紫色幼叶融合基因及其作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用

摘要

紫色幼叶融合基因及其作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用。本发明利用拟南芥幼叶特异性启动子与番茄花氰苷合成途径的调节基因构建了融合基因，将其命名为PL1融合基因，其核酸序列如序列表1所示。该融合基因可以作为可视筛选标记基因，在植物转基因技术中代替抗生素抗性基因等传统筛选标记基因，以紫色幼芽或幼叶为特征进行转基因植物的筛选。这样不仅可以避免植物基因工程技术应用过程中因使用传统筛选标记可能带来的食品安全和环境安全等问题，也克服了以往获得无抗生素抗性标记转基因植物方法的步骤繁琐、实验周期长、删除效率低、受物种限制等缺陷。本发明还提供了该融合基因应用于微型番茄转化的实施例。

说明书

【技术领域】：本发明属于植物基因工程领域，具体地说是用拟南芥幼叶特异性启动子与番茄花氰苷合成途径的调节基因构建PL1融合基因及其作为可视筛选标记在转基因植物中的应用。

【背景技术】：自第一株转基因植物问世以来，转基因植物的研究与应用得到了很大的发展。目前，已有很多转基因植物进入商业化生产，包括抗虫、抗除草剂、抗病毒、改良品质、延长保鲜期等多种优良性状的作物。但是，随着商业化转基因植物新品种的不断出现，人们对转基因植物安全性也提出了质疑。

由于目前所采用的植物转基因技术主要是通过组织培养进行的，在其过程中，通常利用抗抗生素类或抗除草剂类等选择标记来筛选转化细胞，当筛选过程结束后，选择标记基因与目的基因一同整合到转基因植物基因组中，这些选择标记基因的存在成为影响转基因植物安全性的主要因素之～。转基因植物的安全性主要指食品安全和环境安全两个方面，为了避免这种潜在的安全性问题，人们试图通过多种方法获得安全的转基因植物，主要包括安全标记基因的利用和传统选择标记基因的删除两种方式。

利用安全标记基因进行转化植株筛选时，其编码蛋白不是将非转化的细胞杀死，而是使转化细胞处于某种有利的代谢或发育条件下，或者具有某些独特的可视特征，从而筛选出转化植株。这种安全标记基因的优点在于选择剂无毒副作用，而且多数情况下有利于转化植株的再生和转化效率的提高。例如：编码异戊烯基转移酶的ipt基因是细胞分裂素合成的关键基因，Ebinuma将来自农杆菌P022T-DNA的ipt基因作为安全标记基因进行烟草转化，结果证明转化细胞能够在不含细胞分裂素的培养基上生长，并形成不定芽；而未转化的细胞则不能正常生长和分化，最终死亡(Ebinuma，1997)。而采用可视筛选标记，则在植物转化过程中无需使用选择剂，依据可视筛选标记基因所编码产生的一些独特的可视特征将转化植株/材料与非转化植株/材料区分开来。例如，Saika通过GFP基因的编码产物能够产生绿色荧光的可视性特点，快速的筛选出水稻的转化愈伤组织(Saika，2009)。

传统的无选择标记或标记删除的方法是先利用传统的选择标记筛选出初级转基因植株，然后利用转基因植株后代遗传重组使选择标记基因与目的基因分离，或利用位点特异性酶将标记基因删除而培育无选择际记的转基因植株。主要有四种系统：共转化系统，同源重组系统，位点特异性重组系统和转座子系统。例如：Chakraborti在利用Cre/lox重组系统获得无选择标记的转基因烟草的研究工作中，设计了两个不同的构建：一是以CaMV35S启动子驱动的抗蚜虫基因ASAL为目的基因，卡那霉素抗性基因NPT II为选择标记基因，在该基因侧翼构建Cre重组酶识别的lox位点；第二个构建是以CaMV35S启动子驱动的Cre基因为目的基因，除草剂抗性基因bar为筛选标记基因。这两个构建分别转化烟草，将分别获得的单拷贝的T0代的转基因植物进行杂交，通过Cre重组酶的作用删除NPT II抗性基因，删除率为19.2％，杂交后代分离获得没有抗生素抗性标记的抗蚜虫转基因植物(Chakraborti，2008)。但这类方法不同程度地存在着步骤繁琐、实验周期长、删除效率低、受物种限制等问题。

