指导玉米胚珠和授粉籽粒的母体和支持组织中转基因表达的植物调节区

摘要

本发明提供了用于调节植物中异源核苷酸序列的表达的组合物与方法。组合物包括作为玉米肌动蛋白解聚因子4启动子的新核苷酸序列。也提供了使用本文所公开的启动子序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。

说明书

发明领域

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体来说涉及植物中基因表达的调节。

发明背景

植物宿主中异源DNA序列的表达依赖于可操作性连接的调节元件的存在，这些元件在植物宿主内是具有功能的。启动子序列的选择将决定生物内异源DNA序列何时与何处进行表达。当需要在特定组织或器官中表达时，可以使用组织优选启动子(tissue-preferred promoter)。当需要应答刺激物进行基因表达时，可诱导性启动子可选作调节元件。相反，当需要持续表达遍及植物细胞时，可使用组成型启动子。中心启动子序列上游和/或下游的附加调节序列可以包括于转化载体的表达构建体中，使转基因植物中异源核苷酸序列的表达水平发生变化。

经常需要在植物的特定组织或器官中表达DNA序列。例如，增加植物对土壤和空气传播的病原体感染的抵抗力，可以通过植物基因组的遗传操作来完成，使该基因组包含可操作性连接于异源病原体抵抗性基因的组织优选启动子，从而使病原体抵抗性蛋白可以在期望的植物组织中生产。可选地，需要抑制植物组织内天然DNA序列的表达，来实现所需要的表型。在此情况下，此抑制可以通过植物转化来完成，使该植物包含可操作性连接于反义核苷酸序列的组织优选启动子，从而使该反义序列表达产生RNA转录物，该RNA转录物可以干扰天然DNA序列的mRNA的翻译。

另外，需要在处于特定生长或发育阶段的植物组织中表达DNA序列，该阶段为例如细胞分裂或延长。此类DNA序列可以用于促进或抑制植物生长进程，从而影响生长速度或植物结构。

需要分离与表征再生组织优选(reproductive-tissue-preferred)启动子，特别是的未成熟的穗优选(immature-ear-preferred)启动子，用于影响植物中的各种特性以及可评价标记的使用中，该启动子可以作为以再生组织优选方式表达分离的目的核苷酸序列的调节元件。

发明概述

本发明提供了用于调节植物中基因表达的组合物与方法。该组合物包含用于再生组织优选启动子的新的核苷酸序列。具体来说，提供了肌动蛋白解聚因子4基因的转录起始区。本发明的其他实施方案包含SEQID NO：1中给出的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中给出的核苷酸序列的片段。也包括SEQ ID NO：1中给出的序列的功能性片段，其促进可操作性连接的核苷酸序列的再生组织优选表达。

本发明的实施方案也包括DNA构建体，该构建体包含可操作性连接于目的异源核苷酸序列的启动子，其中所述启动子能够促进所述核苷酸序列在植物细胞中的表达并且所述启动子包含本文所公开的核苷酸序列中的一个。本发明的实施方案还提供了表达载体与植物或植物细胞，该植物或植物细胞具有稳固地并入其基因组的上文提及的DNA构建体。另外，该组合物包括这些植物的转基因种子。

其他的实施方案包含在植物中选择性表达核苷酸序列的方法，其包括用DNA构建体转化植物细胞，和由所述植物细胞再生转化的植物，所述DNA构建体包含启动子与异源核苷酸序列，该序列可操作性连接于所述启动子，其中所述启动子启动植物细胞中的所述核苷酸序列的未成熟的穗优选转录。以此方式，启动子序列可用于以优选组织或可诱导方式控制可操作性连接的编码序列的表达。

启动子的转录起始调节的下游可以是目的序列，该序列可提供植物表型的修饰。此类修饰包括调节内源产物的产生，如其数量、相对分布等，或者外源表达产物的产生，以便在植物中提供新的功能或产物。例如，包含编码基因产物的异源核苷酸序列，该基因产物赋予对除草剂、盐、寒冷、干旱、病原体、线虫类或昆虫的抗性或耐性。

在另一个具体方案中，提供了调节稳固转化的植物中基因表达的方法，包括步骤：(a)用DNA构建体转化植物细胞，该DNA构建体包含具体方案的启动子，该启动子可操作性连接于至少一个核苷酸序列；(b)在植物生长的条件下使植物细胞生长；以及(c)由植物细胞再生稳固转化的植物，其中核苷酸序列的表达改变了植物的表型。

附图说明

图1显示了LYNX^TM大量平行信号测序数据的概要，该数据展示了玉米(zea mays)中ADF4的表达。

图2显示了当可操作性连接于ADF4启动子并在T0转基因植物中表达时GUS可评价标记的转基因表达的照片。

图3显示了当可操作性连接于ADF4启动子并在T0转基因植物中表达时DS-RED可评价标记的转基因表达的照片。

图4A-4H显示了当可操作性连接于ADF4启动子并在T1转基因植物中表达时DS-RED与GUS可评价标记的转基因表达的照片。为了进行比较，将来自对照植物的组织显示于4A中每个面板的右侧；4B中最后两个面板的右侧；如4C中所标记；在4D中较低的穗与上部的花粉囊中；在4E中较低的穗或右侧的穗横截面中；以及如4F中所示。

图5为ADF4启动子(SEQ ID NO：4)的300个碱基对区，通过与如表1-3与实施例4所述的来自高粱与水稻的直系同源基因(orthologousgenes)的比较，显示了基序的定位。

所提供的彩色照片，GUS表达显示为蓝色，而DS-RED为红色。所提供的黑白照片，表达GUS的组织则比对照或未表达组织更黑。

发明详述

本发明涉及用于植物启动子的组合物与方法以及它们的应用方法。该组合物包含肌动蛋白解聚因子(ADF)基因的再生组织优选、优选未成熟的穗优选启动子区的苷酸序列，更特别地，ADF4启动子。该组合物还包含DNA构建体，该构建体包含核肌动蛋白解聚因子4(ADF4)基因启动子区的核苷酸序列，所述启动子区可操作性连接于目的异源核苷酸序列。特别是，本发明提供了分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1中给出的核苷酸序列，和其片段、变体以及补体。

本发明的ADF4启动子序列包括允许植物中起始转录的核苷酸构建体。在具体实施方案中，ADF4启动子序列允许以组织优选更特别是穗优选方式起始转录。本发明的此类构建体包含与植物发育调节相关的调节转录起始区。因而，本发明的组合物包括DNA构建体，该构建体包含可操作性连接于植物启动子的目的核苷酸序列，尤其是ADF4基因的再生组织优选启动子序列，更特别是玉米ADF4启动子序列。包含玉米启动子区的序列于SEQ ID NO：1中给出。

SEQ ID NO：1的特征包括以下：位点7-1026所示的ZmADF4上游调节区。ZmADF4的未翻译前导区显示于位点1027-1147。ZmADF4的第一个内含子显示于位点1151-1319。第一个ATG是紧接于5’剪接位点之前。内含子可以增强表达；参见例如，Mun，et al.，(2002)Gene292(1-2)：233-243。ZmADF4编码序列的一部分显示于位点1338-1385。此特性可以促进产生与启动子的翻译融合物。

本发明的组合物包括天然ADF4启动子的核苷酸序列及其片段和变体。本发明的启动子序列可用于表达序列。在具体实施方案中，本发明的启动子序列可用于以再生组织优选，特别是穗优选方式，表达目的序列。本发明的核苷酸序列也可用于构建表达载体的，用于在目的植物中随后表达异源核苷酸序列，或者作为探针用于分离其他类似ADF4的启动子。特别是，本发明提供了分离的DNA构建体，该构建体包含在SEQID NO：1中给出的ADF4启动子核苷酸序列，该序列可操作性连接于目的核苷酸序列。

本发明包含分离的或充分纯化的核酸组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物活性部分当通过重组技术生产时不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。“分离的”核酸是不含这样的序列(包括蛋白质编码序列)，该序列天然地位于生物基因组DNA中核酸(即，位于核酸的5’与3’端的序列)的侧翼，该核酸来源于该生物。例如，在各种实施方案中，分离的核酸分子可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，该核苷酸序列天然地位于细胞基因组DNA中核酸分子的侧翼，该核酸来源于该细胞。本发明的ADF4启动子序列可以分离自5’未翻译区的，该未翻译区位于它们各自转录起始位点的侧翼。

已公开的启动子核苷酸序列的片段与变体也包含于本发明中。特别是，SEQ ID NO：1的ADF4启动子序列的片段与变体可以用于本发明的DNA构建体中。如本文所用，术语“片段”是指核酸序列的一部分。ADF4启动子序列的片段可以保留起始转录的生物活性，更特别是，以再生组织优选方式促进转录。可选地，可用作杂交探针的核苷酸序列的片段可以不需要保留生物活性。ADF4基因启动子区的核苷酸序列的片段的变化范围可以是基因启动子区的至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，至多本发明的全长核苷酸序列。

ADF4启动子的生物活性部分可以通过分离一部分本发明的ADF4启动子序列的与评定该部分的启动子活性而制备。作为ADF4启动子核苷酸序列片段的核酸分子包含至少约16、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300个核苷酸，或至多存在于本文所公开的全长ADF4启动子序列中的核苷酸的总数。

本文所用的术语“变体”是指与本文所公开的启动子序列具有实质相似性的序列。变体包含天然多核苷酸内一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或增加，和/或在天然多核苷酸中一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。本文所用的“天然的”核苷酸序列包含天然存在的核苷酸序列。对于核苷酸序列而言，天然存在的变体可以通过使用熟知的分子生物学技术来鉴定，例如，使用本文略述的聚合酶链反应(PCR)与杂交技术。

变体核苷酸序列也包括合成获得的核苷酸序列，诸如通过例如使用定点诱变所产生的序列。通常，当通过本文别处所述的序列比对程序使用默认参数进行测定时，实施方案的具体核苷酸序列的变体可以该具体核苷酸序列具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％，至95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。生物活性变体也包括于实施方案中。生物活性变体包括，例如，具有一个或多个核苷酸取代、缺失或插入的实施方案的天然启动子序列。启动子活性可以通过使用以下技术测量，例如RNA印迹分析法(Northern blot analysis)，由转录融合获得的报道子活性测量等。参见例如，Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)，在下文中称为″Sambrook″，在此通过引用将其全文并入。可选地，可以测量报道子基因的水平，如在启动子片段或变体的控制下产生的绿色荧光蛋白(GFP)或类似物。参见例如，美国专利6,072,050，在此通过引用将其全文并入。

变体核苷酸序列也包括源自诱变与重组方法例如DNA改组的序列。通过这类方法，可以操作启动子的一个或多个不同的ADF4核苷酸序列来产生新的ADF4启动子。以此方式，可以由包含序列区的相关序列多核苷酸的群体来产生重组多核苷酸库，该序列区具有序列实质同一性并可以在体外或体内被同源重组。用于此类DNA改组的策略在本领域是已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389391；Crameri，et al.，(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore，et al.，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri，et al.，(1998)Nature 391：288-291；以及美国专利5,605,793号与5,837,458，在此通过引用将其全文并入。

用于诱变和核苷酸序列改造的方法是本领域已知的。见于，例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel，et al.，(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利4,873,192号；Walker andGaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(分子生物学技术)(MacMillan Publishing Company，New York)以及其中所引用的参考文献，在此通过引用将其全文并入。

