与层粘连蛋白结合的神经生长因子及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种与层粘连蛋白结合的神经生长因子及其编码基因与应用。本发明提供的与层粘连蛋白结合的神经生长因子，它自氨基末端至羧基末端依次包括层粘连蛋白结合区和神经生长因子β亚基片段；所述层粘连蛋白结合区的GenBankAccession Number为NM205527；所述神经生长因子β亚基片段为神经生长因子β亚基(GenBank Accession Number：AAA59931)自氨基末端第122-239位氨基酸残基。本发明实现了在保持神经生长因子活性的同时，大大减少其用量，减少用量过大造成的风险，其方法可同时适用于所有促进神经损伤修复的因子以及富含层粘连蛋白的组织修复，具有重大意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种与层粘连蛋白结合的神经生长因子及其编码基因与应用。

背景技术

神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)分子量为140kDa左右，由α、β、γ3种亚基借非共价键构成，其组合比例为α₂βγ₂(Greene and Shooter，1980)。其中β亚基是由两条相同的单链以非共价健连接而成的同源二聚体，其单链含有118个氨基酸残基。β亚基的三维空间结构单元是由三对反向平行的β折叠构成的一种立体构型，含有四个环区。环区具有识别不同受体的特征，是NGF与受体结合产生信号转导的关键区域(Greene LA，Shooter EM(1980)The nerve growth factor：biochemistry，synthesis，and mechanism of action.Annu Rev Neurosci3：353-402.)。它是唯一具有NGF生物活性的片段，可以完全表现NGF的功能效应(BaxB，Blundell TL，Murray-Rust J，McDonald NQ(1997)Structure of mouse 7S NGF：a complex of nerve growth factor with four binding proteins.Structure5：1275-1285.)。在生理情况下NGF可以调控交感和感觉神经元的生长发育及分化。周围神经损伤后，NGF可保护神经元并促进轴突再生。因此NGF对于神经系统疾病的治疗起着重要的作用(Sofroniew MV，Howe CL，Mobley WC(2001)Nerve growth factor signaling，neuroprotection，and neural repair.Annu Rev Neurosci24：1217-1281.)。

临床应用证实，局部用药可以使神经直接得到营养，利于神经的轴浆流动，促使神经再生。目前NGF治疗神经损伤的用药方式主要有：①在损伤局部直接给药；②局部通过微渗透泵缓慢释放；③通过转基因技术将表达NGF的细胞移植到损伤局部。然而在实际应用中，由于体液的快速扩散作用，一次性在损伤局部直接给药无法使NGF长时间保留在神经损伤部位，并保持有效的生物浓度，这造成了治疗的低效率。因此需要间隔性的多次给药，这种方式需要的药物量很大，治疗费用非常昂贵，而且由于过量的使用NGF，会引起炎症反应，带来副作用。微渗透泵存在有排斥反应和体内吸收问题；基因治疗的载体选择和安全性问题较难解决，这些方法都难以在临床推广应用。

层粘连蛋白是神经元细胞外基质的主要成分之一，它与其他细胞外基质共同构成了神经元生长的空间支架(Yurchenco PD，Smirnov S，Mathus T(2002)Analysis of basement membrane self-assembly and cellular interactions with native and recombinant glycoproteins.Methods Cell Biol 69：111-144.)。当周围神经受到损伤时，损伤部位的施旺细胞会大量分泌层粘连蛋白(Fu SY，Gordon T(1997)The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.Mol Neurobiol14：67-116.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种与层粘连蛋白结合的神经生长因子及其编码基因与应用。

本发明提供的与层粘连蛋白结合的神经生长因子(LBD-NGF)，它自氨基末端至羧基末端依次包括层粘连蛋白结合区和神经生长因子β亚基片段；

所述层粘连蛋白结合区(LBD)如序列表的1所示。

所述与神经生长因子β亚基片段为神经生长因子β亚基(GenBank Accession Number：AAA59931)自氨基末端第122-239位氨基酸残基；

LBD是一个基本核心，在其前后加十个左右的氨基酸都不会影响其功能。即XXXXXXXXXX“LBD”YYYYYYYYYY，其中X和Y为任意氨基酸残基。

所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子中还可包括组氨酸标签序列；所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子自氨基末端至羧基末端依次包括：所述组氨酸标签序列、所述层粘连蛋白结合区和所述神经生长因子β亚基片段。