花氰苷是花青素与各种单糖结合而形成的黄酮多酚类化合物。它是植物合成的一类次生代谢物，能控制植物从红到紫甚至是蓝的一系列变化，主要积累在植物表皮细胞的液泡内。目前，已从玉米(Ludwig，1989)、金鱼草(Martin，1991)、矮牵牛(Quattrocchio，1999)、烟草(Pattanaik，2010)等植物中分离并克隆了部分与花青素生物合成相关的结构基因与调节基因，MYB转录因子是一类很重要的调节花氰苷基因表达的调节因子。Kim等人用组成型、组织特异性和诱导性启动子驱动甘薯的IbMYB1基因瞬时转化烟草时能出现紫色变化，预测该基因在甘薯的遗传转化过程中可作为一个潜在的可视标记基因(Kim，2010)。LeANT1是MYB类转录调控因子，能够调控番茄中花氰苷的生物合成。Mathews等人过表达LeANT1基因获得了一系列紫色的转基因番茄，说明过表达ANT1基因可导致花氰苷的积累。同样构建转化烟草，转基因烟草也表现出从绿到浅紫甚至深紫色的颜色变化，表明LeANT1在其它双子叶植物中也可发挥作用(Mathews，2000)。

从前人的上述研究结果可以预测，花氰苷的特异性积累所呈现的颜色变化特征，具有作为植物转基因技术中一种可视性筛选标记的潜力。利用这种可视性筛选标记可建立一种更安全的转化技术体系，将该体系在植物的遗传转化中进行运用，以解决传统的筛选标记可能给转基因植物带来的安全性问题，势必在转基因植物新品种的实际应用过程中发挥巨大作用。

【发明内容】：本发明目的是解决植物转基因技术应用过程中因使用传统的抗性筛选标记基因可能带来的潜在的安全性问题，以及常用的获得无抗生素抗性标记等转基因植物方法的步骤繁琐、实验周期长、成本高、删除效率低、受物种限制等缺陷，提供一种用于植物转基因技术中的可视性筛选标记基因，即紫色幼叶融合基因。利用该融合基因进行植物转化时，可以紫色幼芽或幼叶作为可视标记，筛选出阳性转基因植株，从而获得没有抗生素抗性等传统筛选标记的转基因材料。

本发明首先提供了一种新的紫色幼叶融合基因，其核酸序列如序列表1所示。本发明是利用拟南芥幼叶特异性启动子和番茄花氰苷合成途径调节基因构建而成，将其命名为PL1融合基因(来自purple leaf首字母)。本发明还包括与上述核酸序列有85％以上的同源性的核酸分子。

利用本发明所述方法，还可以将任意幼叶特异性启动子与导致或促进紫色产生的功能基因融合，获得可使转基因植物产生紫色幼叶或幼芽的融合基因。

本发明同时提供了一种所述的紫色幼叶融合基因作为安全的可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用，即：利用该融合基因作为可视筛选标记基因进行植物转化，可使转基因植物的幼芽或幼叶呈现紫色，将其作为可视筛选标记，可获得阳性的转基因植物。

作为具体应用的实例，本发明提供了这种紫色幼叶融合基因的一种构建方法及其作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用。操作过程如下：

所述应用中的PL1融合基因的构建方法，包括如下步骤：

第一、以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增PL1融合基因启动子部分，回收扩增产物并进行TA克隆；

第二、用KpnI/NcoI双酶切含有PL1融合基因启动子的TA克隆质粒和pCAMBIA1301质粒，分别回收启动子片段和大的载体片段；

第三、将上述两个片段混合，在连接酶催化下进行连接反应，获得中间构建“幼叶特异性启动子-GUS”融合基因；

第四、以番茄基因组DNA为模板，用PCR方法扩增PL1融合基因结构基因部分，回收扩增产物并进行TA克隆；

第五、用SalI/BstE II双酶切上述第四步获得的含有PL1融合基因结构基因的TA克隆质粒和上述第三步获得的含有“幼叶特异性启动子-GUS”融合基因的中间构建质粒，分别回收该结构基因片段和大的载体片段；

第六、将上述两个片段混合，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司，是目前常用的商品化载体)载体上的PL1融合基因的构建。

其中所设计的PL1融合基因启动子部分的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入KpnI酶切位点，下游引物引入SalI和NcoI酶切位点：