本发明的核苷酸序列可以用于从其他生物，尤其是其他植物，更尤其是其他单子叶植物中分离相应序列。以此方式，基于其与本文所给出的序列的序列同一性，可以使用诸如PCR、杂交等方法鉴定此类序列。基于其与本文所给出的整个ADF4序列或其片段的序列同一性而分离的序列也包括于本发明中。

在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应从cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列，该cDNA或基因组DNA由任何目的植物提取而来。设计PCR引物与PCR克隆的方法是本领域普遍已知的并公开于，Sambrook同上中。也请参见Innis，et al.，eds.(1990)PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(PCR实验方案：方法和应用指南)(Academic Press，New York)；Innis and Gelfand，eds.(1995)PCRStrategies(PCR策略)(Academic Press，New York)；以及Innis and Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(PCR方法手册)(Academic Press，NewYork)，在此通过引用将其全文并入。已知的PCR方法，包括但不限于，使用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，用所有或部分的已知核苷酸序列均作为探针，该探针可与其他相应的核苷酸序列选择性杂交，这些序列存在于来自所选生物的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群体(即，基因组或cDNA文库)中。该杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可探测基团例如³²P或任何其他可探测标记物标记。因此，例如，用于杂交的探针可以通过标记基于本发明ADF4启动子序列的合成的寡核苷酸来获得。制备用于杂交与基因组库构建的探针的方法是本领域已知的并公开于Sambrook同上中。

例如，本文所公开的整个ADF4启动子序列，或其一个或多个部分，可以用作能与相应的ADF4启动子序列以及信使RNA进行特异性杂交的探针。为了在各种条件下完成特异性杂交，此类探针包括ADF4启动子序列中独特的序列并长度通常为至少约10个核苷酸或至少约20个核苷酸。此类探针可以用于通过PCR从所选植物扩增相应的ADF4启动子序列。此技术可以被用于从所期望的生物中分离其他的编码序列，或作为诊断分析来测定生物中编码序列的存在。杂交技术包括平板DNA文库的杂交筛选(斑点或菌落，参见例如Sambrook，同上)。

此类序列的杂交可以在严格条件下进行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指使探针与其目标序列杂交的可检测程度比其与其他序列更高(例如，至少比背景高2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境中是不同的。通过控制杂交和/或洗脱条件的严格性，100％互补于探针的目标序列可以被识别(同源探测)。可选地，可以调整严格条件来允许序列中的一些错配，以便可以探测更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，优选长度少于约500个核苷酸。

通常，严格条件是如下条件，即在该条件中，在pH7.0-8.3下，盐浓度低于约1.5M钠离子，通常低于约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10-50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来完成。示例性的低严格条件包括在37℃以30％-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液进行杂交，并且在50-55℃以1倍至2倍SSC (20倍SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中度严格条件包括在37℃以40％-45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液进行杂交，并且最后在50-55℃在0.5-1倍SSC中至少持续洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃以50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液进行杂交，并且最后在60-65℃下在0.1倍SSC洗涤持续至少30分钟。杂交持续时间通常少于约24小时，通常约4至约12小时。洗涤的持续时间可以是至少足以达到平衡的时间长度。

特异性通常是杂交后洗涤的功能，关键因素是最后洗脱液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交而言，热熔点(T_m)可以由Meinkoth andWahl，(1984)Anal.Biochem 138：267284：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L等式大致计算出来；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交液中甲酰胺的百分比，L是碱基对的杂交长度。T_m值是50％的互补性目标序列与完美配对的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH值下)。每错配1％，T_m值就会降低约1℃，因此，可以调整T_m值、杂交和/或洗涤条件来与所需同一性的序列杂交。例如，如果要求90％同一性的序列，那么T_m值可以降低10℃。通常，对于特殊的序列及其互补体而言，在限定的离子强度和pH值下，选择比T_m值约低5℃的严格条件。然而，高度严格的条件可以在比T_m值低1、2、3或4℃的温度下进行杂交和/或洗涤；中度严格的条件可以在比T_m值低6、7、8、9或10℃的温度下进行杂交和/或洗涤；低严格的条件可以在比T_m值低6、7、8、9或10℃的温度下进行杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗脱组合物以及所需的T_m值，本领域普通技术人员可以理解杂交和/或洗涤液的严格性上的变化是本质上被描述了的。如果所需的错配程度导致T_m值低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，那么就优选提高SSC浓度从而可以使用更高的温度。核酸杂交的详尽指导见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Acid Probes(生物化学和分子生物学实验技术-用核酸探针杂交)，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)和Ausubel，et al.，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)中，在此通过引用将其全文并入。同样参见Sambrook。

因此，本发明包含分离的序列，该序列具有再生组织优选启动子活性，尤其是未成熟的穗优选启动子活性，并且其在严格条件下与本文所公开的ADF4启动子序列或其片段杂交。

一般而言，具有启动子活性并且与本文所公开的启动子序列杂交的序列，与公开的序列有至少40％-50％的同源性，约60％、70％、80％、85％、90％、95％至98％或更高的同源性。即，序列的序列相似性可以在一定范围内，共有至少约40％-50％、约60％-70％以及约80％、85％、90％、95％至98％的序列相似性。

以下术语用于描述两个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)″参照序列(reference sequence)″，(b)″比较窗(comparison window)″，(c)″序列同一性″，(d)″序列同一性的百分比″以及(e)″实质同一性″。

本文所用“参照序列”是指作为用作序列比较根据的限定序列。参照序列可以是指定序列的子集或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或全部的cDNA或基因序列。

本文所用“比较窗”涉及多核苷酸序列的连续且指定的片段，其中对于两个序列的最佳比对而言，在比较窗中多核苷酸序列与参照序列(不包含增加或删除)相比，可以包含添加或缺失(例如，缺口)。通常，比较窗的长度是至少20个连续的核苷酸，任选地可以是30、40、50、100或更长。本领域的那些技术人员理解，为了避免由于多核苷酸序列含有缺口造成的与参照序列的高相似性，通常引入缺口罚分并且从匹配数中减去。

用于比较的序列比对方法在本领域是熟知的。因此，可以使用数学算法来完成任意两个序列之间的序列同一性百分比的测定。这类数学算法的非限制性实施例为Myers and Miller，(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith，et al.，(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Needleman and Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法；Pearson and Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的算法；Karlin and Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872：264的算法，Karlin and Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877改良的算法，在此通过引用将其全文并入。

可以使用计算机执行这些数学算法，用来比较序列从而测定序列的同一性。这类执行包括但不限于：PC/Gene程序(可从Intelligenetics，Mountain View，Calif.获得)中的CLUSTAL；ALIGN程序(2.0版本)以及GCG Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，该软件包版本为10(可从Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，Calif.，USA获得)。使用这些程序的比对可以使用默认参数来进行。CLUSTAL程序由Higgins，et al.，(1988)Gene 73：237-244(1988)、Higgins，et al.，(1989)CABIOS 5：151-153、Corpet，et al.，(1988)NucleicAcids Res.16：10881-90、Huang，et al.，(1992)CABIOS 8：155-65以及Pearson，et al.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331进行了很好的描述，在此通过引用将其全文并入。ALIGN程序是以Myers and Miller(1988)同上的算法为基础的。当比较氨基酸序列时，PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4可以与ALIGN程序一起使用。Altschul，et al.，(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序，在此通过引用将其全文并入，以Karlin and Altschul，(1990)同上的算法为基础。BLAST核苷酸搜索可以与BLASTN程序一起执行，分值＝100，子长＝12，来获得与本发明的编码一种蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以与BLASTX程序一起执行，分值＝50，字长＝3，来获得与本发明的一种蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带缺口的比对，可以使用如Altschul，et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389所述的Gapped BLAST(BLAST 2.0中)，在此通过引用将其全文并入。可选地，可以使用PSI-BLAST(BLAST 2.0中)来进行迭代搜索(iteratedsearch)，其可以检测分子之间的远亲关系。参见Altschul，et al.，(1997)同上。当使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各程序的默认参数(例如，BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白)。参见，环球网上National Center for Biotechnology Information的网址ncbi.nlm.nih.gov。同样也可以通过观察来进行人工比对。

除非另有规定，本文所提供的序列同一性/相似性值涉及通过GAP版本10使用以下参数获得的值：使用缺口权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵的核苷酸序列的％同一性和％相似性；使用缺口权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵的氨基酸序列的％同一性和％相似性；或者其任何等同程序。本文所用“等同程序”是任何序列比较程序，对于任何两个所讨论的序列，当与GAP版本10所产生的相应比对相比时，该程序可产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配以及相同序列同一性百分比的比对。

GAP程序使用Needleman and Wunsch(同上)的算法，来找出两个完整序列的比对使配对数量最大化并且使缺口数量最小化。GAP考虑所有可能的比对和缺口位置，并且产生带最大匹配碱基数和最少缺口数的比对。它允许在匹配的碱基单位中提供缺口产生罚分和缺口延伸罚分。GAP必须利用其插入的每个缺口匹配的缺口产生罚分数。如果选择缺口延伸罚分大于0，那么GAP必须另外利用每个插入缺口的缺口长度乘以缺口延伸罚分。GCG Wisconsin Genetics软件包版本10中对于蛋白序列的默认缺口产生罚分和缺口延伸罚分分别是8和2。对于核苷酸序列而已，缺口产生罚分是50而缺口延伸罚分是3。缺口产生罚分和缺口延伸罚分可以表示为选自0-200的整数。因此，例如，缺口产生罚分和缺口延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高。

GAP表现为最佳比对家族中的一员。这个家族中可以有许多成员，但是没有其他成员有更好的质量。GAP呈现了四种用于比对的品质指标：质量、比例、同一性和相似性。质量是用于比对序列的最大化的衡量标准。比例是被更短片段中的碱基数量除的质量。同一性百分比是真实匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。忽略跨越缺口的符号。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50，即相似性的阈值时，对相似性进行评分。GCG Wisconsin Genetics软件包版本10中所用的评分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，在此通过引用将其全文并入)。

如本文所用，在两个核苷酸或多肽序列的语境下，“序列同一性”或“同一性”是指当在特定的比较窗中进行最大一致性的比对时，两个序列中相同的残基。当序列同一性的百分比被用于指蛋白时，公认的是不同的残基位点因保守氨基酸取代通常是不同的，这里氨基酸残基被其他具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基取代因此不改变分子的功能特性。当序列在保守的取代方面不同时，序列同一性百分比可以被上调来校正取代的保守性。因这类保守替代而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这包括将保守的替代评分为部分而不是全部错配，从而提高序列同一性百分比。因此，例如，当相同氨基酸的评分为1而非保守取代的评分为0时，保守取代的评分在0和1之间。计算保守取代的评分，例如PC/GENE程序(Intelligenetics，Mountain View，Calif.)所执行的。

本文所用“序列同一性百分比”指通过在比较窗比较两个最佳比对的序列所测定的值，其中对于两个序列的最佳比对，比较窗中的一部分多核苷酸序列与参照序列(不包含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(例如，缺口)。百分比的计算是通过测定在两个序列中存在相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位点的数目产生匹配位点数，以比较窗中位点总数除匹配位点的数目，并且将结果乘以100来产生序列同一性百分比。