所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子具体可为如下(a)或(b)或(c)的蛋白质：

(a)由序列表中序列3自氨基末端第22至287位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)将(a)或(b)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与神经损伤修复相关的由其衍生的蛋白质。

为了使(a)或(b)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

  标签  残基  序列  Poly-Arg  5-6(通常为5个)  RRRRR  Poly-His  2-10(通常为6个)  HHHHHH  FLAG  8  DYKDDDDK  Strep-tag II  8  WSHPQFEK  c-myc  10  EQKLISEEDL

所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述蛋白的编码基因自上游至下游依次包括层粘连蛋白结合区(LBD)的编码基因和神经生长因子β亚基片段的编码基因；所述层粘连蛋白结合区(LBD)的编码基因如序列表的序列2所示。

所述蛋白的编码基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列4自5′末端第64至861位核苷酸所示的DNA分子；

2)其编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体作为出发载体构建重组表达载体，如pET28a。

使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

所述重组表达载体可为将含有序列表的序列1自5′末端第64至861位核苷酸的DNA片段导入pET28a得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将含有序列表的序列1自5′末端第64至861位核苷酸的DNA片段导入pET28a骨架的NdeI和XhoI酶切位点间得到的重组质粒。

所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子、所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子的编码基因、所述重组表达载体均可应用于制备神经损伤修复药物。

本发明还保护一种神经损伤修复药物，它的活性成分为所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子、所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子的编码基因、所述重组表达载体中的至少一种。

所述神经损伤可为周围神经损伤，具体可为坐骨神经损伤。

本发明基于神经组织与层粘连蛋白的紧密联系，促使从改造NGF的角度考虑，通过在成熟的NGF-β分子N端融合一段层粘连蛋白结合区(laminin binding domain，LBD)，以加强因子与层粘连蛋白的结合，在两者之间建立一种较强的物理化学力，从而使NGF-β锚定在受损神经的细胞外基质上，这样不仅可使NGF-β在神经元周围形成较高的浓度，达到更经济效果，也可以避免自由扩散造成的对组织的不良影响。

本发明从行为学、电生理学、组织化学和透射电镜等角度检测了LBD-NGF对于神经损伤修复的作用效果，结果表明，LBD-NGF对周围神经损伤，特别是坐骨神经的损伤有着很好的修复效果。

附图说明

图1为实施例1中LBD-NGF重组蛋白的SDS-PAGE检测结果。

图2为实施例2中轴突诱导试验的结果。

图3为实施例2中MTT实验的结果。

图4为实施例3中层粘连蛋白结合实验的结果。

图5为实施例3中重组蛋白对层粘连蛋白的解离常数Kd。

图6为实施例4中轴突诱导试验的结果。

图7为实施例4中MTT实验的结果。

图8为实施例5中大鼠坐骨神经损伤修复SFI检测结果。

图9为实施例5中神经冲动传导速度的测定结果。

图10为实施例5中远端复合肌肉动作电位测定的测定结果。

图11为实施例5中大鼠神经的染色后图片。

图12为实施例5中大鼠坐骨神经抗神经丝蛋白免疫染色统计结果。

图13为实施例5中大鼠坐骨神经抗S100免疫染色统计结果。

图14为实施例5中大鼠坐骨神经的半薄切片的甲苯胺蓝染色图片。

图15为实施例5中大鼠坐骨神经髓鞘数目的统计结果。

图16为实施例5中大鼠坐骨神经髓鞘直径大小的统计结果。

图17为实施例5中大鼠坐骨神经超薄切片的透射电镜图片。

图18为实施例5中大鼠坐骨神经髓鞘厚度的统计结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、LBD-NGF蛋白编码基因的克隆及其表达与纯化

一、引物设计

应用软件Primer premier 5.05辅助设计八个正向引物(NtA-U1、NtA-U2、NtA-U3、NtA-U4、NtA-U5、NtA-U6、NGF-U1，NGF-U2)和七个反向引物(NtA-D1，NtA-D2，NtA-D3，NtA-D4，NtA-D5，NtA-D6，NGF-D)。

