选择具有最好的体外抑制活性的一种提取物；和C.对步骤B所选择的提取物进行至少一轮的分离和选择。本发明筛选出的化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶具有体外抑制活性，是极佳的可能上市的药物或潜在的药物前体。

说明书

技术领域

本发明涉及从中药中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法以及筛选得到的SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂。更具体而言，本发明涉及以SARS冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性测定为基础，从中药中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶的不饱和脂肪酸抑制剂的方法，以及由此导出的一系列不饱和脂肪酸类抑制剂。

背景技术

SARS(Severe Acute Respiratory Sydrome)为引起严重急性呼吸道综合症(非典型性肺炎)的简称，其病原体为冠状病毒属的一种病毒(Peiris J.Lancet，2003，361，1319-1325)。冠状病毒是正链RNA病毒。冠状病毒属隶属于冠状病毒科。在目前已知的正链RNA病毒中，它们的基因组是最大的(Siddell，S.G.Coronaviruses，toroviruses，and arteriviruses.in Topley & Wilson′s Microbiology andMicrobia Infections，10th edition，Vol.Virology(eds.Mahy，B.W.J.& ter Meulen，V.)823-856(Hodder Arnold，London，2005))。这个属含有约26个种；按照它们的自然宿主、基因序列以及血清型关系，这个属又可以被分为三个组群(group)：其中第一组群有TGEV，Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus(猪传染性胃肠炎病毒)等；第二组群有SARS冠状病毒，MHV(鼠肝炎病毒)等；第三组群有AIBV，Avian Infectious Bronchitis Virus(禽传染性支气管炎病毒)等(Spaan，W J M.Cavanagh，D.Coronaviridae.in Virus taxonomy，VIIIth Report of the ICTV.945-62(Elsevier-Academic Press.，London，2004))。

SARS冠状病毒2/3到3/4的基因组编码了两个复制酶多蛋白(replicasepolyproteins)ppla和pplab，它们只有在病毒编码的蛋白酶切割成独立亚基之后才能使病毒完成正常转录、复制功能。SARS冠状病毒主要蛋白酶(main protease，简称主蛋白酶)在这个过程中起主要作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒的主蛋白酶是抗SARS药物筛选的一个主要靶标。

2003年爆发的SARS病毒感染在全世界造成8096例病例，774例死亡。虽然到今天为止未再发生感染，但不排除SARS及其变种卷土重来的可能性。2003年SARS病毒感染时已有用中药预防或救治的先例。我国传统中药是大量天然产物的重要来源，天然产物具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman D J，Gragg G M，Snader K M.Nat Prod Rep.，2000，17，215-234；Lee K H.J Nat Prod.，2004，67，273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。中药在我国已有数千年应用的历史，是一个伟大的宝库，因此从中药等天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。

目前还没有以SARS冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性测定为基础，从泻下类中药例如巴豆中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的应用报道。本发明应用SARS冠状病毒主蛋白酶的体外酶活筛选方法，提供了一种从中药例如巴豆中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂如6顺，9顺-十八二烯酸(isolinoleicacid)及其衍生物的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法，包括如下：A.测定来自单味中药的多种提取物的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性；B.选择具有最好的体外抑制活性的一种提取物；和C.对步骤B所选择的提取物进行至少一轮的分离和选择，对每轮分离所得到的各种组分测定SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性，选择具有最好的体外抑制活性的一种组分进入下一轮的分离和选择，直至所述分离和选择得到的具有最好的体外抑制活性的组分是一种化合物，将该化合物作为SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂。

在一个优选的实施方案中，所述步骤A中的测定来自单味中药的多种提取物的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性的方法包括如下步骤：(1).向缓冲溶液中加入SARS冠状病毒主蛋白酶；(2).添加底物和待测物质到缓冲溶液中；和(3).测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性。

在另一个优选的实施方案中，所述步骤C中的分离采用选自如下的一种或多种方法：超临界萃取、有机溶剂萃取、色谱分离、电泳分离和膜分离。

在另一个优选的实施方案中，所述提取物是有机溶剂提取物。

在一个进一步优选的实施方案中，所述有机溶剂选自芳香烃类溶剂、脂肪烃类溶剂、脂环烃类溶剂、卤化烃类溶剂、醇类溶剂、醚类溶剂、酯类溶剂、酮类溶剂、二醇衍生物类溶剂和其他有机溶剂。