术语多核苷酸序列的“实质同一性”指，通过比对程序使用默认参数与参照序列相比，包含具有至少70％序列同一性、优选至少80％、更优选至少90％以及最优选95％的序列的多核苷酸。本领域的技术人员公认通过考虑兼并密码、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当地调整这些数值，来测定两个核苷酸序列所编码的蛋白的相应同一性。基于此目的，氨基酸序列的实质同一性通常指序列同一性至少60％、70％、80％、90％以及至少95％的序列同一性。

另一个表示核苷酸序列是实质同一性的标记是，两个分子在严格条件下是否相互杂交。通常，在限定的离子强度和pH值下，选择比具体序列的T_m值低约5℃的严格条件。然而，严格条件包括比T_m值低约1℃至约20℃范围的温度，这取决于如本文另外所限定的所需的严格程度。在严格条件下不能互相杂交的核酸，如果其编码的多肽是实质相同的，那么它们仍然是实质相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大的密码简并性来产生核酸拷贝时，这就可以发生。两个核酸序列是实质相同的一个标记是，第一核酸所编码的多肽与第二核酸所编码的多肽是免疫交叉反应的。

本文所公开的ADF4启动子序列及其变体和片段，用于植物的基因过程，例如，用于产生转化的或转基因的植物，来表达目的表型。本文所用的术语“转化的植物”和“转基因的植物”指在其基因组中包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸是稳定地整合于转基因或转化的植物的基因组中，从而使多核苷酸传递给下一代。异源多核苷酸可以单独或作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。需要理解的是本文所用术语“转基因的”包括基因型被异源核酸的存在改变的任何细胞、细胞系、胼胝体、组织、植物部分或植物，该异源核酸包括那些由转基因学最初如此改变的异源还是以及那些由有性繁殖或无性繁殖从最初转基因产生的异源核酸。

转基因“事件”是用异源DNA构建体，包括含有目的转基因的核酸表达盒，转化植物细胞，由转基因插入植物的基因组导致植物群体的再生，以及选择特征为插入特定基因组位点的特定植物。事件的表型特征是转基因的表达。在遗传水平上，事件是植物基因组成的一部分。术语“事件”也指转化株和另一个植物之间有性繁殖所产生的后代，其中后代包括异源DNA。

本文所用术语植物包括全部的植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、植物细胞、植物原生质体、可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物胼胝体、植物丛(plant clumps)以及植物中完整的植物细胞或植物的部分，例如胚芽、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、玉米穗轴(cobs)、外壳(husk)、茎、根、根尖、花粉囊等。谷物是指非培育或繁殖种类目的的商业栽培物所生产的成熟的种子。再生植物的后代、变体和突突变体也包括于本发明的范围内，假定这些部分包含所引入的多核苷酸。

本发明可以用于转化任何植物种类，包括但不限于，单子叶植物和双子叶植物。植物种类的实例包括玉米(Zea mays)、芸苔属(Brassica)种类(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜(B.juncea))尤其那些可用植物油的芸苔属种类、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghumvulgare)、稷(例如，珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黍(Panicum miliaceum)、狐尾稷(Setaria italica)、穇子(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属(Coffea spp.))、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑桔树(柑橘属种类(Citrus spp.))、可可豆(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(芭蕉属种类(Musa spp.))、鳄梨(Perseaamericana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属种类(Saccharum spp.))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物，以及和针叶树。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrusspp.)，以及黄瓜属成员例如黄瓜(C.sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏性植物包括杜鹃花(杜鹃属种类(Rhododendronspp.))、八仙花(Macrophylla hydrangea)、芙蓉(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属种类(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp.))、水仙花(水仙属种类(Narcissus spp.))、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)以及菊花。

可以用于实施本发明的针叶树包括，例如，松树如火炬松(Pinustaeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；冷杉如银枞(Abies amabilis)和香脂(Abies balsamea)；以及雪松如西部铅笔柏(Thuja plicata)和黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体实施方案中，本发明的植物是农作物植物(例如，玉米、紫花苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、稷、烟草等)。在其他实施方案中，玉米和大豆植物是最佳的，而在另外的实施方案中，玉米植物是最佳的。

其他目的植物包括可提供感兴趣的种子的谷类植物，含油种子的植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等等。含油种子的植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、紫花苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆和豌豆。豆包括瓜尔豆、角豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

本发明的ADF4启动子所表达的异源编码序列可以用于改变植物的表型。表型的各种变化时有利的，包括改良植物中基因的表达，改变植物防御病菌或昆虫的机制，增强植物对除草剂的耐性，改变植物发育来应答环境应激，调解植物对盐、温度(热和冷)、干旱等的应答。可以通超表达包含适当基因产物的目的异源核苷酸序列来实现这些结果。在具体实施方案中，目的异源核苷酸序列是在植物或植物部分中表达水平提高的内源植物序列。可以通过提供表达改变的一个或多个内源基因产物或影响植物中的营养摄取来获得这些结果，内源基因产物尤其是激素、受体、信号分子、酶、转运蛋白或辅因子。如ADF启动子所提供的组织优选表达可以实现具体目的植物部分和/或生长阶段如生长中的生殖组织的表达的改变。这些改变可以导致转化植物表型的改变。

本发明目的核苷酸序列的一般种类包括，例如，与信息有关的那些基因，如锌指纹，与传送信息有关的那些基因，如激酶，以及与常规事件有关的那些基因，如热激蛋白。转基因的更多具体种类，例如，包括编码农业经济、抗昆虫、抗疾病、抗除草剂、抗环境应激(对寒冷、盐、干旱等的耐性改变)和谷物特性等重要遗传性状的基因。还有其他种类的转基因，包括用于诱导外源产物表达的基因，异源产物如来自植物和其他真核生物以及原核生物的酶、辅因子和激素。公认的是，任何目的基因都可以可操作性连接于本发明的启动子上并且在植物中表达。

影响谷物质量的农业经济上重要的遗传性状，例如油的水平和类型、饱和和不饱和、必需氨基酸的质量和数量、纤维素、淀粉和蛋白含量水平，可以使用实施方案的方法来进行基因改变。谷物遗传性状的修饰包括但不限于，提高油酸、饱和和不饱和油的含量，提高赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸，以及修饰淀粉。玉米中Hordothionin蛋白的修饰已在美国专利5,990,389号、5,885,801号、5,885,802号和5,703,049号中公开；在此通过引用将其全文并入。另一个实例是1996年3月20日提交的美国专利5,850,016号所述的大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白，以及Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem165：99-106中的大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，在此通过引用将以上公开内容的全文并入。

昆虫抗性基因可以编码对害虫的抗性，害虫会造成极大的生产阻碍例如食虫、毛虫、玉米螟等。这类基因包括，例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白基因，美国专利5,366,892号、5,747,450号、5,736,514号、5,723,756号、5,593,881号；和Geiser，et al.，(1986)Gene48：109，在此通过引用将以上公开内容的全文并入。编码疾病抗性遗传性状的基因包括，例如，解毒基因，如使伏马毒素(fumonisin)解毒的那些基因(美国专利5,792,931号)；无毒性(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones，etal.，(1994)Science 266：789；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432；以及Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089)，在此通过引用将其全文并入。

除草剂抗性遗传性状可以包括编码用于抵抗除草剂的基因，该除草剂会抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)的作用，尤其是磺脲型除草剂(例如，含有导致此类突变尤其是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合成酶(ALS)基因)，编码除草剂抗性的基因，该除草剂会抑制谷氨酰胺合成酶，如膦丝菌素或草铵膦(basta)(例如，bar基因)，编码草甘膦抗性的基因(例如，EPSPS基因和GAT基因；参见例如，美国专利申请公布2004/0082770和WO03/092360，在此通过引用将其全文并入)或本领域已知的其他这类基因。bar基因编码除草剂草铵膦抗性，nptII基因编码抗生素卡那霉素和遗传霉素抗性，而ALS-基因突变编码除草剂绿黄隆抗性。

草甘膦抗性是由突变的5-烯醇丙酮酸-3-phosphikimate合成酶(EPSP)和aroA基因赋予的。参见，例如，Shah等的美国专利4,940,835号，其公开了可以赋予草甘膦抗性的EPSPS形式的核苷酸序列。Barry等的美国专利5,627,061号也公开了编码EPSPS酶的基因。同样参见美国专利6,248,876 B1号、6,040,497号、5,804,425号、5,633,435号、5,145,783号、4,971,908号、5,312,910号、5,188,642号、4,940,835号、5,866,775号、6,225,114 B1号、6,130,366号、5,310,667号、4,535,060号、4,769,061号、5,633,448号、5,510,471号、Re.36,449号、RE 37,287E号和5,491,288号，以及国际公布WO 97/04103；WO 97/04114、WO 00/66746、WO01/66704、WO 00/66747和WO 00/66748，在此通过引用将其全文并入。同样赋予植物草甘膦抗性，该植物表达编码草甘膦氧化还原酶的基因，如美国专利5,776,760和5,463,175中更充分的描述，在此通过引用将其全文并入。此外可以通过超表达编码草甘膦N-乙酰转移酶的基因来赋予植物草甘膦抗性。参见例如，美国专利序列号11/405,845和10/427,692，在此通过引用将其全文并入。

不育基因也可以编码于DNA构建体中，并且为自然去雄提供选择。以此方式使用的基因的实例包括雄性组织优选基因和具有雄性不育表型的基因，例如美国专利5,583,210号所述的QM，在此通过引用将其全文并入。其他基因包括激酶和那些编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的基因。

商业遗传性状也可以编码入基因中，该基因可以提高例如用来生产乙醇的淀粉或提供蛋白的表达。转化植物的另一个重要的商业用途是，多聚体和原生质体的生产，例如美国专利5,602,321号所述，在此通过引用将其全文并入。基因例如β-酮硫解酶、PHBase(聚羟基丁酸合成酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847，在此通过引用将其全文并入)可以促进聚羟基链烷酸酯(PHAs)的表达。

外源产物包括植物酶和产物以及那些源于其他来源的包括原核生物和其他真核生物的产物。这类产物包括酶、辅因子、激素等。

其他可用基因及其相关表型的实例包括，编码病毒外壳蛋白和/或RNA的基因，或其他可赋予病毒抗性的病毒或植物基因；可赋予真菌抗性的基因；可促进产量改善的基因；以及提供应激抗性的基因，例如寒冷、干旱、热和盐分导致的脱水、有毒金属或微量元素等。

为了说明而非限制，以下是基因类型的实例，这些基因可以与本发明的调节序列一同使用。

1.转基因，其赋予昆虫或疾病抗性并编码：

(A)植物疾病抗性基因。植物防御通常被植物中的疾病抗性基因(R)的产物和病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用所激活。可以用克隆的抗性基因转化植物的种类，以便人工改造对特定病原体菌株具有抗性的植物。参见，例如，Jones，et al.，(1994)Science266：789(克隆番茄抗褐孢霉(Cladosporium fulvum)的Cf-9基因)；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432(抗番茄丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae pv.)的番茄Pto基因编码蛋白激酶)；Mindrinos，et al.，(1994)Cell78：1089(抗丁香假单胞菌的拟南芥属(Arabidopsis)RSP2基因)；McDowell and Woffenden，(2003)Trends Biotechnol.21(4)：178-83以及Toyoda，et al.，(2002)Transgenic Res.11(6)：567-82，在此通过引用将其全文并入。对疾病有抗性的植物与野生型植物相比，是对病原体具有更强抗性的植物。