NtA-U1至NtA-U6、NtA-D1至NtA-D6用于扩增层粘连蛋白结合区(LBD)，且在LBD的上游引入NdeI酶切位点、下游引入HindIII酶切位点。

NGF-U1与NGF-D用于扩增NGF-β基因，在基因上游引入酶切位点NdeI、下游引入终止密码子和酶切位点Xho I；NGF-U2与NGF-D用于扩增NGF-β基因，在基因上游引入酶切位点HindIII、下游引入终止密码子和酶切位点Xho I。

引物序列见表1。

表1引物序列

二、LBD-NGF蛋白编码基因的克隆

1、重组质粒pET-LBD的制备

利用重叠PCR(overlapping PCR)扩增层粘连蛋白结合区(LBD)的DNA序列。

50μl反应体系：两个引物各1pmol/μl、dNTPs 200μmol/μl、Taq酶1μl。

反应条件：94℃预变性5min；然后94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，循环30次；72℃充分延伸10min。

首先将NtA-U1和NtA-D1这对引物PCR扩增，然后将产物作为模板，以NtA-U2和NtA-D2为引物PCR扩增。以此类推，最终得到LBD的完整DNA序列。

反应结束后，将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化扩增条带。扩增条带经NdeI和HindIII双酶切后连接入同样双酶切的原核表达载体pET28a(Novagen公司)上。将得到的重组质粒进行测序，结果表明，重组质粒中含有目标DNA，将该重组质粒命名为pET-LBD。

2、重组质粒pET-NAT-NGF的制备

以人NGF-β的全长cDNA(由人血细胞基因组DNA中PCR扩增获得)(GenBankAccession Number：AAA59931)为模板，应用NGF-U1和NGF-D组成的引物对进行PCR扩增，以获取NGF-β基因片段。50μl反应体系：两个引物各1pmol/μl、dNTPs200μmol/μl、Taq酶1μl。反应条件：94℃预变性5min；然后94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃充分延伸10min。

反应结束后，将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，得到一条350bp左右的条带。将该条带回收纯化，经NdeI/XhoI双酶切后，连接入同样双酶切的pET28a。将得到的重组质粒的多克隆位点区进行测序。结果表明：在pET28a的组氨酸标签后插入了NGF-β基因片段。将该重组质粒命名为pET-NAT-NGF。

3、重组质粒pET-LBD-NGF的制备

以人NGF-β的全长cDNA(由人血细胞基因组DNA中PCR扩增获得)为模板，应用NGF-U2和NGF-D组成的引物对进行PCR扩增，以获取NGF-β基因。50μl反应体系：两个引物各1pmol/μl、dNTPs 200μmol/μl、Taq酶1μl。反应条件：94℃预变性5min；然后94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃充分延伸10min。

反应结束后，将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，得到一条350bp左右的条带。将该条带回收纯化，经HindIII/XhoI双酶切后，连接入同样双酶切的pET-LBD上。将得到的重组质粒的多克隆位点区进行测序。结果表明：在pET28a的组氨酸标签后依次插入了层粘连蛋白结合区(LBD)片段(序列表的序列4自5′末端第64至501位核苷酸，编码序列如序列表的序列3自氨基末端第22至167位氨基酸所示)和NGF-β片段(序列表的序列4自5′末端第508至861位核苷酸，编码序列如序列表的序列3自氨基末端第170至287位氨基酸所示)。将该重组质粒命名为pET-LBD-NGF。

三、重组蛋白的制备和纯化

1、LBD-NGF的制备和纯化

将重组质粒pET-LBD-NGF转化于大肠杆菌BL21(DE3)(购于ATCC公司)，单克隆转接LB培养基37℃过夜培养，次日以2％转接100ml LB培养基，37℃培养3小时，OD₆₀₀达到0.8，加入IPTG(终浓度达到1mM)，继续培养4小时，离心收集菌体，PBS洗涤后再次离心收集菌体，用10ml PBS重悬菌体，超声破碎菌体，得到重组蛋白(LBD-NGF)粗提液。

将重组蛋白粗提液离心收集包涵体，经洗涤、溶解，利用固定化金属离子(Ni2+)配体亲和层析柱纯化。

纯化后的重组蛋白(LBD-NGF)经透析复性，超滤浓缩处理，然后将蛋白质溶剂体系用PBS置换，保存于-80℃，用于实施例2-5的实验。

将重组蛋白粗提液和纯化后的重组蛋白(还原条件下的包涵体)进行15％SDS-PAGE检测，结果如图1所示。图1中，1：蛋白质分子量Marker；2：全菌蛋白；3：纯化后的重组蛋白。结果表明：重组蛋白(LBD-NGF)主要以包涵体形式表达，经纯化后纯度较高。