在一个更进一步优选的实施方案中，所述有机溶剂进一步选自醇类溶剂和酯类溶剂。

在另一个优选的实施方案中，所述单味中药为巴豆(fructus of Croton tigliumL.)。

在另一个优选的实施方案中，所述来自单味中药的多种提取物为巴豆95％乙醇(乙醇浓度以v/v计)总提取物、巴豆乙酸乙酯提取物和巴豆水相大孔树脂95％乙醇提取物。

在一个进一步优选的实施方案中，所述巴豆95％乙醇总提取物、巴豆乙酸乙酯提取物和巴豆水相大孔树脂95％乙醇提取物的制备方法包括如下：(a).取一定量的巴豆，用95％乙醇溶液回流提取多次，合并提取液，浓缩得浸膏，即为巴豆95％乙醇总提取物；(b).称取一定量的步骤(a)中所得的浸膏，用双蒸水悬浮，用乙酸乙酯萃取多次，分离乙酸乙酯相和水相；合并水相，备用；合并每次乙酸乙酯萃取物，蒸除其中的乙酸乙酯，得到干膏状乙酸乙酯相样品，即为巴豆乙酸乙酯提取物；和(c).蒸除步骤(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量乙酸乙酯，用大孔树脂柱层析分离，依次用水和95％乙醇溶液为流动相分别洗脱多次；弃去水洗部分，合并95％乙醇溶液洗脱部分，蒸除其中的溶剂，得干膏状样品，即为巴豆水相大孔树脂95％乙醇提取物。

在一个进一步优选的实施方案中，所述底物为荧光标记底物。

在一个更进一步优选的实施方案中，所述荧光标记底物为MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH₂。

本发明的另一个目的是提供根据上述任何一个实施方案所描述的方法筛选获得的SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂在制备用于治疗和/或预防SARS冠状病毒感染的药物中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂为6顺，9顺-十八二烯酸(isolinoleic acid)。

在一个优选的实施方案中，所述SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂为由6顺，9顺-十八二烯酸(isolinoleic acid)导出的6顺-十八烯酸(petroselinic acid)、9顺-十八烯酸(oleic acid)、9顺-十八烯酸钠盐(sodium oleate)、9反-十八烯酸(elaidic acid)、11顺-十八烯酸(cis-vaccenic acid)、13顺-二十二烯酸(erucicacid)、9顺，12顺-十八二烯酸(linoleic acid)、9顺，12顺，15顺-十八三烯酸(linolenic acid)和6顺，9顺，12顺-十八三烯酸(γ-linolenic acid)。

本发明的又一个目的是提供具有如下结构通式的不饱和脂肪酸类化合物在制备用于治疗和/或预防SARS冠状病毒感染的药物中的应用：

其中，各个R同时或独立地选自：H、-OH、-ONa、-OK、-OSO₃H、-OPO₃H₂、-OAc、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂CH₃、-OCH₂CH₂CH₂CH₃、-Oglu和-Ogal。

在一个优选的实施方案中，所述不饱和脂肪酸类化合物为6顺，9顺-十八二烯酸、6顺-十八烯酸、9顺-十八烯酸、9顺-十八烯酸钠盐、9反-十八烯酸、11顺-十八烯酸、13顺-二十二烯酸、9顺，12顺-十八二烯酸、9顺，12顺，15顺-十八三烯酸和6顺，9顺，12顺-十八三烯酸。

本发明的再一个目的是提供一种用于治疗和/或预防SARS冠状病毒感染的药物组合物，包含治疗有效量的上述方法筛选获得的SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂以及药学上可接受的载体。