(B)苏云金杆菌蛋白，其衍生物或以其为模型合成的多肽。参见例如，Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109，其公开了Bt δ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，MD)购买，例如，通过ATCC登录号40098、67136、31995和31998。被遗传改造的苏云金杆菌转基因的其他实例在以下专利和专利申请中给出并且为此目的通过引用并入：美国专利5,188,960号、5,689,052号、5,880,275号；WO 91/14778；WO 99/31248；WO 01/12731；WO 99/24581；WO97/40162和美国申请序列号：10/032,717、10/414,637和10/606,320，在此通过引用将其全文并入。

(C)昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮激素和保幼激素，其变体，基于其的模拟物，或其拮抗剂或兴奋剂。参见例如，Hammock，et al.，(1990)Nature 344：458公开的克隆的保幼激素酯酶在杆状病毒中的表达，保幼激素酯酶是一种保幼激素灭活剂，在此通过引用将其全文并入。

(D)昆虫特异性肽，其表达后能破坏感染的害虫的生理机能。例如，见于Regan，(1994)J.Biol.Chem.269：9(表达克隆产生编码用于昆虫利尿激素受体的DNA)；Pratt，et al.，(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163：1243(在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴定出昆虫神经肽咽侧体抑制激素)；Chattopadhyay，et al.，(2004)Critical Reviews inMicrobiology 30(1)：33-54；Zjawiony(2004)J Nat Prod 67(2)：300-310；Carlini and Grossi-de-Sa(2002)Toxicon 40(11)：1515-1539；Ussuf，et al.，(2001)Curr Sci.80(7)：847-853；以及Vasconcelos and Oliveira(2004)Toxicon 44(4)：385-403公开的内容，在此通过引用将其全文并入。同样参见Tomalski等的美国专利5,266,317号，其公开了编码昆虫特异性毒素的基因，在此通过引用将其全文并入。

(E)引起单萜、倍半萜烯、类固醇、羟肟酸、苯丙烷类化合物的衍生物或另一个带杀虫剂活性的非蛋白分子超堆积的酶。

(F)与生物学活性分子修饰包括翻译后修饰有关的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、解脂酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶以及葡聚糖酶，不论是天然的还是合成的。参见Scott等的PCT申请WO 93/02197，其公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列，在此通过引用将其全文并入。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可以从例如ATCC登录号39637和67152获得。同样参见Kramer，et al.，(1993)Insect Biochem.Molec.Biol.23：691，其公开了编码烟草天蛾几丁质酶的cDNA的核苷酸序列，以及Kawalleck，et al.，(1993)Plant Molec.Biol.21：673，其提供了欧芹ubi4-2多遍在蛋白质基因的核苷酸序列，美国专利申请序列号10/389,432、10/692,367和美国专利申请6,563,020号，在此通过引用将其全文并入。

(G)刺激信号转导的分子。例如，参见Botella，et al.，(1994)PlantMolec.Biol.24：757公开的绿豆调钙蛋白cDNA克隆的核苷酸序列，以及Griess，et al.，(1994)Plant Physiol.104：1467，其提供了玉米调钙蛋白cDNA克隆的核苷酸序列，在此通过引用将其全文并入。

(H)疏水性力矩肽(hydrophobic moment peptide)。参见PCT申请WO95/16776和美国专利申请5,580,852(公开了抑制真菌的植物病原体的速普肽的肽衍生物)以及PCT申请WO 95/18855和美国专利申请5,607,914(公开了可赋予疾病抵抗力的和合成的抗菌肽)，在此通过引用将其全文并入。

(I)膜透性酶，一种通道构成剂或通道封阻剂。例如，参见Jaynes，etal.，(1993)Plant Sci.89：43公开的杀菌肽-β细胞溶解酶的肽类似物的异源表达，使转基因的烟草植物对青枯假单胞菌具有抗性，在此通过引用将其全文并入。

(J)病毒入侵蛋白或其衍生的复合毒素(complex toxin)。例如，转化的植物细胞中的病毒外壳蛋白的积聚赋予其对病毒感染和/或由外壳蛋白基因来源的病毒和相关病毒引起的疾病发展的抗性。参见，Beachy，etal.，(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28：451，在此通过引用将其全文并入。外壳蛋白介导的抗性赋予转化的植物抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、土豆病毒X、土豆病毒Y、烟草蚀刻病毒、烟草皱屈病毒和烟草花叶病毒的能力。同上。

(K)昆虫特异性抗体或其衍生的抗毒素。因此，靶向昆虫消化道内关键的新陈代谢功能的抗体会使受影响的酶失活，从而杀死昆虫。参见Taylor，et al.，Abstract #497，SEVENTH INT′L SYMPOSIUM ONMOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS(Edinburgh，Scotland，1994)(通过单链抗体片段的产生使转基因烟草中的酶失活)，在此通过引用将其全文并入。

(L)病毒特异性抗体。参见例如，Tavladoraki，et al.，(1993)Nature366：469，其公开了表达重组抗体的转基因植物可以免受病毒的攻击，在此通过引用将其文并入。

(M)由病原体或寄生虫天然产生的发育抑制蛋白(developmental-arrestive protien)。因此，真菌内α-1，4-D-多聚半乳糖醛酸酶可以通过溶解植物细胞壁的同源-α-1，4-D-半乳糖醛酸酶来促进真菌建群以及植物营养物质释放。参见Lamb，et al.，(1992)Bio/Technology10：1436，在此通过引用将其全文并入。Toubart，et al.，(1992)Plant J.2：367描述了编码豆内源多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征，在此通过引用将其全文并入。

(N)植物天然产生的发育抑制蛋白。例如，Logemann，et al.，(1992)Bio/Technology 10：305公开了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物的真菌疾病抗性增强，在此通过引用将其全文并入。

(O)与系统获得抗性(SAR)应答的基因和/或发病机制相关的基因。Briggs，(1995)Current Biology 5(2)：128-131，Pieterse and Van Loon(2004)Curr.Opin.Plant Bio.7(4)：456-64和Somssich(2003)Cell 113(7)：815-6，在此通过引用将其文并入。

(P)抗真菌的基因(Comelissen and Melchers，(1993)Pl.Physiol.101：709-712，和Parijs，et al.，(1991)Planta 183：258-264，以及Bushnell，etal.，(1998)Can.J.of Plant Path.20(2)：137-149)。同样参见美国专利申请09/950,933，在此通过引用将其全文并入。

(Q)解毒基因，例如用于烟曲霉毒素、白僵菌素、念珠镰刀菌素和玉米烯酮及其结构上相关的衍生物。例如，见于美国专利5,792,931号，在此通过引用将其全文并入。

(R)半胱氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。参见美国申请序列号10/947,979，在此通过引用将其全文并入。

(S)防卫素基因。参见WO03000863和美国申请序列号10/178,213，在此通过引用将其文并入。

(T)赋予抗线虫抗性的基因。参见WO 03/033651和Urwin，et.al.，(1998)Planta 204：472-479，Williamson(1999)Curr Opin Plant Bio.2(4)：327-31，在此通过引用将其全文并入。

(U)诸如赋予炭疽病茎腐烂抗性的rcg1等的基因，炭疽病茎腐烂是由真菌Colletotrichum graminiola引起的。参见Jung，et al.，Generation-means analysis and quantitative trait locus mapping ofAnthracnose Stalk Rot genes in Maize，Theor.Appl.Genet.(1994)89：413-418以及美国专利申请60/675,664，在此通过引用将其全文并入。

2.赋予除草剂抗性的转基因，例如：

(A)抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮或磺脲。这种示例性的基因编码例如由Lee，et al.，(1988)EMBO J.7：1241和Miki，etal.，(1990)Theor.Appl.Genet.80：449分别公开的突变的ALS和AHAS酶。同样参见美国专利5,605,011号、5,013,659号、5,141,870号、5,767,361号、5,731,180号、5,304,732号、4,761,373号、5,331,107号、5,928,937号和5,378,824号，以及国际公布WO 96/33270，在此通过引用将其全文并入。

(B)草甘膦(分别由突变的5-烯醇丙酮酸-3-phosphikimate合成酶(EPSP)和aroA基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物例如草丁膦(膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)膦丝菌素乙酰转移酶(bar)基因)，以及氧化吡啶(pyridinoxy)或苯氧基丙酸和环异己酮(ACCase抑制剂编码的基因)。参见例如，Shah等的美国专利4,940,835，其公开了可以赋予草甘膦抗性的EPSPS形式的核苷酸序列。Barry等的美国专利5,627,061也公开了编码EPSPS酶的基因。同样参见美国专利6,566,587号、6,338,961号、6,248,876B1号、6,040,497号、5,804,425号、5,633,435号、5,145,783号、4,971,908号、5,312,910号、5,188,642号、4,940,835号、5,866,775号、6,225,114B1号、6,130,366号、5,310,667号、4,535,060号、4,769,061号、5,633,448号、5,510,471号、Re.36,449号、RE 37,287E号和5,491,288号，以及国际公布EP1173580、WO 01/66704、EP1173581和EP1173582，在此通过引用将其全文并入。同样赋予植物草甘膦抗性，该植物表达编码草甘膦氧化还原酶的基因，如美国专利5,776,760号和5,463,175号中更充分描述的，在此通过引用将其全文并入。此外可以通过超表达编码草甘膦N-乙酰转移酶的基因，赋予植物草甘膦抗性。参见，例如，美国专利序列号11/405,845和10/427,692，以及PCT申请US01/46227，在此通过引用将其全文并入。编码突变的aroA基因的DNA分子可以通过ATCC登录号39256获得，并且Comai的美国专利4,769,061号公开了突变基因的核苷酸序列，在此通过引用将其全文并入。Kumada等的欧洲专利申请0333033和Goodman等的美国专利申请4,975,374公开了谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列，其可以赋予对例如L-膦丝菌素等除草剂的抗性，在此通过引用将其全文并入。膦丝菌素乙酰转移酶基因的核苷酸序列由Leemans等的欧洲专利申请0 242 246和0 242 236，以及De Greef，et al.，(1989)Bio/Technology 7：61所提供，De Greef等公开了表达编码用于膦丝菌素乙酰转移酶活性的嵌合的bar基因的转基因植物的产生，在此通过引用将其全文并入。同样参见美国专利5,969,213号、5,489,520号、5,550,318号、5,874,265号、5,919,675号、5,561,236号、5,648,477号、5,646,024号、6,177,616 B1号和,879,903号，在此通过引用将其全文并入。赋予对苯氧基丙酸和环异己酮例如稀禾定和吡氟氯草灵抗性的示例性基因，是Marshall，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.83：435公开的Acc1-S1，Acc1-S2和Acc1-S3基因，在此通过引用将其全文并入。

(C)抑制光和作用的除草剂，例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)。Przibilla，et al.，(1991)Plant Cell 3：169公开了用编码突变的psbA基因的质粒转化衣藻，在此通过引用将其文并入。Stalker的美国专利4,810,648公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，在此通过引用将其全文并入，并且含有这些基因的DNA分子可以通过ATCC登录号53435、67441和67442获得。Hayes，et al.，(1992)Biochem.J.285：173公开了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达，在此通过引用将其全文并入。