上游引物：5’-GGTACCATGTGATTATTCCAAATACATACTT-3’

下游引物：5’-CCATGGTCGACATGGAGCTAGTTTCTCTCTCTCT-3’

所设计的PL1融合基因结构基因部分的PCR扩增引物如下，上游引物引入SalI酶切位点，下游引物引入BstE II酶切位点：

上游引物：5’-GTCGACCATGAACAGTACATCTATGTCTTCAT-3’

下游引物：5’-CTCGAGTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’。

所述应用中的PL1融合基因在植物转基因技术中的应用，操作过程如下：

用PL1融合基因转化微型番茄Micro-Tom：用普通YEP液体培养基培养带有PL1融合基因的农杆菌，至OD₆₀₀为1.0左右离心收集菌体，然后用同体积的液体MS培养基(含100mmol/L乙酰丁香酮)重新悬浮菌体；取微型番茄Micro-Tom无菌幼苗的叶片，在上述菌液中侵染10分钟，然后放至共培养培养基上暗培养2天；将上述外植体移至脱菌培养基上光照培养3天，移至不定芽分化培养基上，诱导生芽，利用紫色幼芽作为可视标记筛选出阳性芽；当阳性芽长至约2厘米高时转入不定根分化培养基上培养，诱导生根；将生根较好的植物移土培养至开花结实。

本发明的优点和积极效果：

本发明利用拟南芥幼叶特异性启动子与番茄花氰苷合成途径的调节基因构建了PL1融合基因；在植物转化过程中，该融合基因可以替代传统的抗抗生素或抗除草剂等抗性基因，以紫色幼叶或幼芽作为可视标记，筛选出阳性转基因植株。该融合基因作为安全可视的筛选标记基因应用于植物转基因技术，不仅避免了使用传统选择标记基因可能带来的食品安全和环境安全等方面的潜在危险，而且与常用的获得无选择标记转基因植物的方法相比，具有操作简便、流程短、成本低等优点。因此，本发明必将为植物转化技术的实际应用提供强有力的支持。

【附图说明】：

图1是PL1融合基因在微型番茄转化过程中的应用，目的基因为潮霉素抗性基因hpt。图a：转化后，潮霉素抗性筛选初期可见紫色芽与绿色芽并存；图b：抗性筛选后期，可见绿色芽逐渐变黄、枯萎至死亡，说明其为非转化芽；而紫色芽具有潮霉素抗性，能持续旺盛生长，说明为hpt转化芽。图c：紫色转化芽经持续生长、诱导生根后移土生长。可见转基因植株的成熟叶片紫色淡去，能进行正常的持续旺盛生长、正常开花结实。

图2是PL1融合基因转基因微型番茄植株的PCR鉴定；泳道M：plus2000Marker；泳道1：用野生型番茄的基因组DNA为模板的负对照；泳道2-8：PL1融合基因转基因番茄植株的基因组DNA为模板的PCR产物。泳道9：PL1融合基因质粒为模板的PCR的正对照；泳道10：H₂O为模板的PCR的负对照。

【具体实施方式】：

实施例1：PL1融合基因启动子部分克隆

第一、以拟南芥基因组DNA为模板利用PCR方法扩增1593bp的PL1融合基因的启动子，回收扩增产物并进行TA克隆。

(1)PCR扩增目的片段

根据拟南芥幼叶特异性启动子区的序列设计特异引物，在上游引物中引入KpnI酶切位点，在下游引物中引入SalI和NcoI酶切位点。

上游引物：5’-GGTACCATGTGATTATTCCAAATACATACTT-3’(引入KpnI切点)

下游引物：5’-CCATGGTCGACATGGAGCTAGTTTCTCTCTCTCT-3’(引入SalI和NcoI切点)

按常规方法提取拟南芥基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备PL1融合基因启动子片段。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

94℃5分钟；

94℃30秒，60℃1分30秒，30个循环；

72℃10分钟；

4℃保温。

(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

①目的片段的回收

通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，回收方法采用大连宝生物(TaKaRa)公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。