在本发明的上下文中，所述SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性的测定方法具体包括如下：(1).向缓冲溶液如含50mM Tris-HCl，pH 7.3、1mM EDTA的缓冲溶液中加入SARS冠状病毒主蛋白酶；(2).添加底物和待测物质到缓冲溶液中；和(3).测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性；其中所述缓冲溶液可含有或不含有DTT；底物包括但不限于显色、发荧光或化学发光的底物，优选发荧光的底物，例如荧光标记的底物MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH₂；可通过包括但不限于比色、荧光读数或化学发光读数的方法测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性；加入缓冲溶液中的SARS冠状病毒主蛋白酶、待测物质和底物的浓度可根据具体情况由本领域技术人员进行确定，例如SARS冠状病毒主蛋白酶的浓度可为0.5μM，当待测物质为混合物时，可为10-100μg/mL，当待测物质为单一化合物时，可为200μM，底物浓度可为16μM；在通过荧光读数测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性时，激发波长和发射波长可分别为320nm和405nm，温度可保持在298K，可每2秒钟记录一次荧光读数。

在本发明的上下文中，所述分离采用选自如下的一种或多种方法：超临界萃取、有机溶剂萃取、色谱(层析)分离、电泳分离和膜分离，其中超临界萃取包括但不限于二氧化碳超临界萃取；有机溶剂萃取包括但不限于醇类溶剂萃取和酯类溶剂萃取，例如正丁醇萃取和乙酸乙酯萃取；色谱(层析)分离包括但不限于吸附色谱(层析)分离、凝胶过滤色谱(层析)分离、离子交换色谱(层析)分离、疏水色谱(层析)分离和HPLC分离；电泳分离包括但不限于滤纸电泳、薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳和毛细管电泳；膜分离可采用无机膜和有机膜，无机膜包括但不限于陶瓷膜和金属膜，有机膜包括但不限于醋酸纤维素膜、芳香族聚酰胺膜、聚醚砜膜、聚氟聚合物膜。

在本发明的上下文中，所述有机溶剂包括但不限于：①芳香烃类溶剂：如苯、甲苯、二甲笨等；②脂肪烃类溶剂：如戊烷、己烷、辛烷等；③脂环烃类溶剂：如环己烷、环己酮、甲苯环己酮等；④卤化烃类溶剂：如氯苯、二氯苯、二氯甲烷等；⑤醇类溶剂：如甲醇、乙醇、异丙醇等；⑥醚类溶剂：如乙醚、环氧丙烷等；⑦酯类溶剂：醋酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯等；⑧酮类溶剂：丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮等；⑨二醇衍生物类溶剂：如乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙二醇单丁醚等；⑩其他有机溶剂：如乙腈、吡啶、苯酚等；优选醇类和/或酯类溶剂；更优选乙醇和/或乙酸乙酯。

在本发明的上下文中，所述巴豆95％乙醇总提取物、巴豆乙酸乙酯提取物和巴豆水相大孔树脂95％乙醇提取物的制备方法具体如下：(a).取一定量(如500克)的巴豆，用95％乙醇溶液(如4500毫升)回流提取3次，合并提取液，浓缩得浸膏，即为巴豆95％乙醇总提取物；(b).称取一定量(如10克)的步骤(a)中所得的浸膏，用双蒸水(如150毫升)悬浮，用乙酸乙酯(如650毫升)萃取3次，分离乙酸乙酯相和水相；合并水相，备用；合并每次乙酸乙酯萃取物，蒸除其中的乙酸乙酯，得到干膏状乙酸乙酯相样品，即为巴豆乙酸乙酯提取物；和(c).蒸除步骤(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量乙酸乙酯，用大孔树脂柱层析分离，依次用水和95％乙醇溶液为流动相洗脱，水(如250毫升)洗脱例如8次，95％乙醇(如300毫升)洗脱例如5次；弃去水洗部分，合并95％乙醇溶液洗脱部分，蒸除其中的溶剂，得干膏状样品，即为巴豆水相大孔树脂95％乙醇提取物。