(D)乙酰羟酸合成酶，发现其用于获得表达抗多种除草剂的这一类酶的植物，已被引入多种植物中(参见例如，Hattori，et al.，(1995)Mol GenGenet 246：419，在此通过引用将其全文并入)。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota，et al.，(1994)Plant Physiol.106(1)：17-23)，谷胱甘肽还原酶和过氧化物歧化酶的基因(Aono，et al.，(1995)Plant Cell Physiol 36：1687)，以及用于多种磷酸转移酶的基因(Datta，et al.，(1992)Plant Mol Biol 20：619)，在此通过引用将其全文并入。

(E)原卟啉原氧化酶(protox)是生产叶绿素所必需的，其对所有植物的存活是必需的。protox酶作为多种除草剂化合物的靶标。这些除草剂也会抑制所有存在的不同种类的植物的生长，导致它们完全摧毁。美国专利6,288,306 B1号、6,282,837 B1号和5,767,373号，以及国际公布WO 01/12825描述了含有改变的protox活性的对这些除草剂有抗性的植物的发育，在此通过引用将其全文并入。

3.赋予或有助于改变的谷物特性的转基因，例如：

(A)改变的脂肪酸，例如，通过

(1)下调硬脂酰-ACP去饱和酶来增加植物的硬脂酸含量。参见Knultzon，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2624和WO99/64579(Genes for Desaturases to Alter Lipid Profiles in Corn(玉米种改变脂质特性的去饱和酶基因))，在此通过引用将其全文并入，

(2)通过FAD-2基因修饰来提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰来降低亚麻酸(参见美国专利6,063,947号、6,323,392号、6,372,965号以及WO 93/11245，在此通过引用将其全文并入)，

(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，例如WO 01/12800中，在此通过引用将其全文并入，

(4)改变LEC1、AGP、Dek1、Superal1、mi1ps，各种lpa基因例如lpa1，lpa3，hpt或hggt。例如，参见WO 02/42424、WO 98/22604、WO 03/011015、美国专利6,423,886号、美国专利6,197,561号、美国专利6,825,397号，美国专利申请公开号2003/0079247、2003/0204870，WO02/057439、WO03/011015以及Rivera-Madrid，et.al.，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92：5620-5624，在此通过引用将其全文并入，

(B)改变的磷含量，例如，通过

(1)肌醇六磷酸酶编码基因的引入将促进肌醇六磷酸的分解，增加更多的游离磷酸盐到转化的植物中。例如，参见Van Hartingsveldt，etal.，(1993)Gene 127：87，其公开了黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列，在此通过引用将其全文并入。

(2)上调可降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉米中，例如，这可以通过克隆和然后再引入DNA来完成，该DNA与一个或多个等位基因相关，例如在以低水平肌醇六磷酸为特征的玉米突变体中鉴别出来的LPA等位基因，例如Raboy，et al.，(1990)Maydica 35：383中，和/或通过改变肌醇激酶活性，如在WO 02/059324，、美国专利申请公开号2003/0009011、WO 03/027243、美国专利申请公开号2003/0079247、WO 99/05298、美国专利6,197,561号、美国专利6,291,224号、美国专利6,391,348号、WO2002/059324、美国专利申请公开号2003/0079247、WO98/45448、WO99/55882、WO01/04147中，在此通过引用将其全文并入。

(C)改变受影响的碳水化合物，例如，通过改变影响淀粉分枝模式的酶的基因或使硫氧还蛋白如NTR和/或TRX(参见美国专利6,531,648，在此通过引用将其全文并入)和/或γ玉米蛋白敲除体或突变体如cs27或TUSC27或en27(参见美国专利6,858,778和美国专利申请公开号2005/0160488和2005/0204418；在此通过引用将其全文并入)改变的基因。参见Shiroza，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：810(突变链球菌(Streptococcus mutans)果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz，et al.，(1985)Mol.Gen.Genet.200：220(枯草芽孢杆菌蔗糖6-果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Pen，et al.，(1992)Bio/Technology 10：292(表达地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的生产)，Elliot，etal.，(1993)Plant Molec.Biol.21：515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，et al.，(1993)J.Biol.Chem.268：22480(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)，以及Fisher，et al.，(1993)Plant Physiol.102：1045(玉米胚乳淀粉分支酶II)，WO 99/10498(通过修饰UDP-D-木糖4-差向异构酶、Fragile 1和2、Ref1、HCHL、C4H来改善消化性和/或淀粉提取)，美国专利6,232,529号(通过改良淀粉水平(AGP)来产生高含油种子的方法)，在此通过引用将其全文并入。以上提及的脂肪酸修饰基因也可以通过淀粉和油的途径的相互关系而用于影响淀粉的含量和/或成分。

(D)改变的抗氧化剂含量或成分，例如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见美国专利6,787,683号、美国专利申请公开号2004/0034886以及WO 00/68393涉及通过改变植物异戊二烯转移酶(ppt)来操纵抗氧化剂的水平，而WO 03/082899通过改变尿黑酸香叶酯香叶酯转移酶(hggt)，在此通过引用将其全文并入。

(E)改变的必需种子氨基酸。例如，参见美国专利6,127,600号(提高种子中必需氨基酸积聚的方法)，美国专利6,080,913号(提高种子中必需氨基酸积聚的二元方法)，美国专利5,990,389号(高赖氨酸)，WO99/40209(种子中氨基酸成分的改变)，WO99/29882(改变蛋白质的氨基酸含量的方法)，美国专利5,850,016号(改变种子中氨基酸成分的方法)，WO98/20133(带水平提高的必需氨基酸的蛋白质)，美国专利5,885,802号(高甲硫氨酸)，美国专利5,885,801号(高苏氨酸)，美国专利6,664,445号(植物氨基酸生物合成酶)，美国专利6,459,019号(提高的赖氨酸和苏氨酸)，美国专利6,441,274号(植物色氨酸合成酶β亚基)，美国专利6,346,403号(甲硫氨酸代谢酶)，美国专利5,939,599号(高硫)，美国专利5,912,414号(提高的甲硫氨酸)，WO98/56935(植物氨基酸生物合成酶)，WO98/45458(含更高百分比的必需氨基酸的工程种子蛋白)，WO98/42831(提高的赖氨酸)，美国专利5,633,436号(提高硫氨基酸的含量)，美国专利5,559,223号(带特定结构的人工贮存蛋白质，包括可设计必需氨基酸的水平来改善植物的营养值)，WO96/01905(提高的苏氨酸)，WO95/15392(提高的赖氨酸)，美国专利申请公开号2003/0163838，美国专利申请公开号2003/0150014，美国专利申请公开号2004/0068767，美国专利6,803,498号，WO01/79516，与WO00/09706(Ces A：纤维素合成酶)，美国专利6,194,638(半纤维素)，美国专利6,399,859号与美国专利申请公开号2004/0025203(UDPGdH)，美国专利6,194,638号(RGP)，在此通过引用将其全文并入。

4.控制雄性不育的基因

有几种可用的赋予遗传性雄性不育的方法，例如在基因组中的分离位点处的赋予雄性不育特性的多重突变基因，如Brar，et al.公开的美国专利4,654,465号与4,727,219号，以及如Patterson在美国专利3,861,709号与3,710,511号中所描述的染色体易位，在此通过引用将其全文并入。除了这些方法之外，Albertsen，et al.，美国专利5,432,068号，在此通过引用将其全文并入，描述了细胞核雄性不育系统，其包括鉴定对雄性不育关键的基因；使此对雄性不育关键的天然基因沉默；从必要的雄性不育基因中除去天然启动子并以可诱导的启动子取代它；将此遗传工程基因插回植物中；这样就因为可诱导的启动子未“开启”导致雄性不育基因不被转录从而产生雄性不育的植物。繁殖能力的恢复可通过诱导或“开启”该启动子，从而允许赋予雄性繁殖能力的基因被转录。

(A)在绒毡层特异性启动子的控制下以及应用化学物质N-Ac-PPT(WO 01/29237，在此通过引用将其全文并入)引入脱乙酰基酶基因。

(B)引入各种雄蕊特异性启动子(WO 92/13956、WO 92/13957，在此通过引用将其全文并入)。

(C)引入芽孢杆菌RNA酶和芽孢杆菌RNA酶抑制子基因(Paul，etal.，(1992)Plant Mol.Biol.19：611-622，在此通过引用将其全文并入)。

关于细胞核的雄性和雌性不育系统与基因的另外例子，同样参见美国专利5,859,341号、6,297,426号、5,478,369号、5,824,524号、5,850,014号与6,265,640号；在此通过引用由此将所有这些的全文并入。

5.产生用于位点特异性DNA整合的位点的基因。其包括引入可用于FLP/FRT系统中的FRT位点和/或可用于Cre/Loxp系统中的Lox位点。例如，参见Lyznik，et al.，(2003)Site-Specific Recombination for GeneticEngineering in Plants，Plant Cell Rep 21：925-932和WO 99/25821，在此通过引用由此将其全文并入。可以使用的其他系统包括噬菌体Mu的Gin重组酶(Maeser，et al.，1991；Vicki Chandler，The Maize Handbook ch.118(Springer-Verlag 1994)、E.coli的Pin重组酶(Enomoto，et al.，1983)，以及pSR1质粒的R/RS系统(Araki，et al.，1992)，在此通过引用将其全文并入。

6.影响抗非生物性应激的基因(包括但不限于开花、抽穗与种子发育、氮利用率的提高、改变的氮反应性、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性，以及抗盐性或耐盐性)和在应激下增加的产量。例如，参见WO00/73475，其中，水的使用效率可通过苹果酸盐的改变而改变；美国专利5,892,009，美国专利5,965,705号、美国专利5,929,305号、美国专利5,891,859号、美国专利6,417,428号、美国专利6,664,446号、美国专利6,706,866号、美国专利6,717,034号、WO2000060089、WO2001026459、WO2001035725、WO2001034726、WO2001035727、WO2001036444、WO2001036597、WO2001036598、WO2002015675、WO2002017430、WO2002077185、WO2002079403、WO2003013227、WO2003013228、WO2003014327、WO2004031349、WO2004076638、WO9809521以及WO9938977描述了包括CBF基因与转录因子在内的基因，其有效减轻严寒、高盐度与干旱对植物的负面作用，以及赋予植物表型其他正面作用；美国专利申请公开号2004/0148654与WO01/36596，其中植物中的脱落酸被改变从而产生改善的植物表型，例如产量增加和/或对非生物性应激的耐性增强；WO2000/006341，WO04/090143，美国专利申请序号10/817483与美国专利6,992,237号，其中细胞分裂素的表达被改良从而导致植物应激耐性如耐旱性增强，和/或产量增加，在此通过引用将其全文并入。同样参见WO0202776、WO2003052063、JP2002281975、美国专利6,084,153号、WO0164898、美国专利6,177,275号、美国专利6,107,547号(促进氮的利用和改变的氮反应性)，在此通过引用将其全文并入。对于乙烯的改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美国专利申请公开号2003/0166197以及WO200032761，在此通过引用将其全文并入。关于植物的非生物性应激的转录因子或转录调节子，参见例如美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852，在此通过引用将其全文并入。