②连接

加入下列反应体系的试剂，16℃反应过夜，实现目的片段与pGEM-T-Easy(购自Promega公司)载体的连接。

③转化和阳性克隆的鉴定

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，用10μL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp、X-gal和IPTG的平板上，37℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用KpnI和SalI双酶切，产生3kb的pGEM-T-Easy载体片段和包含PL1融合基因启动子的1593bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生1593bp的PL1融合基因启动子片段，即为含有该启动子序列的阳性克隆。

④测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌穿刺培养物到Sangon(上海生工生物技术有限公司)进行DNA测序，其核酸序列如序列表1所示。

实施例2：以所克隆幼叶特异性启动子替代pCAMBIA 1301载体上的CaMV 35S启动子，获得中间构建“幼叶特异性启动子-GUS”融合基因

(1)从大肠杆菌中提取载体质粒pCAMBIA 1301(购自CAMBIA公司)，用KpnI/NcoI双酶切后回收大的载体片段(其中包含有GUS报告基因序列)。

(2)从实施例1所制备的TA克隆中提取质粒，用KpnI/NcoI双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收(同实施例1)PL1融合基因启动子片段。

(3)将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA 1301载体上的“幼叶特异性启动子-GUS”融合基因构建。

连接体系：

(4)用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例1。

(5)挑选转化平板(Kan抗性)上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用Kpn I/和BstEII双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是8991bp的pCAMBIA 1301载体片段，另一个是3644bp的“幼叶特异性启动子-GUS”融合基因。

(6)以质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的“幼叶特异性启动子-GUS”融合基因，扩增片段的大小是1866bp。所用引物如下：

上游引物：5’-GGTACCATGTGATTATTCCAAATACATACTT-3’

下游引物：5’-TCGCGATCCAGACTGAATGCC-3’

(7)经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。

实施例3：PL1融合基因的结构基因的克隆

根据番茄花氰苷合成途径调节基因cDNA的序列信息设计特异引物，在5’端分别引入SalI和BstE II酶切位点，PCR产物的大小应是825bp。

上游引物：5’-GTCGACCATGAACAGTACATCTATGTCTTCAT-3’

下游引物：5’-CTCGAGTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’

按常规方法提取番茄基因组DNA，以基因组DNA为模板，用PCR方法扩增PL1融合基因结构基因，然后用pGEM-T-Easy载体进行TA克隆。PCR反应体系、反应条件、目的片段的回收、克隆和测序，同实施例1。

实施例4：在pCAMBIA1301载体上构建PL1融合基因

(1)提取实施例2制备的含有“幼叶特异性启动子-GUS”融合基因的质粒，用SalI/BstE II双酶切后回收大的载体片段(其中不含有GUS报告基因序列)。

(2)从实施例3所制备的TA克隆中提取质粒，用SalI/BstEII双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收(同实施例1)PL1融合基因结构基因片段。

(3)将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA 1301载体上的PL1融合基因构建。连接体系及转化大肠杆菌的方法同实施例2。

(4)挑选转化平板(Kan抗性)上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用KpnI和BstE II双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是8991bp的pCAMBIA 1301载体片段，另一个是2415bp的PL1融合基因。

(6)以质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的PL1融合基因，扩增片段的大小是2415bp。所用引物如下：

上游引物：5’-GGTACCATGTGATTATTCCAAATACATACTT-3’

下游引物：5’-CTCGAGTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’

(7)经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。

(8)从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌LBA4404，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例5：PL1融合基因在微型番茄转化过程中的应用

(1)以实施例4制备的PL1融合基因转化微型番茄Micro-Tom，以pCAMBIA1301载体上所带有的潮霉素抗性基因hpt为转化的目的基因，检测PL1融合基因作为可视筛选标记的可行性和实用性。具体转化方法采用农杆菌介导的遗传转化方法(Meissner，1997)，转化过程中既有绿色芽产生，也有紫色芽产生，但是经过10mg/L潮霉素抗性筛选后，绿色芽全部被筛死，而紫色芽全部具有潮霉素抗性，能在含潮霉素抗性培养基上持续旺盛生长(图1a和1b)，说明为hpt基因的转化芽。将这些紫色芽诱导生根，随后移土培养至开花结实。可以观察到由紫色芽生成的转基因植株在土培生长过程中，成熟叶片紫色淡去，植株生长发育正常(图1c)。

(2)转基因植株的PCR检测：分别剪取转基因植株和野生型植株的叶片，参考《分子克隆实验指南(第三版)》(黄培堂等，2002)方法提取叶片基因组DNA，用如下引物进行PCR反应，反应体系同实施例1：