本发明选取SARS冠状病毒中晶体结构已知的主蛋白酶，对我国传统中药巴豆进行活性成分筛选，是从一种新的角度去研究中药学、天然产物化学和生物学，是运用各种交叉学科对中医药现代化的宝贵尝试。由于巴豆中所含的成分是相当复杂的，必须运用各种色谱方法对其粗提物进行分离纯化，目的是去除对SARS冠状病毒主蛋白酶体外活性测定中的干扰因素如蛋白、无机盐等，保留成药性较好的小分子并使之尽量集中，提高相对浓度。本发明不仅提供了可以实现这一目的制备技术方案，而且对筛选有抑制活性的样品，用各种色谱、波谱方法分离、鉴定了其中小分子抑制剂6顺，9顺-十八二烯酸。通过购买与6顺，9顺-十八二烯酸结构相似、双键数量和位置不同的脂肪酸类化合物，并用酶活筛选对它们的抑制活性加以验证，我们又得到了几种强有力的抑制剂。最后我们对这些抑制剂的结构特点进行分析，得到了具有特定结构骨架的结构式，符合这些结构式的化合物很可能具有对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性。

目前，基于SARS冠状病毒主蛋白酶晶体结构为基础进行的药物筛选，所发现的小分子抑制剂绝大多数为SARS冠状病毒主蛋白酶底物类似物及其衍生物(Dariusz P，Marcin H，Marcin G.Chem.Biol.Drug.Res.，2007，69，269-279；HaitaoY，Wenqing X，Xiaoyu X.PLOS Biology，2005，3，1742-1752)，这类多肽类抑制剂不仅造价昂贵，而且口服利用度低，在血液中的半衰期短，对制服SARS感染发病带来了难度。本发明筛选出的抑制剂-6顺，9顺-十八二烯酸，以及由此导出的不饱和脂肪酸衍生物，分子结构中不含肽键，其对SARS冠状病毒主蛋白酶在25μM时仍具有体外抑制活性，考虑到它们大多为常用中药中的天然产物，其毒性及代谢吸收特性较多肽类等其它合成化合物具有不可比拟的优越性，是极佳的可能上市的药物或潜在的药物前体。这为进一步的药物设计和筛选提供了宝贵的依据和参考。

附图说明

图1：本发明的巴豆的各种提取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性曲线图；其中，1为对照曲线，2、3、4分别为巴豆水相大孔树脂95％乙醇提取物、巴豆95％乙醇总提取物、巴豆乙酸乙酯提取物的抑制曲线，样品浓度均为：100μg/mL。

图2：本发明的巴豆乙酸乙酯提取物进一步分离组分a1-a5的抑制曲线图；其中，1为对照，2、3、4、5、6分别为a2、a1、a3、a5、a4的抑制曲线，样品浓度均为：10μg/mL。

图3：本发明的巴豆乙酸乙酯提取物a4部分进一步分离组分b1和b2的抑制曲线图；其中，1为对照，2、3分别为b2、b1的抑制曲线，样品浓度均为：10μg/mL。

图4：化合物1的HMBC图谱导出的氢和碳原子之间的相关关系。

图5：化合物1(6顺，9顺-十八二烯酸)的抑制曲线图；其中1为对照，2为化合物1，浓度为：10μg/mL。

图6：各种不饱和脂肪酸抑制剂的抑制曲线图。其中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分别为对照曲线、9顺-十八烯酸钠盐、6顺，9顺，12顺-十八三烯酸、9顺，12顺，15顺-十八三烯酸、6顺，9顺-十八二烯酸、9顺，12顺-十八二烯酸、9顺-十八烯酸、9反-十八烯酸、11顺-十八烯酸、6顺-十八烯酸、13顺-二十二烯酸。抑制剂浓度均为50μM。

具体实施方式

本发明将根据下列实施例进行更具体的说明。然而，本发明的保护范围并不受限于下列的实施例。

实施例1.SARS冠状病毒主蛋白酶的表达、纯化

根据文献(Yang H.Proc Natl Acad Sci.，2003，100，13190-13195)进行SARS冠状病毒主蛋白酶的表达、纯化，该SARS冠状病毒主蛋白酶的氨基酸序列如下：

Ser Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser Gly Lys Val Glu Gly Cys

1               5                   10                  15

Met Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu

            20                  25                  30

Asp Asp Thr Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile Cys Thr Ala Glu Asp