影响植物生长与农艺学特性例如产量、开花、植物生长和/或植物结构的其他基因与转录因子，均可被引入或基因渗入到植物中，参见例如WO97/49811(LHY)、WO98/56918(ESD4)、WO97/10339与美国专利6,573,430(TFL)号、美国专利6,713,663(FT)号、WO96/14414(CON)、WO96/38560、WO01/21822(VRN1)、WO00/44918(VRN2)、WO99/49064(GI)、WO00/46358(FRI)、WO97/29123、美国专利6,794,560号、美国专利6,307,126(GAI)号、WO99/09174(D8与Rht)，以及WO2004076638和WO2004031349(转录因子)，在此通过引用将其全文并入。

可操作性连接于在此公开的ADF启动子与其相关生物学活性片段或变体的异源核苷酸序列可以是用于定向基因(targeted gene)的反义序列。术语“反义DNA核苷酸序列”是指与核苷酸序列的5′-至-3′正常方向相反的方向的序列。当送递至植物细胞时，反义DNA序列的表达可阻止定向基因的DNA核苷酸序列的正常表达。该反义核苷酸序列编码RNA转录物，该RNA转录物与内源信使RNA(mRNA)互补并能与之杂交，该信使RNA通过定向基因的DNA核苷酸序列的转录而产生。在此情况下，定向基因所编码的天然蛋白质的产生受到抑制，从而获得期望的表型应答。可以进行反义序列的修饰，只要该序列与相应mRNA杂交并干扰相应mRNA表达。以此方式，可以使用与相应的反义序列具有70％、80％、85％的序列同一性的反义构建物(antisense constructions)。此外，反义核苷酸的一部分可以用于破坏定向基因的表达。通常，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或更长的序列。因此，本文公开的启动子序列可以可操作性连接于反义DNA序列，以减少或抑制植物中天然蛋白质的表达。

“RNAi”指减少基因表达的一系列相关技术(参见例如，美国专利6,506,559号，在此通过引用将其全文并入)。以其他名称提及的较早的技术现在被认为是依据同样的机制，但在文献中以不同的名称给出。这些包括“反义抑制”，产生能够抑制目标蛋白表达的反义RNA转录物，和“共抑制”或“反义抑制”，其指产生能够抑制相同或实质上类似的外源或内源基因表达的正义RNA转录物(美国专利5,231,020号，在此通过引用将其全文并入)。此类技术依赖于可导致双链RNA积聚的构建体的使用，该双链RNA的一条链与靶基因互补从而使之沉默。这些实施方案的ADF4启动子可以用于促进构建体的表达，这将导致RNA干扰，包括小RNA(microRNA)和siRNA。

本文所用术语“启动子”或“转录起始区”是指DNA调节区，通常包含能指导RNA聚合酶II在特定编码序列的适宜转录起始位点启动RNA合成的TATA盒。启动子可以另外包含其他的识别序列，这些识别序列通常位于TATA盒的上游或5’，称为上游启动子元件，其影响转录启动的速度。公认已经鉴定出本文所公开的启动子区的核苷酸序列，分离与鉴定本文所鉴定出的特定启动子区上游的5’未翻译区中的更多的调节元件，在现有技术的范围内。另外，可以提供嵌合启动子。此类嵌合体包括融合到异源转录调节区的片段和/或变体上的启动子序列的一部分。因此，本文所公开的启动子区可以包含上游调节元件，例如负责编码序列的组织性和暂时性表达的那些元件、增强子等。同样，能在期望的组织例如再生组织中表达的启动子元件，可以与其他核心启动子一起被鉴定、分离与使用来赋予再生组织优选表达。在本发明的这个方面中，“核心启动子”是指没有启动子元件的启动子。

本文所用术语“调节元件”也指DNA序列，通常但不总是，结构基因的编码序列的上游(5’)，其包括控制编码区表达的序列，该控制通过提供用于RNA聚合酶识别和/或用于在特定位点启动转录所需的其他因子来进行。提供RNA聚合酶识别或确保在特定位点起始的其他转录因子的调节元件的实例是启动子元件。启动子元件包含负责转录起始的核心启动子元件，以及修饰基因表达的其他调节元件。需要理解的是，位于内含子内或编码区序列的3′的核苷酸序列，也可以有助于调节目的编码区的表达。适宜的内含子的实例包括但不限于，玉米IVS6内含子或玉米肌动蛋白内含子。调节元件也可以包括位于转录起始位点下游(3′)，或已转录的区域中，或两者皆有的那些元件。在本发明的内容中，转录后调节元件可以包括在转录启动之后具有活性的元件，例如翻译与转录增强子、翻译与转录阻抑物以及mRNA稳定性决定因子。

本发明的调节元件或其变体或片段可以可操作性连接于异源调节元件或启动子，从而调节异源调节元件的活性。此类调节包括增强或抑制异源调节元件的转录活性、调节转录后事件，或者增强或抑制异源调节元件的转录活性以及调节转录后事件。例如，本发明的一个或多个调节元件或其片段可以可操作性连接于组成性的、可诱导的或组织特异性的启动子或其片段，以调节此类启动子在植物细胞中的所期望组织内的活性。

本发明的调节序列或其变体或片段，当可操作性连接于目的异源核苷酸序列时，可以促进异源核苷酸序列在表达此构建体的植物的再生组织中的再生组织优选表达，优选为穗优选表达。术语“再生组织优选”指异源核苷酸序列的表达在再生组织中是最丰富的。当异源核苷酸序列的一定水平的表达可以在其他植物组织类型中发生时，而在再生组织中发生的表达是最丰富的。

“异源核苷酸序列”是不与本发明的启动子序列一起天然存在的序列。尽管核苷酸序列与启动子序列是异源的，但其与植物宿主可以是同源的，或天然的，或异源的，或外源的。

本发明的分离的启动子序列经修饰可以提供异源核苷酸序列一定范围的表达水平。因此，可以使用少于整个启动子区并且保留促进目的核苷酸序列表达的能力。公认的是mRNA的表达水平可以通过不同方式缺失启动子序列部分来改变。可以使mRNA的表达水平降低，或可选地，例如如果有负调节元件(作为阻抑物)，那么作为启动子缺失的结果可以使表达增加，在截短过程中负调节元件会被去除。通常，分离的启动子序列的至少约20个核苷酸可以用于促进核苷酸序列的表达。

公认的是，为了提高转录水平，增强子可以与本发明的启动子区结合使用。增强子是用于增强启动子区表达的核苷酸序列。增强子是本领域已知的并且包括SV40增强子区、35S增强子元件等。已知一些增强子改变正常启动子的表达模式，例如，当不带增强子时通过使启动子组成性表达，相同的启动子仅在一个特定组织或一些特定组织中表达。

本发明的分离的启动子序列的修饰，可以提供异源核苷酸序列一定范围的表达。因此，它们经修饰可以成为弱启动子或强启动子。通常，“弱启动子”指促进编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”表达是指表达水平为约1/10,000的转录物至约1/100,000的转录物、至约1/500,000的转录物。相反，强启动子促进编码序列以高的水平表达，或者为约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物。

公认的是，本发明的启动子可以与它们的天然ADF4编码序列一起使用来增加或减少表达，从而导致转化植物的表型变化。本发明所公开的核苷酸序列，及其变体和片段，可用于任何植物的遗传操作。当可操作性连接于异源核苷酸序列时，ADF4启动子序列可用于这方面，该异源核苷酸序列的表达受到控制来获得所期望的表型应答。术语“可操作性连接”指异源核苷酸序列的转录或翻译受启动子序列的影响。因此，可以将本发明的启动子的核苷酸序列与目的异源核苷酸序列一起提供于表达盒中，用于在目的植物中表达，更特别地是用于在植物的再生组织中表达。

在本发明的一个实施方案中，表达盒包含转录起始区，该转录起始区包含本发明的一个启动子核苷酸序列或其变体或片段，其可操作性连接于异源核苷酸序列。这类表达盒可以提供有多个限制位点，该限制位点用于插入受调节区转录调节的核苷酸序列。该表达盒可以另外含有可选择的标记基因以及3’末端区域。

表达盒可以包括，在转录的5’-3’方向，转录起始区(即本发明的启动子，或其变体或片段)、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、翻译终止区，以及任选地，在宿主生物中具有功能的转录终止区。这些实施方案的调节区(即启动子、转录调节区以及翻译终止区)和/或多核苷酸对宿主细胞而言可以是天然的/相似的或相互是天然的/相似的。可选地，这些实施方案的调节区和/或多核苷酸对宿主细胞而言可以是异源的或相互是异源的。本文所用“异源的”涉及的序列是来源于异种的序列，或者，如果来自相同种类，则是由其天然形式在成分和/或基因组位点上通过特意的人为干涉而被实质性修饰的序列。例如，可操作性连接于异源多核苷酸的启动子是来自于与多核苷酸所来源的种类不同的种类，或者，如果来自相同/类似的种类，其一或二者由它们的原始形式和/或基因组位点被实质性修饰，或该启动子不是用于可操作性的连接多核苷酸的天然启动子。

当可以优选使用本发明的启动子表达异源核苷酸序列时，可以表达天然序列。此类构建体可以改变植物或植物细胞中ADF4蛋白的表达水平。因此，改变植物或植物细胞的表型。

终止区以及转录起始区可以是天然的，与可操作性连接的目的DNA序列可以是天然的，与植物宿主可以是天然的，或者可以衍生于其他来源(即对启动子、所表达的DNA序列、植物宿主或者它们的任意结合而言是外源的或异源的)。适当的终止区可以来自根癌土壤杆菌(A.tumefacines)的Ti-质粒，例如羧乙基精氨酸合酶与胭脂氨酸合酶终止区。同样参见Guerineau，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon，et al.，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen，et al.，(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe，et al.，(1990)Gene 91：151-158；Ballas，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；以及Joshi，et al.，(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639，在此通过引用将其全文并入。

包含本发明序列的表达盒也可以含有待共转化到生物中的基因的至少一个其他的核苷酸序列。可选地，该其他的序列可以呈现于另一个的表达盒上。

如果合适，在本发明的再生组织优选启动子序列控制下表达的核苷酸序列与任何其他核苷酸序列可以被优化用于在转化的植物中增加表达。即，这些核苷酸序列可以通过使用改善表达的植物优选密码子来合成。参见，例如，Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11，在此通过引用将其全并入，讨论宿主优选密码子的使用。在本领域可用合成植物优选基因的方法。参见，例如，美国专利5,380,831号、5,436,391号以及Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，在此通过引用将其全文并入。

已知其他序列的修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除编码假的多聚腺苷酸信号的序列，外显子-内含子剪接位点信号，转位子样重复，以及其他此类已确定的对基因表达可能有害的序列。异源核苷酸序列的G-C含量可以调节至给定的细胞宿主的平均水平，这可通过参考在该宿主细胞中表达的已知基因来计算。如果可能，修饰该序列以避免预测的二级mRNA发夹结构。

表达盒可以另外含有5’前导序列。此类前导序列可以用于增强翻译。翻译前导区是本领域已知的且包括，但不限于：小核糖核酸病毒前导区，例如，EMCV前导区(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein，et al.，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导区，例如，TEV前导区(烟草蚀刻病毒)(Allison，et al.，(1986)Virology154：9-20)；MDMV前导区(玉米矮小花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，et al.，(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译前导区(AMV RNA 4)(Jobling，et al.，(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导区(TMV)(Gallie，et al.，(1989)Molecular Biology of RNA，pages 237-256)；以及玉米萎黄斑点病毒前导区(MCMV)(Lommel，et al.，(1991)Virology 81：382-385)，在此通过引用将其全文并入。同样参见，Della-Cioppa，et al.，(1987)Plant Physiology84：965-968，在此通过引用将其全文并入。也可以使用已知增强mRNA稳定性的方法，例如内含子，如玉米遍在蛋白质内含子(Christensen andQuail(1996)Transgenic Res.5：213-218；Christensen，et al.，(1992)PlantMolecular Biology 18：675-689)或玉米AdhI内含子(Kyozuka，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.228：40-48；Kyozuka，et al.，(1990)Maydica 35：353-357)等，在此通过引用将其全文并入。

