一种检测水产品中诺如病毒的实时荧光PCR方法

摘要

本发明公开一种检测水产品中诺如病毒的实时荧光PCR方法，包括如下步骤：1)设计合成用于检测水产品诺如病毒的2组引物及探针；2)水产品中诺如病毒的富集与回收；3)水产品中诺如病毒RNA的提取；4)实时荧光PCR检测。本发明利用实时荧光PCR技术检测水产品中诺如病毒的方法具有灵敏度高、检测时间短和可定量分析的特点，可用于水产品中诺如病毒的定性筛查和定量分析，及用于开发诺如病毒的实时荧光PCR检测试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水产品中诺如病毒的实时荧光PCR方法。

背景技术

诺如病毒(Noroviruses，NoV)又称诺瓦克样病毒(Norwalk-likevirus，N L V s)，属于杯状病毒科，是引起病毒性胃肠炎暴发的重要病原之一。为单股正链小RNA病毒，无包膜，具有20面体结构，直径27-40nm。基因组长约为7.5kb，由3个开放读码框架(openreading frame，ORF)组成。诺如病毒感染性腹泻具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，对公共卫生有着重要影响。近年来欧美、澳大利亚、中国等国家相继发生NoV感染性腹泻暴发疫情。生吃贝类或加热未熟透的水产品食物，是导致诺如病毒胃肠炎暴发流行的最常见原因之一(Costantini V et al. Human and animal entericcaliciviruses in oysters from different coastal regions of theUnited States.Appl Environ Microbiol，2006，72(3)：1800-1809.)。其中，水产品中牡蛎是NoV传播的重要载体，是引起胃肠炎暴发的最常见的食源。如美国20世纪90年代，因消费牡蛎而引起的胃肠炎中，至少52％的病原为NoV。【柳淑芳，等.牡蛎中诺如病毒的分子流行病学研究进展。海洋科学，2008，32(8)：82-86.】

研究表明，根据诺如病毒聚合酶和衣壳蛋白编码区核苷酸和氨基酸序列特征，可细分为5个遗传组(I--V)，其中GG II是全球多数国家急性肠胃炎最主要的病原之一，我国诺如病毒的感染基本上是遗传组II型，遗传组I型少见【李灵辉，等.广东省2005年诺瓦克样病毒感染暴发疫情.华南预防医学，2006，32(5)：11--14.】。我国已报道多个地区(如北京、长沙、广东省、兰州、济南、江门、东莞市、广西、佛山市南海区等)采用流行病学现场调查和统计分析方法进行调查了解诺如病毒引起的感染性腹泻暴发疫情的流行病学特点及传播途径【郭丽，等.诺如病毒分子生物学研究进展.传染病信息，2009，22(3)：174-178.】

诺如病毒感染具有起病急、传播快、消失早的特性，一旦出现暴发疫情，需要在短时间内准确分析大量的样品。国内则缺乏对此的系统监测和研究，一旦发生食物等来源的感染暴发，缺少有效的现场检测技术和方法【徐友富，等.诺如病毒感染国内外研究概况.中国卫生检验杂志，2008，18(5)：949-951.】。因此，迫切需要发展有效的诺如病毒的快速检测方法，并制定相关检测标准。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种检测水产品中诺如病毒的实时荧光PCR方法，本发明利用实时荧光PCR技术检测水产品中诺如病毒的方法具有灵敏度高、检测时间短和可定量分析的特点，可用于水产品中诺如病毒的定性筛查和定量分析。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种检测水产品中诺如病毒的实时荧光PCR方法，包括如下步骤：

1)设计合成用于检测水产品诺如病毒的2组引物及探针；

2)水产品中诺如病毒的富集与回收；

3)水产品中诺如病毒RNA的提取；

4)实时荧光PCR检测；

所述的2组引物为诺如病毒I型和诺如病毒II型，其中诺如病毒I型的上游引物为：5’-CGYTGGATGCGNTYCCATGA-3’；诺如病毒I型的下游引物为：5’-CATTTACTACTACCGCAGATTCC-3’；诺如病毒II型的上游引物为：5’-ATGTTYAGRTGGATGAGRTTCTC-3’诺如病毒II型的下游引物为：5’-ACACTTACTTCTACCGCAGCT-3’；且诺如病毒I型的探针为：5’-FAM-TGTGGACAGGAGATCGC-TAMRA 3’；诺如病毒II型的探针为：5’-FAM-AGGGCGATCGCAATCT-TAMRA 3’。