        35                  40                  45

Met Leu Asn Pro Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His

    50                  55                  60

Ser Phe Leu Val Gln Ala Gly Asn Val Gln Leu Arg Val Ile Gly His

65                  70                  75                  80

Ser Met Gln Asn Cys Leu Leu Arg Leu Lys Val Asp Thr Ser Asn Pro

                85                  90                  95

Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val Arg Ile Gln Pro Gly Gln Thr Phe

            100                 105                 110

Ser Val Leu Ala Cys Tyr Asn Gly Ser Pro Ser Gly Val Tyr Gln Cys

        115                 120                 125

Ala Met Arg Pro Asn His Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Asn Gly Ser

    130                 135                 140

Cys Gly Ser Val Gly Phe Asn Ile Asp Tyr Asp Cys Val Ser Phe Cys

145                 150                 155                 160

Tyr Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val His Ala Gly Thr Asp

                165                 170                 175

Leu Glu Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Phe Val Asp Arg Gln Thr Ala Gln

            180                 185                 190

Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Leu Asn Val Leu Ala Trp Leu

        195                 200                 205

Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe Leu Asn Arg Phe Thr

    210                 215                 220

Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu

225                 230                 235                 240

Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gln

                245                 250                 255

Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys Ala Ala Leu Lys Glu Leu Leu

            260                 265                 270

Gln Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr Ile Leu Gly Ser Thr Ile Leu Glu

        275                 280                 285

Asp Glu Phe Thr Pro Phe Asp Val Val Arg Gln Cys Ser Gly Val Thr

    290                 295                 300

Phe Gln

305

1.1SARS冠状病毒主蛋白酶的表达载体构建

具体步骤包括：

1.1.1利用北京华大基因中心提供的编号为BJ01的SARS病毒毒株的cDNA文库，用PCR技术进行体外扩增，

正向引物：5′-CGGGATCCAGTGGTTTTAGGAAAATG-3′

反向引物：5′-CCGCTCGAGTCATTGGAAGGTAACACCAGA-3′

1.1.2经PCR扩增的基因片段经BamHI和XhoI双酶酶切后，用琼脂糖凝胶电泳回收大小为1kb左右的片段；

1.1.3将回收片段与T载体进行连接，然后用连接产物转化大肠肝菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，并涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上，培养过夜；

1.1.4从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有约5mL的LB的试管(该LB溶液中加入氨苄青霉素，使其终浓度为100mg/L)中，培养过夜，然后用质粒提取试剂盒(博大泰克公司B型质粒小量快速提取试剂盒)提取质粒，并用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收大小约为1kb左右的目标基因片段；

1.1.5将目标载体pGEX-4T-1(购自Pharmacia公司)用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收酶切的片段；

1.1.6将(1.1.4)和(1.1.5)获得的片段连接(将酶切回收后的目标基因片段和目标载体片段按照摩尔数3∶1-6∶1的比率混合，按照Takara DNA Ligation的要求在16℃反应30分钟-18小时)，转化大肠肝菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上培养过夜。将筛选到的阳性克隆，用于鉴定和测序。

测序结果表明，SARS冠状病毒的主蛋白酶的编码基因已被正确地克隆到pGEX-4T-1载体中。

1.2SARS冠状病毒主蛋白酶的表达与纯化

包括步骤：

1.2.1将上述步骤1.1中得到的含有编码SARS冠状病毒主蛋白酶基因的pGEX-4T-1载体转化大肠杆菌BL21(DE3)的菌株，并用LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)筛选阳性克隆；

1.2.2在(1.2.1)中所述的LB平板上挑取阳性克隆(在含有氨苄青霉素的LB平板上生长出来的单克隆)，培养过夜，然后转入1L的LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素)，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入1mM左右的IPTG，在16℃培养12小时左右；

1.2.35000-8000rpm离心10-15分钟收集细胞，然后冰浴超声破菌20-30分钟；破菌液13000rpm-15000rpm离心20-40分钟后收集上清液；