如果需要，这些实施方案的DNA构建体也可以进一步包括增强子，或翻译或转录增强子。这些增强子区是本领域技术人员已知的，并且可包括ATG起始密码子与邻接序列。起始密码子必须与编码序列的阅读框协调，以确保整个序列的翻译。翻译控制信号与起始密码子可以来自于各种来源，包括天然的和合成的。翻译起始区可以由转录起始区的来源提供，或者由结构基因提供。该序列也可以衍生于经选择表达该基因的调控元件，并且可以被特异性修饰从而增加mRNA的翻译。公认的是，为了提高转录水平，增强子可以与实施方案的启动子区结合使用。增强子是本领域已知的并且包括SV40增强子区、35S增强子元件等。

在制备表达盒时，可以操作各种DNA，以便将DNA序列提供于在正确的方位中，以及如果适当，提供于在正确的阅读框架中。为此，可以使用连接物或连接体来连接DNA片段，或者可以应用其他操作来提供适当的限制位点、去除不必要的DNA、去除限制位点等。为此，可以包括体外突变、引物修复、限制、退火、重取代，如转换与颠换。

报道基因或可选择的标记基因也可以包括在本发明的表达盒中。本领域已知的适宜报道基因的实例可见于，例如，Jefferson，et al.，(1991)inPlant Molecular Biology Manual(植物分子生物学手册)，ed.Gelvin，et al.，(Kluwer Academic Publishers)，pp.1-33；DeWet，et al.，(1987)Mol.Cell.Biol.7：725-737；Goff，et al.，(1990)EMBO J.9：2517-2522；Kain，et al.，(1995)Bio Techniques 19：650-655以及Chiu，et al.，(1996)Current Biology6：325-330，在此通过引用将其全文并入。

用于选择转化的细胞或组织的可选择的标记基因可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。适宜的课选择的标记基因的实例包括但不限于，编码氯霉素(Herrera Estrella，et al.，(1983)EMBO J.2：987-992)抗性、甲氨蝶呤(Herrera Estrella，et al.，(1983)Nature 303：209-213；Meijer，et al.，(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820)抗性、潮霉素(Waldron，et al.，(1985)Plant Mol.Biol.5：103-108与Zhijian，et al.，(1995)Plant Science108：219-227)抗性、链霉素(Jones，et al.，(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91)抗性、壮观霉素(Bretagne-Sagnard，et al.，(1996)Transgenic Res.5：131-137)抗性、博来霉素(Hille，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.7：171-176)抗性、磺胺类药(Guerineau，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.15：127-36)抗性、溴苯睛(Stalker，et al.，(1988)Science 242：419-423)抗性、草甘膦(Shaw，et al.，(1986)Science 233：478-481；与美国专利申请序号10/004,357和10/427,692)抗性、膦丝菌素(DeBlock，et al.，(1987)EMBO J.6：2513-2518)抗性的基因，在此通过引用将其全文并入。

可在转基因事件的回复中提供效用的其他基因可包括但不限于：诸如GUS(β-葡醛酸糖苷酶；Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5：387)、GFP(绿色荧光蛋白；Chalfie，et al.，(1994)Science 263：802)、荧光素酶(Riggs，et al.，(1987)Nucleic Acids Res.15(19)：8115和Luehrsen，et al.，(1992)Methods Enzymol.216：397-414)的实例，以及编码花青素产物的玉米基因(Ludwig，et al.，(1990)Science 247：449)，在此通过引用将其全文并入。

包含可操作性连接于目的核苷酸序列的本发明的ADF4启动子的表达盒，可以用于转化任何植物。以此方式，可以获得遗传修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子、根等。

本文所用“载体”是指用于将核苷酸构建体如表达盒引入宿主细胞的DNA分子，例如质粒、粘粒、细菌噬菌体。克隆载体通常含有一个或少量的限制性核酸内切酶识别位点，在这些位点处可以以可检测的方式插入外源DNA序列以及标记基因而不丧失载体的基本生物学功能，该标记基因适宜用于鉴定与筛选用克隆载体转化的细胞。标记基因通常包括提供四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。

本发明的方法包括将多肽或多核苷酸引入到植物中。本文所用“引入”是指将多核苷酸或多肽以这样的方式呈现于植物，即使序列可以进入植物细胞的内部的方式。若非多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部，本发明的方法不依赖于将序列引入到植物中的特定方法。用于将多核苷酸或多肽引入到植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于，稳定转化的方法、瞬时转化的方法，以及病毒介导的方法。

“稳定转化”是引入到植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并能由其后代继承的转化。“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但未整合到植物的基因组中或多肽被引入到植物中。

转化实验方案以及将核苷酸序列引入植物中的实验方案，可以根据用于转化的植物或植物细胞的类型如单子叶植物或双子叶植物而改变。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的适宜方法，包括显微注射(Crossway，et al.，(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、土壤杆菌介导的转化(Townsend，et al.，美国专利5,563,055号和Zhao，et al.，美国专利5,981,840号)、直接基因转移(Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722)，以及弹道粒子加速(参见，例如，美国专利4,945,050号、5,879,918号、5,886,244号、5,932,782；Tomes，et al.，(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe，et al.，(1988)Biotechnology 6：923-926)；以及Lec1 transformation(WO 00/28058)。同样参见，Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford，et al.，(1987)ParticulateScience and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou，et al.，(1988)PlantPhysiol.87：671-674(大豆)；McCabe，et al.，(1988)Bio/Technology6：923-926(大豆)；Finer and McMullen，(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh，et al.，(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利5,240,855号、5,322,783号以及5,324,646号；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren，et al.，(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利5,736,369号(谷物)；Bytebier，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet，et al.，(1985)in The Experimental Manipulation of OvuleTissues，ed.Chapman，et al.，(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(胡须介导的转化)；D′Halluin，et al.，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant CellReports 12：250-255和Christou and Ford(1995)Annals of Botany75：407-413(水稻)；Osjoda，et al.，(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(通过根癌土壤杆菌转化的玉米)，在此通过引用将所有所述文献的全文并入。

在具体的实施方案中，可以使用各种瞬时转化方法将包含本发明启动子序列的DNA构建体提供给植物。此类瞬时转化方法包括但不限于，病毒载体系统和以阻止DNA随后释放的方式进行多核苷酸的沉淀。因此，可以从结合于微粒的DNA进行转录，但是DNA被释放从而整合于基因组的几率就极大地降低了。这类方法包括使用包被有多聚乙二胺亚胺(polyethylimine，PEI；Sigma #P3143)的微粒。

在其他实施方案中，本发明的多核苷酸可以通过使植物接触病毒或病毒性核酸而引入到植物中。通常，此类方法包括将本发明的核苷酸构建体并入到病毒的DNA或RNA分子中。将多核苷酸引入到植物中并表达其中编码的蛋白的方法，包括病毒的DNA或RNA分子，是本领域已知的。参见，例如，美国专利5,889,191号、5,889,190号、5,866,785号、5,589,367号、5,316,931以及Porta，et al.，(1996)Molecular Biotechnology5：209-221，在此通过引用将其全文并入。

用于将多核苷酸定向插入植物基因组中特异性位点的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，多核苷酸在期望的基因组位点的插入是使用位点特异性重组系统完成的。参见，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855以及WO99/25853，在此通过引用将所有上述国际申请的全文并入。简而言之，本发明的多核苷酸可以包含于侧翼为两个不同的重组位点的转移盒中。将转移盒引入到具有稳定地并入其因组的靶位点的植物中，该靶位点的侧翼为与转移盒位点相应的两个不同的重组位点。提供适当的重组酶并且将转移盒整合到靶位点上。目的多核苷酸从而被整合到植物基因组的特定的染色体位置上。

可使已转化的细胞依照传统方式生成为植物。参见，例如，McCormick，et al.，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84，在此通过引用将其全文并入。随后可以培育这些植物，并以相同的转化株或不同株对其授粉，以及鉴定由此产生的具有所期望表型特征表达的后代。可以培育两代或多代，以确保所期望表型特征的表达是稳定地维持和遗传的，并且随后收获种子，以确保已实现所期望表型特征的表达。以此方式，本发明提供了具有本发明核苷酸构建体的转化的种子(也称为“转基因种子”)，该核苷酸构建体例如，本发明的表达盒，稳定地并入其基因组中。

有多种方法可用于由植物组织再生植物。再生的具体方法依赖于起初的植物组织和待再生的具体的植物种类。由单个植物原生质体转化株或由各种转化的外植体而来的植物的再生、发育与培植是本领域已知的(Weissbach and Weissbach，(1988)In：Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物学的方法)，(Eds.)，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.，在此通过引用将其全文并入)。此再生与培育方法通常包括选择转化的细胞，由生根的幼苗阶段经胚胎发育的通常阶段来培养那些个体化的细胞等步骤。转基因胚胎与种子同样可以再生。由此产生的转基因的生根的芽随后被种植在适宜的植物生长介质中例如土壤。优选，该再生植物是自花授粉的从而产生纯合的转基因植物。另外，将来自再生植物的花粉与农业经济学重要生产线的由种子生长的植物进行杂交。相反，来自这些重要生产线的植物的花粉可用于对再生植物进行授粉。包含期望的多核苷酸的实施方案的转基因植物，可以使用本领域技术人员熟知的方法来种植。

这些具体方案提供了用于筛选可调节植物中表达的化合物的组合物。载体、细胞与植物可以用于筛选作为ADF4启动子的激动剂和拮抗剂的分子。例如，报道基因可以可操作性连接于ADF4启动子并在植物中作为转基因而表达。添加待检验的化合物并测量报道基因的表达来测定其对报道子活性的影响。

下列实施例用于说明而不用于限制。

实施例

具体方案将在以下实施例中进一步限定，除非另有规定，其中的部分与百分比均以重量计算并且度数为摄氏度。需要理解的是，这些实施例在表述本发明具体方案时，仅作为例证而给出。经过以上讨论与这些实施例，本领域技术人员可以确定这些具体方案的本质特征，且在不偏离其精神与范围的情况下，可以对它们进行各种变化与修改来适应各种应用与条件。因此，除了本文所示与所述的那些之外，根据前面的描述，这些具体方案的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。此类修改也是落入附加的权利要求书的范围之中。

本文所提出的每篇参考文献的公开，在此通过引用将其全文并入。

实施例1：ADF4基因的鉴定

使用Lynx大规模平行信号测序(Lynx Massively Parallel SignatureSequencing，MPSS^TM)(参见Brenner，et al.，(2000)Nature Biotechnology18：630-634，Brenner，et al.，(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97：1665-1670，在此通过引用将其全文并入)将肌动蛋白解聚因子4(ADF4)基因鉴定为再生组织优选基因。