2、NAT-NGF的制备和纯化

用重组质粒pET-NAT-NGF代替重组质粒pET-LBD-NGF，其它同步骤1。

纯化后的重组蛋白(NAT-NGF)经透析复性，超滤浓缩处理，然后将蛋白质溶剂体系用PBS置换，保存于-80℃，用于实施例2-5的实验。

实施例2、LBD-NGF蛋白的活性检测

由于大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12可在NGF诱导下分化生成轴突，此外，NGF可以促进神经元的存活，因此，通过PC12(购自协和医科大学基础医学院细胞库)轴突诱导实验和MTT实验来鉴定透析复性后LBD-NGF的活性(Howe CL(2003)Depolarization of PC12 cells induces neurite outgrowth and enhances nerve growth factor-induced neurite outgrowth in rats.Neurosci Lett 351：41-45.)。

用0-480nM的LBD-NGF(或NAT-NGF)刺激PC12细胞，作用1天后，观察PC12细胞的轴突生成状况，计算长轴突细胞比例。结果见图2。结果表明：用NAT-NGF或LBD-NGF刺激的PC12细胞有轴突诱导生成，随着NAT-NGF或LBD-NGF浓度的升高，长轴突细胞比例也随着升高，显示出剂量依赖的效应。

在LBD-NGF(或NAT-NGF)作用三天后做MTT实验。结果见图3。结果表明：随着NAT-NGF或LBD-NGF浓度的升高，OD₄₉₂值也随着升高，说明存活细胞的数量升高。

活性检测实验结果表明，经过透析复性的LBD-NGF蛋白和NAT-NGF蛋白都具有生物活性，且对PC12细胞的作用效果呈剂量依赖的效应。层粘连蛋白结合区的添加没有影响NGF的蛋白活性。

实施例3、LBD-NGF蛋白的层粘连蛋白结合能力分析：

利用基因工程表达LBD-NGF的目的在于在保证其活性的同时，增强其对神经细胞外基质层粘连蛋白的结合能力，降低NGF-β的有效用量。因此利用改进的ELISA实验分别检测NAT-NGF和LBD-NGF对层粘连蛋白的结合能力(Finnis ML，Gibson MA(1997)Microfibril-associated glycoprotein-1(MAGP-1)binds to the pepsin-resistant domain of the alpha3(VI)chain of type VI collagen.J Biol Chem 272：22817-22823.)，并根据Matsushita提供的方法(Matsushita O，Jung CM，Minami J，Katayama S，Nishi N，Okabe A(1998)A study of the collagen-bindingdomain of a 116-kDa Clostridium histolyticum collagenase.J Biol Chem273：3643-3648.)计算两种蛋白对层粘连蛋白的解离常数Kd。

将100μl剂量逐渐增大(浓度为0-8μM)的LBD-NGF(或NAT-NGF)加载在等量的层粘连蛋白(购于sigma公司，产品目录号L2020)上，充分吸附后，经PBS洗涤掉不能结合的蛋白。

等量层粘连蛋白(1μg)对不同量NGF-β的结合量见图4。结果表明：在相同的蛋白加载量情况下，LBD-NGF在层粘连蛋白上的保留量明显高于NAT-NGF，也就是说LBD-NGF的结合效率明显高于NAT-NGF。

NAT-NGF和LBD-NGF的解离常数见图5。结果表明：NAT-NGF和LBD-NGF的解离常数Kd分别为6.25×10^-4M和7.25×10^-6M；根据对Kd的定义，蛋白的Kd值越小，对层粘连蛋白的结合能力越强。因此，与NAT-NGF相比，LBD-NGF对层粘连蛋白的结合能力确实得到了很大提高。

实施例4、LBD-NGF蛋白体外功能实验

首先将100μl剂量逐渐增大(浓度为0-6μM)的LBD-NGF(或NAT-NGF)加载在用层粘连蛋白包被的48孔板，吸附一小时后，用PBS洗两遍，然后将PC12细胞接种在孔板中，37℃培养1天后，观察PC12细胞的轴突生成状况，计算长轴突细胞比例。结果见图6。