所述的诺如病毒的富集步骤为：取5-6份水产品样品，洗净外表，解剖取下内脏组织和腮5g，用剪刀仔细切碎，加入35mL甘氨酸缓冲液，高速匀浆机高速匀浆3min，将匀浆液装入50mL离心管，37℃下水浴振荡30min，4℃，10,000×g条件下冷冻离心30min。取上清，弃沉淀。

所述的甘氨酸缓冲液为0.1mol/L甘氨酸，0.3mol/L NaCl，pH9.5。

所述的诺如病毒的回收步骤为：移取上清至一50mL新管，加入等体积的PEG 8000溶液，颠倒5次混匀；冰上放置至少1h后，4℃，10,000×g离心5min，弃去上清，保留沉淀，加入2mL的生理盐水，剧烈震荡，重悬病毒，5,000×g离心1min，取上清液140μL用于RNA提取。

所述的水产品中诺如病毒RNA的提取试剂采用德国QIAGEN公司生产的QIAamp Viral RNA Mini Kit病毒RNA提取试剂盒。

所述的实时荧光PCR检测中扩增反应条件为：45℃逆转录20-40min，94℃预变性5-15min；93-95℃×15-35sec，50-60℃×30-60sec，循环35-45次；检测设立阳性对照、阴性对照和空白对照；荧光通道检测选择FAM通道；反应结束后，利用荧光PCR仪器的分析软件，依据扩增动力学曲线和Ct值进行分析测定。

本发明的有益效果为：本发明利用实时荧光PCR技术检测水产品中诺如病毒的方法具有灵敏度高、检测时间短和可定量分析的特点，可用于水产品中诺如病毒的定性筛查和定量分析，及用于开发诺如病毒的实时荧光PCR检测试剂盒。

附图说明

图1为本发明实施例中利用TaqMan探针法实时荧光PCR扩增牡蛎RNA的动力学曲线；

图2为本发明实施例中利用TaqMan探针法实时荧光PCR扩增10倍梯度稀释牡蛎RNA的标准曲线；

图3为本发明实施例中花蛤样品SYBR Green实时荧光PCR检测的动力学曲线；

图4为本发明实施例中花蛤样品SYBR Green实时荧光PCR检测的熔解曲线；

图5为本发明实施例中对虾样品TaqMan探针法实时荧光PCR检测的动力学曲线。

具体实施方式

实施例1

本实施例水产品为牡蛎样品，步骤为：

1、设计合成用于检测水产品诺如病毒的2组引物及探针

所述的引物为诺如病毒I型和II型，其中诺如病毒I型的上游引物为：5’-CGYTGGATGCGNTYCCATGA-3’；诺如病毒I型的下游引物为：5’-CATTTACTACTACCGCAGATTCC-3’；诺如病毒II型的上游引物为：5’-ATGTTYAGRTGGATGAGRTTCTC-3’诺如病毒II型的下游引物为：5’-ACACTTACTTCTACCGCAGCT-3’；且诺如病毒I型的探针为：5’-FAM-TGTGGACAGGAGATCGC-TAMRA 3’；诺如病毒II型的探针为：5’-FAM-AGGGCGATCGCAATCT-T AMRA 3’。

2、牡蛎样品中的诺如病毒的富集与回收

病毒的富集：取5-6份水产品样品，洗净外表，解剖取下内脏组织(和腮)约5g，用剪刀仔细切碎，加入35mL甘氨酸缓冲液(0.1mol/L甘氨酸，0.3mol/L NaCl，pH 9.5)，高速匀浆机高速匀浆3min，将匀浆液装入50mL离心管，37℃下水浴振荡30min，4℃，10,000×g条件下冷冻离心30min。取上清。

病毒的回收：移取上清至一50mL新管，加入等体积的PEG 8000溶液，颠倒5次混匀；冰上放置至少1h后，4℃，10,000×g离心5min，弃去上清，保留沉淀，加入2mL的生理盐水，剧烈震荡，重悬病毒，5,000×g离心1min，取上清液140μL用于RNA提取。

3、牡蛎样品中诺如病毒RNA的提取

提取病毒RNA流程(使用德国QIAGEN公司生产的Q1Aamp ViralRNA Mini Kit)：

1)移取560μL缓冲液AVL-Carrier RNA(该试剂为德国QIAGEN公司生产的QIAamp Viral RNA Mini Kit中的产品)至1.5mL离心管中；

2)移入140μL样液，漩涡混匀，15s；室温孵育10min；

3)稍离心，移入560μL无水乙醇，涡旋混匀，15s，稍离心；

4)移取上一步骤处理后溶液630μL至套有2mL收集管的分离柱上，6000g，离心1min；更换新收集管，遗弃旧收集管；重复一次；

5)移入500μL缓冲液AW1(该试剂为德国QIAGEN公司生产的QIAamp Viral RNA Mini Kit中的产品)，6000g，离心1min，更换新收集管；