1.2.4将上清液加入PBS预平衡的GST亲和层析柱(GE公司)中，用PBS淋洗20-30个柱床体积去除杂蛋白，最后加入2ml 0.1mg/ml左右的人类鼻病毒3C蛋白酶，在4℃酶切12-20小时，之后收集SARS冠状病毒主蛋白酶；

1.2.5将(1.2.4)获得的SARS冠状病毒主蛋白酶再用Mono Q(GE公司)阴离子交换层析进行纯化。

实施例2.制备巴豆提取物

取500克干燥粉碎的巴豆药材，用4500毫升95％乙醇回流提取，提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩得浸膏(即巴豆95％乙醇总提取物)；

称取此浸膏10克，用150毫升双蒸水悬浮，倾入1000毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取，每次萃取用乙酸乙酯650毫升，充分振摇，静置6小时分层，共萃取3次，分离乙酸乙酯相和水相，合并水相，备用，合并每次乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物用EYELAN1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得浓膏状巴豆乙酸乙酯萃取样品(即巴豆乙酸乙酯提取物)，备用；

萃取后的水相部分用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯，用HP-20型大孔树脂柱层析分离(使用170毫升的大孔树脂，玻璃柱规格30×300mm)，依次用水、95％乙醇为流动相洗脱，其中水洗脱8次，每次洗脱250毫升，弃去水洗部分，95％乙醇洗脱5次，每次洗脱300毫升，合并95％乙醇洗脱部分，将95％乙醇洗脱部分使用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状巴豆水相大孔树脂95％乙醇洗脱样品(即巴豆水相大孔树脂95％乙醇提取物)，备用。

实施例3.从巴豆提取物中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂

对上述乙酸乙酯萃取样品、水相大孔树脂95％乙醇洗脱样品和巴豆95％乙醇总提取物进行SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性实验，抑制曲线见图1。测定方法具体包括如下：(1).向含50mM Tris-HCl，pH 7.3、1mM EDTA的缓冲溶液中加入SARS冠状病毒主蛋白酶，终浓度为0.5μM，然后在不同的含有此蛋白的缓冲溶液中分别加入巴豆乙酸乙酯萃取样品、水相大孔树脂95％乙醇洗脱样品和95％乙醇总提取物，它们的浓度均为100μg/mL；(2).添加底物MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH₂到缓冲溶液中，终浓度为16μM；和(3).测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性，其中对照曲线为只加蛋白和底物、不加巴豆各个分段样品的测定曲线，曲线越低说明抑制作用越强。

由图1的抑制曲线可知巴豆的乙酸乙酯萃取样品部分抑制活性最好。将乙酸乙酯萃取部分用Sephadex LH-20凝胶柱层析(制造商：北京慧德益科技有限责任公司)分离，以氯仿-甲醇(1∶1)为流动相洗脱，共接收合并了5个部分，为a1-a5。对这5个部分进行SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性实验，体外抑制活性曲线见图2。测定方法具体包括如下：(1).向含50mM Tris-HCl，pH 7.3、1mM EDTA的缓冲溶液中加入SARS冠状病毒主蛋白酶，终浓度为0.5μM，然后在不同的含有此蛋白的缓冲溶液中分别加入a1-a5样品，它们的浓度均为10μg/mL；(2).添加底物MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH₂到缓冲溶液中，终浓度为16μM；和(3).测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性，其中对照曲线为只加蛋白和底物、不加a1-a5样品的测定曲线，曲线越低说明抑制作用越强。

由图2可知a4部分的抑制活性最好。将a4部分用硅胶薄层色谱制备，用石油醚∶丙酮＝5∶1为展开剂，将a4分为两个部分，b1和b2。对这两个部分进行SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性实验，体外抑制活性曲线见图3。测定方法具体包括如下：(1).向含50mM Tris-HCl，pH 7.3、1mM EDTA的缓冲溶液中加入SARS冠状病毒主蛋白酶，终浓度为0.5μM，然后在不同的含有此蛋白的缓冲溶液中分别加入b1、b2样品，它们的浓度均为10μg/mL；(2).添加底物MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH₂到缓冲溶液中，终浓度为16μM；和(3).测定待测物质的SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性，其中对照曲线为只加蛋白和底物、不加b1和b2样品的测定曲线，曲线越低说明抑制作用越强。