结果表明：用NAT-NGF和LBD-NGF刺激的PC12细胞有轴突诱导生成，随着NAT-NGF和LBD-NGF浓度的升高，长轴突细胞比例也随着升高，显示出剂量依赖的效应；并且用LBD-NGF刺激的PC12细胞的长轴突细胞比例显著高于用NAT-NGF刺激的PC12细胞的长轴突细胞比例。

在LBD-NGF(或NAT-NGF)作用三天后做MTT实验。结果见图7。结果表明：随着NAT-NGF和LBD-NGF浓度的升高，OD₄₉₂值也随着升高，说明存活细胞的数量升高；并且LBD-NGF处理组的细胞数量高于NAT-NGF处理组的细胞数量。

由于LBD-NGF在层粘连蛋白上残留的蛋白量高于NAT-NGF，因此，与NAT-NGF相比，LBD-NGF在层粘连蛋白上显示出更高的NGF生物学活性，在体外可以更好的促进PC12细胞的轴突生成和细胞存活。

实施例5、LBD-NGF蛋白对大鼠坐骨神经钝挫伤的修复作用

体内检测LBD-NGF促神经再生活性可采用经典的坐骨神经损伤修复的方法，即将LBD-NGF应用到坐骨神经损伤部位，在不同时间点做行为学、电生理学、组织化学以及透射电镜等检测，从而确定它对坐骨神经损伤的修复能力。用NAT-NGF和PBS作为对照。

选用成年雄性SD大鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)，随机分成三个处理组，每组20只大鼠。将大鼠暴露和分离坐骨神经，在距梨状肌下缘0.5cm处钳夹坐骨神经，钝挫伤宽度为5mm。然后在损伤远端用尼龙线在神经外膜上作一记号，然后分别进行如下给药处理：

第一组(LBD-NGF组)：将10μl浓度为30μM的LBD-NGF注射到损伤部位，并缝合伤口。

第二组(NAT-NGF组)：将10μl浓度为30μM的NAT-NGF注射到损伤部位，并缝合伤口。

第三组(PBS对照组)：将10μl PBS注射到损伤部位，并缝合伤口。

1、神经功能指数(SFI)

于术后的不同时间进行足迹实验。在正常情况下，大鼠的脚趾完全伸展，但损伤后，脚趾会发生并拢。这种足迹的变化可以通过检测坐骨神经功能指数SFI评价。选实验侧足(E)及正常侧足(N)清晰的足印测量3个变量，精确到0.1mm。

①PL(足印长度)：即足跟到足尖的最长距离。

②TS(足趾宽度)：第1-5趾连线的最长距离。

③IT(中间足趾距离)：第2-4趾连线的最长距离。

将3个变量带入Bain公式计算出SFI.

SFI＝-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS-NTS)/NTS+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8。

以0为SFI的正常值，-100为神经完全断离指标。

结果见图8。结果表明：在损伤后7天，LBD-NGF、NAT-NGF和PBS对照组之间没有显著性差异；随后的几周，NAT-NGF和LBD-NGF组的SFI数值明显增高，与PBS对照组有显著性差异；在手术后第28、35、42、49和56天，LBD-NGF组的SFI数值显著高于NAT-NGF组。

2、神经传导速度(NCV)和远端复合肌肉动作电位(DCMAP)

在坐骨神经损伤前的大鼠，坐骨神经损伤后给药前的大鼠，以及给药后4周、8周、12周的大鼠进行电生理学检测，这一指标的检测包括两个参数，神经传导速度(nerve conduction velocity，NCV)和远端复合肌肉动作电位(distal compound muscle action potential，DCMAP)。

神经传导速度和远端复合肌肉动作电位的测定方法：采用英国OXFORD公司生产的Medelec Synergy型肌电诱发电位仪描记CMAP及NCV。测定CMAP参数为：扫描寸间：10ms，灵敏度：100μv，滤波：3HZ～10HZ。将双极刺激电极(包括作用电极和参考电极)分别放置于近端-坐骨神经(坐骨切迹水平)和远端-胫神经(tibral nerve)(内踝水平)，记录电极放置于同侧足内肌，地电极置于记录电极和刺激电极之间，测定刺激远端神经，在足内肌记录到潜伏期和DCMAP，测量近端和远端两点之间的距离，计算NCV。计算方法如下：神经传导速度＝传导距离/传导所需时间。