6)移入500μL缓冲液AW2，(该试剂为德国QIAGEN公司生产的QIAamp Viral RNA Mini Kit中的产品)，20000g离心3min，更换新收集管；

7)20000g离心1min，更换新收集管；

8)移入40μL无RNA酶超纯水，室温孵育1min，6000g离心1min；-20℃或-80℃保存。

4、牡蛎样品实时荧光PCR检测

按照病毒RNA提取试剂盒说明操作配制荧光PCR扩增反应体系，体系包括PCR缓冲液、MgCl₂、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、诺如病毒I型的上、下游引物、诺如病毒II型的上、下游引物、OligodT、RNA模板、无RNA酶超纯水、诺如病毒I、II型的探针。使用ABI7500型荧光定量PCR仪进行检测。扩增反应条件为：45℃逆转录20-40min，94℃预变性5-15min；93-95℃×15-35sec，50-60℃×30-60sec，循环35-45次。检测设立阳性对照、阴性对照和空白对照；荧光通道检测选择：检测选择FAM通道。反应结束后，利用荧光PCR仪器的分析软件，依据扩增动力学曲线和Ct值进行分析。如图1和图2所示，图1中，TaqMan探针法荧光定量PCR扩增牡蛎样品诺如病毒RNA的动力学曲线，2、4、5为牡蛎样品，1为诺如病毒II型阳性对照、3为诺如病毒I型阳性对照，6为阴性对照。图2为利用TaqMan探针法实时荧光PCR扩增10倍梯度稀释牡蛎RNA的标准曲线。

实施例2

本实施例水产品为花蛤样品，步骤为：

1、设计合成用于检测水产品诺如病毒的1组II型引物及探针

所述的引物为诺如病毒II型，其中诺如病毒II型的上游引物为：5’-ATGTTYAGRTGGATGAGRTTCTC-3’诺如病毒II型的下游引物为：5’-ACACTTACTTCTACCGCAGCT-3’；诺如病毒II型的探针为：5’-FAM-AGGGCGATCGCAATCT-TAMRA 3’。

2、花蛤样品中的诺如病毒的富集与回收

病毒的富集：取5-6份水产品样品，洗净外表，解剖取下内脏组织(和腮)约5g，用剪刀仔细切碎，加入35mL甘氨酸缓冲液(0.1mol/L甘氨酸，0.3mol/L NaCl，pH 9.5)，高速匀浆机高速匀浆3min，将匀浆液装入50mL离心管，37℃下水浴振荡30min，4℃，10,000×g条件下冷冻离心30min。取上清。

病毒的回收：移取上清至一50mL新管，加入等体积的PEG 8000溶液，颠倒5次混匀；冰上放置至少1h后，4℃，10,000×g离心5min，弃去上清，保留沉淀，加入2mL的生理盐水，剧烈震荡，重悬病毒，5,000×g离心1min，取上清液140μL用于RNA提取。