由图3可知b1部分活性较强，将b1部分用HPLC纯化(HPLC分析和制备条件均为：从0分钟到15分钟，流动相为甲醇∶水＝85∶15；从15到45分钟，流动相配比从甲醇∶水＝85∶15梯度升到甲醇∶水＝100∶0，检测波长均为210nm，其中分析时流速为1ml/min，制备时流速为3ml/min。分析柱规格为YMC-Pack ODS-A，AA12S11-1546WT，A-302-10，150×4.6mm I.D.，S-10μm。制备柱规格为YMC-Pack ODS-A，AA12S11-1510WT，A-322-10，150×10mm I.D.，S-10μm)，最终得到化合物1(6.5mg)。

对化合物1分别作了NMR和GC-MS测定，数据如下：

化合物1：无色油状物。GC-MS m/z 352[M+Si(CH₃)₃]⁺.¹H NMR(氯仿-d，600MHz)δ5.30-5.41(4H，m，H-6，7，9，10)，2.77(2H，t，J＝6.8Hz，H-8)，2.35(2H，t，J＝6.9Hz，H-2)，2.05(4H，q，J＝6.9Hz，H-5，11)，1.62(2H，quintet，J＝6.9Hz，H-3)，1.24-1.40(14H，m，H-4，12，13，14，15，16，17)，0.89(3H，t，J＝6.8Hz，H-18).¹³CNMR(氯仿-d，150MHz)δ180.5(C-1)，34.2(C-2)，24.8(C-3)，27.3(C-5)，130.3(C-6)，128.1(C-7)，25.7(C-8)，128.0(C-9)，130.1(C-10)，27.2(C-11)，22.6，29.1-29.7，31.6(C-4，C-12，C-13，C-14，C-15，C-16，C-17)，14.1(C-18)。为了确定双键的位置，又进行了¹H-¹H COSY、HMQC和HMBC实验。在HMBC实验中，2位氢与4位碳的相关、5位氢与4位碳的相关以及2位氢与3位碳的相关充分证明两个双键的位置在6位和9位(见图4)。其NMR数据与6顺，9顺-十八二烯酸数据(Gunstone，F D，Pollard，M R，Scrimgeour，C M，Vedanayagam，H S.Chemistry and Physics of Lipids，1977，18，115-129.)完全一致，因此确认化合物1为6顺，9顺-十八二烯酸(isolinoleic acid)。

我们对上述得到的化合物1(6顺，9顺-十八二烯酸)进行了SARS冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性测定，测定按照如下步骤进行：在缓冲溶液(50mMTris-HCl(pH 7.3)，1mM EDTA中加入SARS主蛋白酶(终浓度0.5μM)，6顺，9顺-十八二烯酸(终浓度为：10μg/mL)，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH₂，终浓度16μM)。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持在298K，每2秒钟记录一次荧光读数(结果示于图5)(对照曲线为只加蛋白和底物、不加6顺，9顺-十八二烯酸的测定曲线，曲线越低说明抑制作用越强)。由图5可知6顺，9顺-十八二烯酸具有很好的抑制活性，是巴豆中对SARS冠状病毒主蛋白酶起抑制作用的主成分。

实施例4.具有SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性的其他不饱和脂肪酸以及几类抑制剂结构通式的导出

通过分析我们分离得到的抑制剂6顺，9顺-十八二烯酸的结构，我们购买了其他的不饱和脂肪酸：6顺-十八烯酸(上海Sigma-aldrich公司)、9顺-十八烯酸(天津Alfa-aesar公司)、9顺-十八烯酸钠盐(上海Sigma-aldrich公司)、9反-十八烯酸(天津Alfa-aesar公司)、11顺-十八烯酸(上海Sigma-aldrich公司)、13顺-二十二烯酸(上海Sigma-aldrich公司)、9顺，12顺-十八二烯酸(北京百灵威科技有限公司)、9顺，12顺，15顺-十八三烯酸(北京百灵威科技有限公司)和6顺，9顺，12顺-十八三烯酸(北京百灵威科技有限公司)来进行抑制活性筛选。它们的结构如下：