结果见图9和图10。结果表明，坐骨神经损伤后，两个参数都显著降低，并随着时间的推移慢慢有所恢复。在12周，与PBS对照组相比，NAT-NGF和LBD-NGF组的神经传导速度和远端复合肌肉动作电位都显著提高，并且LBD-NGF组明显高于NAT-NGF组。

3、免疫组化

分别对三个处理组的大鼠和未经任何处理的雄性SD大鼠(NORMAL)坐骨神经进行免疫组化实验。实验中，使用2种抗体-抗神经丝蛋白和抗S100抗体。抗神经丝蛋白抗体可以对轴突进行特异性染色，抗S100抗体可以对施旺细胞特异性染色。

大鼠手术后8周的染色结果见图11。图11中，a-d，大鼠坐骨神经石蜡切片的HE染色结果；e-h，大鼠坐骨神经石蜡切片的抗神经丝蛋白免疫染色结果；i-l，大鼠坐骨神经石蜡切片的抗S100蛋白免疫染色结果。

利用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)对染色后的切片进行统计分析。图12为大鼠坐骨神经抗神经丝蛋白免疫染色统计结果。图13为大鼠坐骨神经抗S100免疫染色统计结果。

在损伤后8周和12周，三组之间的神经丝蛋白表达都有显著性差异，其中LBD-NGF组的蛋白表达都要明显高于其他两组。在损伤后4、8和12周，NAT-NGF和LBD-NGF组的S100蛋白表达都要显著高于PBS对照组(CONTROL)，并且在第8周，NAT-NGF和LBD-NGF两组之间的S100蛋白表达也有显著性差异。结果表明：在坐骨神经损伤后修复中，LBD-NGF组的轴突和施旺细胞的再生都要明显好于其他两组。

4、甲苯胺蓝染色

手术后4周、8周、12周，分别对三个处理组的大鼠和未经任何处理的雄性SD大鼠(NORMAL)坐骨神经的半薄切片的甲苯胺蓝染色，结果见图14。

利用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)对大鼠手术后不同时间的染色后的半薄切片进行统计分析。图15为大鼠坐骨神经髓鞘数目的统计结果。图16为大鼠坐骨神经髓鞘直径大小的统计结果。

结果表明：损伤后第4周，三组之间的髓鞘数目都具有显著性差异；损伤后第4周，NAT-NGF和LBD-NGF组的髓鞘直径大小都要显著高于对照组，并且在损伤后第8周和第12周，LBD-NGF组与NAT-NGF组之间具有显著性差异。

5、透射电镜

手术后4周、8周、12周，分别对三个处理组的大鼠和和未经任何处理的雄性SD大鼠(NORMAL)坐骨神经的超薄切片进行透射电镜检测。图17为手术后12周大鼠坐骨神经超薄切片的透射电镜结果。

利用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)对大鼠手术后不同时间的透射电镜结果进行统计。图18为大鼠坐骨神经髓鞘厚度的统计结果。

结果表明：从第4周开始，LBD-NGF组损伤部位髓鞘的厚度要明显高于对照组，并且在第8周和12周，LBD-NGF组与NAT-NGF组之间都有显著性差异。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>与层粘连蛋白结合的神经生长因子及其编码基因与应用

<130>CGGNARY92411

<160>4

<210>1

<211>146

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Asn Cys Pro Glu Arg Glu Leu Gln Glu Glu Glu Glu Glu Ala Asn Val