MPSS技术包括由已经反向转录的mRNA样品产生17碱基信号标签。该标签同时进行测序并分配到基因或EST上。这些丰富的标签被赋予一定值，该值可以被标准化成每百万个部分(PPM)，因此与不同组织相比，允许标签表达或标签富集。因此，MPSS平台可以用于测定具体基因的表达模式及其在不同组织中的表达水平。

为了表征ADF4基因表达，我们在DuPont/Pioneer MPSS数据库中调查了250多个试验。此数据库包括来自一系列组织类型、处理、基因型与发育阶段的实验。通过所有这些实验，分析显示出对于再生组织的高度优选，如图1中所总结的。然后设计引物来分离ADF4启动子。

实施例2：ADF4启动子的分离

玉米植物B73是于2003年夏天在爱荷华州的约翰斯顿在田间生长的。来自B73的组织用于基因与启动子分离。玉米ADF4基因的启动子区是通过使用以下寡核苷酸引物扩增基因组DNA，由玉米基因组DNA分离：

5’-AAGCTTGAGTGTTGTCGTGTTGCTCG(SEQ ID NO：2)

5’-CCATGGCCTTGAGCTCCAGGAACC(SEQ ID NO：3)

使用Roche(Basel)的高保真PCR体系以及适当的10pmol每种引物在50uL总体积中进行PCR。

全长ADF4启动子公开于SEQ ID NO：1中。

实施例3：ADF4启动子及其片段的活性

为了证明作为ADF4启动子而分离的DNA序列可以发挥启动子的功能，进行了转基因玉米测定。这些测定提供了所检测的DNA序列是否能够指导基因表达的快速评估。

全长启动子(参见SEQ ID NO：1)由基因组DNA进行PCR扩增而来并被克隆作为带有B-葡糖苷酸酶(GUS)与红色荧光蛋白(RFP)的翻译融合物，并且被组合进双启动子盒中。通过土壤杆菌介导的转化将双启动子盒转化进玉米中，产生转基因植物。

对转基因玉米植物进行GUS与RFP表达的测定。通过在多个发育阶段切除植物组织，分析T0与T1转基因植物材料的ADF4启动子活性。通过将切除的植物组织浸入终体积为100ml的GUS染色缓冲液(根据Jefferson等改良，参见Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)或终体积为100ml的GUS着色缓冲液中来测定GUS的表达，所述100ml的GUS染色缓冲液含有1.36g NaH₂PO₄、1.74g Na₂HPO₄、164mgK₄Fe(CN)₆3H₂O、211mg K₃Fe(CN)₆、0.06ml Triton X-100以及50mgX-Gluc(钠盐)，所述100ml的GUS着色缓冲液含有1.36g NaH₂PO₄、1.74gNa₂HPO₄、16.4mg K₄Fe(CN)₆3H₂O、0.29g EDTA、0.2ml Triton X-100以及50mg X-Gluc(钠盐)(McCabe，参见McCabe and Martinell(1993)Bio/Technol.11：596-598)。植物于37℃在黑暗中培养过夜。以70％乙醇代替GUS染色液来终止试验。GUS活性可以显现并且进行照相。使用Nikon Eclipse E400显微镜和红色荧光蛋白过滤器来检测红色荧光蛋白。

全长启动子(SEQ ID NO：1)的分析

鉴定阳性T0事件，并且将含有全长ADF4启动子构建体的植物在GUS溶液中染色用于组织化学分析。也检测对照事件。与其他组织相比，该阳性事件在未成熟的穗中显示了极高的活性(图2-3)。

10个GUS阳性与RFP阳性事件进一步用于T1产生并且评估GUS与RFP表达模式。在以下日期对组织取样：1周(约V7-V8)、2周(约V11)、3周(约V14)、4周(抽穗)、5周(抽穗丝，未授粉)、6周(抽穗丝后约1个周；未授粉)、7周(授粉后约5-15天)、8周(授粉后约15-20天)。取样的事件显示出未成熟的穗优选表达模式(图4A-4H)。

此数据与期望的ADF4启动子的表达模式一致，并证实其再生组织优选表达模式。对照事件未显示任何显著的GUS染色。

实施例4：ADF4启动子中调节基序的鉴定

使用美国专利申请61/086,327中所述的专利软件，通过与来自高粱和水稻的直系同源基因的上游序列进行比较，鉴定ADF4启动子序列中的约6或8个碱基的调节基序。相对于ATG翻译起始位点，将ADF4启动子上游的1000个碱基对，与直系同源的水稻与高粱基因的上游序列的1000个碱基对进行比较(图5)。该比较通过执行来自多个直系同源种类的多重调节序列的成对比较来进行，在此，直系同源种类指玉米、水稻以及高粱。图3中所示的300个碱基对区域位于相对于翻译起始位点的位置-253至-553处。

表1-3中所鉴定的调节基序是由对来自玉米、高粱与水稻的ADF4启动子进行比较而鉴定的。图5表示下文所列出的基序的相应碱基。

表1

1    TGGGCC

2    GTAGTAG

3    TCCCAC

4    TAGTAGT

5    ACATGAC

6    GAGAGAG

表2：与TGGGCC匹配的启动子元件

  启动子元件  名称  功能  CGAGGTGGGCCCGTAGGTGGGCCCGTAT  PCF，  分生组织的组织特异性元件  GTGGGCCCG  GCBP2ZMGAPC4  玉米(Z.m.)GapC4(甘油醛-3-磷酸脱氢  酶4)基因启动子中发现的烟草细胞核  因子(GCBP-2)的结合位点；位于-293  和-285之间；参见S000350；  TGGGCCCGT  SITEIIAOSPCNA  水稻(O.s.)PCNA(增殖性细胞核抗原)  基因的位点IIa；发现位于-197至-188；  两个细胞核蛋白PCF1和PCF2  (Kosugi and Ohashi，1997)的结合位点；  被认为与分生组织的组织特异性表达  相关；类似于植物生长激素调节基因  的启动子区中发现的保守基序  (T/GGTCCCAT)；参见S000026  (AUXREPSIAA4)；  ATAATGGGCCACACTGTGGGGCAT  SE1PVGRP18  豆(P.v.)的grp1.8基因启动子中发现  的SE1(茎干元件1)；位于b-121和-94  之间；极大地但非特异性地增强表达；  参见S000289，S000101(SE2)；

表3：与TCCCAC匹配的启动子元件

  启动子元件  名称  功能  CTCCCAC  BOXCPSAS1  豌豆(P.s.)天冬酰胺合成酶(AS1)基因中的  Box C；发现位于-45；AS1受光负调  节；.@Box C结合于细胞核蛋白，该细胞核  蛋白被推断的阻抑物元件RE1竞争(参见  S000195)；  TGGTCCCAC  SITEIIBOSPCNA  水稻PCNA(增殖性细胞核抗原)基因的位点  Iib；发现位于-178至-169；两个细胞核蛋白  PCF1和PCF2(Kosugi and Ohashi，1997)的  结合位点；被认为与分生组织的组织特异性  表达相关；类似于植物生长激素调节基因的  启动子区中发现的保守基序  (T/GGTCCCAT)；参见S000026  (AUXREPSIAA4)；  ATCCCACCTAC  L-box  光应答元件部分  GATCCCACATACACATACACG  napA，  种子贮存蛋白，napA

序列表

<110>先锋高级育种国际公司

 

<120>指导玉米胚珠和授粉籽粒的母体和支持组织中转基因表达的植物调节区

 

<130>2344-PCT+

 

<150>60/963,878

<151>2007-08-07

 

<160>4

 

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

 

<210>1

<211>1390

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

 

<220>

<221>启动子

<222>(7)...(1026)

<223>玉米ADF4基因的上游调节区

 

<221>5’UTR

<222>(1027)...(1147)

<223>玉米ADF4基因的未反应的前导区

 

<221>内含子

<222>(1151)...(1319)

<223>玉米ADF4的第一内含子；来自基因组B73

 

<221>CDS

<222>(1338)...(1385)

<223>由基因组B73扩增的玉米ADF4的编码序列

 

<400>1

aagcttgagt gttgtcgtgt tgctcgattg ctaacaccct ccctcctcga acagcgcccg 60

acatctctta aggtagtgtt tggttctgga gttaggtggg gtggagccgt tccattctac 120

tttttgtgtt gttgagttgt attccggttg aagcagagtg gctcaaattc tagaatatac 180

ccttgagatg cggcatcccg tggctcctca aaattaatcg gatttggctg ctcgtgagcc 240

gagcctccca ttcccatccc atctcttccc tgatgctcga cataagctca cccaagtttg 300

tttcaatttt cttctataga taaattactt ggggcagttt agaatttgca cgttgtttat 360

gtgagactac gtctattagc tatttcttaa ttataaaact caatgcctac tgatatgtat 420

gatataagta tgtttttatt gatcattgag ttaacatatg agaaacgaaa aaaaatatac 480

tctattttgt atttatcaac caaatattag atgaagtcat tgtaaaatta aattatcaaa 540

catagaacag agtgactttg ttatcaaaat ctataatgga gccatttcat ctaaatgagc 600

accagaaccg aacactgctc agagttccaa gacaaggtgt cccggcccaa tgagtcgcct 660

gcaactgtaa tcgagtggtt gggcttgggc ccgagggcct atcggccatt catcatcacc 720

gtctctcttt gcctgggccg ctccaatgtg acatgacctg atgtgacgcg acgtgatacg 780

atcccaccgc gcggcgcgga gcacacgggt ggctagtagt gtagtagggc cggcagggca 840

tcttttctgt gggcctgtgg ctggtgcagg gagagagatg aggtaccggc gctgagtcgc 900

tgacgggtgg ggcccgggtc ggtgccgaag gagggggtgg ggtggtggcg cgtccatccc 960

acgcgactct cccacacaaa taccatcacc ttcgctacca ttgcttcacc atcaccacca 1020

ccccgcggct gcagctcagc agctccagac ctcaccagag gcacctacca caccgcccgc 1080

cgccgatccc gtcacccgtc tcctccccgc tgcggagcgt ctccagccct gcccggtgcc 1140

cgcccagatg gtaagcacgc ggcaccacac ttcacctcca gtcctgttca tcggctatgc 1200

gatctgcatt ttcgtttgct cgatcgacgg atctgccatg ctcttcttct tcacctccct 1260

cgtcttcgtc tccactgcct ctgaatcttg tttcgcctcc tctcccccgg gttctgcagg 1320

caaacgcggc gtcagggatg gccgtggacg acgactgcaa gcgccggttc ctggagctca 1380

aggccatgga                                                        1390

 

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>2

aagcttgagt gttgtcgtgt tgctcg                                      26

 

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>3

ccatggcctt gagctccagg aacc                                        24

 

<210>4

<211>300

<212>DNA

<213>玉米

 

<400>4

atgagcacca gaaccgaaca ctgctcagag ttccaagaca aggtgtcccg gcccaatgag 60

tcgcctgcaa ctgtaatcga gtggttgggc ttgggcccga gggcctatcg gccattcatc 120

atcaccgtct ctctttgcct gggccgctcc aatgtgacat gacctgatgt gacgcgacgt 180

gatacgatcc caccgcgcgg cgcggagcac acgggtggct agtagtgtag tagggccggc 240

agggcatctt ttctgtgggc ctgtggctgg tgcagggaga gagatgaggt accggcgctg 300