对上述九个化合物进行SARS冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性测定，结果见图6。测定按照如下步骤进行：在缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mMEDTA(含或不含DTT))中加入SARS主蛋白酶(终浓度0.5μM)，在不同含有此蛋白的缓冲溶液中分别加入9顺-十八烯酸钠盐、6顺，9顺，12顺-十八三烯酸、9顺，12顺，15顺-十八三烯酸、6顺，9顺-十八二烯酸、9顺，12顺-十八二烯酸、9顺-十八烯酸、9反-十八烯酸、11顺-十八烯酸、6顺-十八烯酸、13顺-二十二烯酸(终浓度均为50μM)，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH₂，终浓度16μM)。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持在298K，每2秒钟记录一次荧光读数。对照曲线为只加蛋白和底物、不加任何抑制剂时的测定曲线，曲线越低说明抑制作用越强。

由图6结果可知，上述九个不饱和脂肪酸化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶均具有不同程度的抑制作用，有的甚至抑制活性比6顺，9顺-十八二烯酸更强。比较一下它们的化学结构可以发现，它们结构中存在着数目、位置、顺反构型不同的双键。

符合如下结构通式的化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶具有抑制作用：

其中，各个R同时或独立地选自：H、-OH、-ONa、-OK、-OSO₃H、-OPO₃H₂、-OAc、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂CH₃、-OCH₂CH₂CH₂CH₃、-Oglu和-Ogal。因为R代表的化学基团只影响整个化合物的溶解性质，主要的抑制活性仍由脂肪酸的链状结构决定，所以符合这个结构通式的化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶具有抑制作用。

由于具有各种R取代基的化合物在体内代谢时可能会转化为游离羟基的化合物，而且本申请筛选的化合物具有结构的多样性和代表性，因此具有这个通式的化合物应该落入本发明的保护范围之内。

本文中所涉及的各种实验用品(包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等)之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本申请日之前，可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方便地获得。

应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入本发明的保护范围中。

序列表

<110>中国科学院生物物理研究所、清华大学、南开大学

<120>从中药中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法以及筛选得到的SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂

<160>2

<210>1

<211>306

<212>prt

<213>SARS冠状病毒(SARS Coronavirus)

<400>1

Ser Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser Gly Lys Val Glu Gly Cys

1               5                   10                  15

Met Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu

            20                  25                  30

Asp Asp Thr Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile Cys Thr Ala Glu Asp

        35                  40                  45

Met Leu Asn Pro Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His

    50                  55                  60

Ser Phe Leu Val Gln Ala Gly Asn Val Gln Leu Arg Val Ile Gly His

65                  70                  75                  80

Ser Met Gln Asn Cys Leu Leu Arg Leu Lys Val Asp Thr Ser Asn Pro

                85                  90                  95

Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val Arg Ile Gln Pro Gly Gln Thr Phe

            100                 105                 110

Ser Val Leu Ala Cys Tyr Asn Gly Ser Pro Ser Gly Val Tyr Gln Cys

        115                 120                 125

Ala Met Arg Pro Asn His Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Asn Gly Ser

    130                 135                 140

Cys Gly Ser Val Gly Phe Asn Ile Asp Tyr Asp Cys Val Ser Phe Cys

145                 150                 155                 160

Tyr Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val His Ala Gly Thr Asp

                165                 170                 175

Leu Glu Gly Lys Phc Tyr Gly Pro Phe Val Asp Arg Gln Thr Ala Gln

            180                 185                 190

Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Leu Asn Val Leu Ala Trp Leu

        195                 200                 205

Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe Leu Asn Arg Phe Thr

    210                 215                 220

Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu

225                 230                 235                 240

Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gln

                245                 250                 255

Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys Ala Ala Leu Lys Glu Leu Leu

            260                 265                 270

Gln Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr Ile Leu Gly Ser Thr Ile Leu Glu

        275                 280                 285

Asp Glu Phe Thr Pro Phe Asp Val Val Arg Gln Cys Ser Gly Val Thr

    290                 295                 300

Phe Gln

305