1               5                   10                  15

Val Leu Thr Gly Thr Val Glu Glu Ile Met Asn Asp Val Pro Val His

            20                  25                  30

His Thr Tyr Ser Cys Lys Val Arg Val Trp Arg Tyr Leu Lys Gly Lys

        35                  40                  45

Asp Ile Val Thr His Glu Ile Leu Leu Asp Gly Gly Asn Lys Val Val

    50                  55                  60

Ile Gly Gly Phe Gly Asp Pro Leu Ile Cys Asp Asn Gln Val Ser Thr

65                  70                  75                  80

Gly Asp Thr Arg Ile Phe Phe Val Asn Pro Ala Pro Gln Tyr Met Trp

                85                  90                  95

Pro Ala His Arg Asn Glu Leu Met Leu Asn Ser Ser Leu Met Arg Ile

            100                 105                 110

Thr Leu Arg Asn Leu Glu Glu Val Glu His Cys Val Glu Glu His Arg

        115                 120                 125

Lys Leu Leu Ala Asp Lys Pro Asn Ser Tyr Phe Thr Gln Thr Pro Pro

    130                 135                 140

Thr Pro

145

<210>2

<211>438

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

aattgcccgg aacgcgaact gcaggaagag gaagaggaag ccaatgtggt gctgaccggc    60

accgtggaag agattatgaa tgatgtgccg gtgcatcaca cctatagctg caaagtgcgc    120

gtgtggcgct atctgaaagg caaagatatt gtgacccatg aaattctgct cgatggcggt    180

aataaagtgg ttattggcgg ttttggcgat ccgctgattt gcgataatca ggtgagcacc    240

ggcgataccc gcattttttt cgtgaatccg gccccgcagt atatgtggcc ggcccatcgc    300

aatgaactga tgctgaatag cagtctgatg cgcattaccc tgcgcaatct ggaagaggtg    360

gaacattgcg tggaagagca tcgcaaactg ctggccgata aaccgaatag ctattttacc    420

cagaccccgc caaccccg                                                  438

<210>3

<211>287

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1               5                   10                  15

Arg Gly Ser His Met Asn Cys Pro Glu Arg Glu Leu Gln Glu Glu Glu

            20                  25                  30

Glu Glu Ala Asn Val Val Leu Thr Gly Thr Val Glu Glu Ile Met Asn

        35                  40                  45

Asp Val Pro Val His His Thr Tyr Ser Cys Lys Val Arg Val Trp Arg

    50                  55                  60

Tyr Leu Lys Gly Lys Asp Ile Val Thr His Glu Ile Leu Leu Asp Gly

65                  70                  75                  80

Gly Asn Lys Val Val Ile Gly Gly Phe Gly Asp Pro Leu Ile Cys Asp

                85                  90                  95

Asn Gln Val Ser Thr Gly Asp Thr Arg Ile Phe Phe Val Asn Pro Ala

            100                 105                 110

Pro Gln Tyr Met Trp Pro Ala His Arg Asn Glu Leu Met Leu Asn Ser

        115                 120                 125

Ser Leu Met Arg Ile Thr Leu Arg Asn Leu Glu Glu Val Glu His Cys

    130                 135                 140

Val Glu Glu His Arg Lys Leu Leu Ala Asp Lys Pro Asn Ser Tyr Phe

145                 150                 155                 160

Thr Gln Thr Pro Pro Thr Pro Lys Leu Ser Ser Ser His Pro Ile Phe

                165                 170                 175

His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly

            180                 185                 190

Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu

        195                 200                 205

Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu

    210                 215                 220

Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile

225                 230                 235                 240

Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val

                245                 250                 255

Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg

            260                 265                 270

Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg

        275                 280                 285

<210>4

<211>864

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat    60

atgaattgcc cggaacgcga actgcaggaa gaggaagagg aagccaatgt ggtgctgacc    120

ggcaccgtgg aagagattat gaatgatgtg ccggtgcatc acacctatag ctgcaaagtg    180

cgcgtgtggc gctatctgaa aggcaaagat attgtgaccc atgaaattct gctcgatggc    240

ggtaataaag tggttattgg cggttttggc gatccgctga tttgcgataa tcaggtgagc    300

accggcgata cccgcatttt tttcgtgaat ccggccccgc agtatatgtg gccggcccat    360

cgcaatgaac tgatgctgaa tagcagtctg atgcgcatta ccctgcgcaa tctggaagag    420

gtggaacatt gcgtggaaga gcatcgcaaa ctgctggccg ataaaccgaa tagctatttt    480

acccagaccc cgccaacccc gaagctttca tcatcccatc ccatcttcca caggggcgaa    540

ttctcggtgt gtgacagtgt cagcgtgtgg gttggggata agaccaccgc cacagacatc    600

aagggcaagg aggtgatggt gttgggagag gtgaacatta acaacagtgt attcaaacag    660

tacttttttg agaccaagtg ccgggaccca aatcccgttg acagcgggtg ccggggcatt    720

gactcaaagc actggaactc atattgtacc acgactcaca cctttgtcaa ggcgctgacc    780

atggatggca agcaggctgc ctggcggttt atccggatag atacggcctg tgtgtgtgtg    840

ctcagcagga aggctgtgag atga                                           864