3、花蛤样品中诺如病毒RNA的提取

提取病毒RNA流程(使用德国QIAGEN公司生产的QIAamp ViralRNA Mini Kit)：

1)移取560μL缓冲液AVL-Carrier RNA至1.5mL离心管中；

2)移入140μL样液，漩涡混匀，15s；室温孵育10min；

3)稍离心，移入560μL无水乙醇，涡旋混匀，15s，稍离心；

4)移取上一步骤处理后溶液630μL至套有2mL收集管的分离柱上，6000g，离心1min；更换新收集管，遗弃旧收集管；重复一次；

5)移入500μL缓冲液AW1，6000g，离心1min，更换新收集管；

6)移入500μL缓冲液AW2，20000g离心3min，更换新收集管；

7)20000g离心1min，更换新收集管；

8)移入40μL无RNA酶超纯水，室温孵育1min，6000g离心1min；-20℃或-80℃保存。

4、采用两步法，即逆转录和实时荧光PCR检测。逆转录反应体系：

MgCl₂，25mM                     4μL

反转录10×缓冲液                2μL

dNTP混合物，10mM                2μL

反转录酶                     0.65μL

随机引物                        1μL

RNA                           2.5μL

无核酸酶水                   7.85μL

总体系                         20μl

以上物质为美国Promega公司生产的Reverse TranscriptionSystem逆转录试剂。

将反应体系于室温孵育10-15分钟，然后于42-45℃温育10-15分钟；将样品于90-95℃加热5分钟，然后于4℃放置5分钟，-20℃或-80℃保存。

实时荧光定量PCR体系：

Taq Master Mix(德国QIAGEN公司)        12.5μL

上游引物(5μmol/mL)                   2μL

下游引物(5μmol/mL)                        2μL

SYBR Green I(5-10×)(美国Inv itrogen公司)  2μL

模板(cDNA)                                 2μL

无核酸酶水                               4.5μL

总体系                                    25μL

按照病毒RNA提取试剂盒说明操作配制荧光PCR扩增反应体系，体系包括PCR缓冲液、MgCl₂、DNA聚合酶、诺如病毒II型的上游引物、诺如病毒II型的下游引物、模板、SYBR Green I、无RNA酶超纯水。使用ABI 7500型荧光定量PCR仪进行检测。扩增反应条件为：94℃预变性5-15min；93-95℃×15-35sec，50-60℃×30-60sec，循环35-45次。融解曲线：95℃15-30sec，50-60℃×30-60sec，95℃15-30sec，升温速度为0.1℃/sec。检测设立阳性对照、阴性对照和空白对照；收集SYBR荧光信号。反应结束后，利用荧光PCR仪器的分析软件，依据扩增动力学曲线和Ct值进行分析。如图3和图4所示，图3为花蛤样品SYBR Green实时荧光PCR检测的动力学曲线，图4为花蛤样品SYBR Green实时荧光PCR检测的熔解曲线。结果显示扩增动力学曲线呈典型的S型，扩增产物的熔解曲线图谱显示其Tm值为84℃，且只有一个特异峰，表明无引物二聚体和非特异性扩增。

实施例3

本实施例水产品为虾样品，步骤为：

1、设计合成用于检测水产品诺如病毒的1组I型引物及探针

所述的引物为诺如病毒I型，其中诺如病毒I型的上游引物为：5’-CGYTGGATGCGNTYCCATGA-3’；诺如病毒I型的下游引物为：5’-CATTTACTACTACCGCAGATTCC-3’；且诺如病毒I型的探针为：5’-FAM-TGTGGACAGGAGATCGC-TAMRA 3’。

2、虾样品中的诺如病毒的富集与回收

病毒的富集：取5-6份虾样品，洗净外表，解剖取下内脏组织约5g，用剪刀仔细切碎，加入35mL甘氨酸缓冲液，高速匀浆机高速匀浆3min，将匀浆液装入50mL离心管，37℃下水浴振荡30min，4℃，10,000×g条件下冷冻离心30min。取上清。

病毒的回收：上清加入等体积的PEG 8000溶液，颠倒5次混匀；冰上放置至少1h后，4℃，10,000×g离心5min，弃去上清，保留沉淀，加入2mL的生理盐水，剧烈震荡，重悬病毒，5,000×g离心1min，取上清液140μL用于RNA提取。

3、虾样品中诺如病毒RNA的提取

提取病毒RNA流程(使用德国QIAGEN公司生产的QIAamp ViralRNA Mini Kit)：

1)移取560μL缓冲液AVL-Carrier RNA至1.5mL离心管中；

2)移入140μL样液，漩涡混匀，15s；室温孵育10min；

3)稍离心，移入560μL无水乙醇，涡旋混匀，15s，稍离心；

4)移取上一步骤处理后溶液630μL至套有2mL收集管的分离柱上，6000g，离心1min；更换新收集管，遗弃旧收集管；重复一次；

5)移入500μL缓冲液AW1，6000g，离心1min，更换新收集管；

6)移入500μL缓冲液AW2，20000g离心3min，更换新收集管；

7)20000g离心1min，更换新收集管；

8)移入40μL无RNA酶超纯水，室温孵育1min，6000g离心1min；-20℃或-80℃保存。

4、虾样品实时荧光PCR检测

按照病毒RNA提取试剂盒说明操作配制荧光PCR扩增反应体系，体系包括PCR缓冲液、MgCl₂、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、诺如病毒I型的上游引物、诺如病毒I型的下游引物、Oligo dT、RNA模板、无RNA酶超纯水、诺如病毒I型的探针。使用ABI7500型荧光定量PCR仪进行检测。扩增反应条件为：45℃逆转录20-40min，94℃预变性5-15min；93-95℃×15-35sec，50-60℃×30-60sec，循环35-45次。检测设立阳性对照、阴性对照和空白对照；荧光通道检测选择：检测选择FAM通道。反应结束后，利用荧光PCR仪器的分析软件，依据扩增动力学曲线和Ct值进行分析。如图5所示，阳性样品呈典型的S型，阴性对照Ct＝Undet。