上游引物：5’-GGTACCATGTGATTATTCCAAATACATACTT-3’

下游引物：5’-CTCGAGTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’

然后PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，转基因植株出现2408bp的PL1融合基因条带，非转基因植株未出现融合基因条带，证明目的片段已整合到植物基因组中(见图2)。

(3)PL1融合基因在微型番茄转化的诱导生芽阶段特异性表达

被含有PL1融合基因的农杆菌侵染的微型番茄外植体在诱导生芽培养基上，既有绿色芽产生，也有紫色芽产生，但是经过抗生素筛选后，绿色芽全部被筛死，而紫色芽全部是有抗性的，紫色芽被诱导生根后，特别是植株移土以后成熟叶片的紫色逐渐消退(见图1)，植株生长发育正常。这充分证明了用带有PL1融合基因的载体转化植株时，以紫色幼叶或幼芽作为转基因植株的可视筛选标记的可行性和实用性。

以PL1融合基因作为植株转化的可视筛选标记基因，不但避免了使用抗抗生素或抗除草剂等选择标记可能带来的食品和环境安全等潜在危险，也克服了传统的获得无选择标记转基因植物方法的诸如步骤繁琐、实验周期长、删除效率低、受物种限制等缺陷，具有操作简便、流程短、成本低等优点，该融合基因也能用于其它植物的转化，同样以紫色幼芽或幼叶作为安全可视的筛选标记获得转基因新品种。因此，本发明必将为植物转化技术的实际应用提供强有力的支持。

【参考文献】：

黄培堂，等译.《分子克隆实验指南》(第三版)，北京：科学出版社，2002

Chakraborti D，Sarkar A，Mondal H A，et al.Cre/lox system to develop selectable marker freetransgenic tobacco plants conferring resistance against sap sucking homopteran insect，Plant Cell Rep，2008，27：1623-1633

Goldsbrough A P，Lastrella C N，Yoder J I.Transposition mediated re-positioning and subsequentelimination of marker genes from transgenic tomato.Biotechnology，1993，11：1286-1292

Ebinuma H，Sugita K，Matsunaga E，et al.Selection of marker-free transgenic plants usingtheisopentenyl transferasegene.Proc Natl Acad Sci，1997，94：2117-2121

Li B，Li N，Duan X，et al.Generation of marker-free transgenic maize with improved salt toleranceusing the FLP/FRT recombination system.Journal of Biotechnology，2010，145：206-213

Ludwig S R，Habera L F，Dellaporta S L，et al.Amember of the maize R gene family responsible fortissue-specific anthocyanin production，encodes a protein similar to transcriptional activators and containsthe myc-homology region.Proc Natl Acad Sci，1989，86，7092-7096

Kim CY，Ahn YO，Kim SH，et al.The sweet potato IbMYB1gene as a potential visible marker forsweet potato intragenic vector system.Physiol Plant，2010

Martin C，Prescott A，Mackay S，et al.Control ofanthocyanin biosynthesis in flowers of Antirrhinummajus.Plant J，19911(1)：37-49

Mathews H，Clendennen SK，Caldwell CG，et al.Activation Tagging in Tomato Identifies aTranscriptional Regulator of Anthocyanin Biosynthesis，Modifcation，and Transport.Plant Cell，2000，15：1689-1703

Pattanaik S，Kong Q，Zaitlin D，et al.Isolation and functional characterization of a floral tissue-specificR2R3MYB regulator from tobacco.Published online

Quattrocchio F，Wing J，Woude K van der，et al.Molecular analysis of the anthocyanin 2gene ofpetunia and its role in the evolution of flower color.Plant Cell，1999，11：1433-1444

Reinhardt B，Hanggi E，Sabrine Muller，et al.Fleming.Restoration of DWF4 expression to the leafmargin of a dwf4 mutant is sufficient to restore leaf shape but not size：the role of the margin in leafdevelopment.The Plant Journal，2007，52，1094-1104

Saika H，Toki S.Visual selection allows immediate identification of transgenic rice calli efficientlyaccumulating transgene products.Plant Cell Rep，2009，28(4)：619-626

Sripriya R，Raghupathy V，Veluthambi K.Generation of selectable marker-free sheath blight resistanttransgenic rice plants by efficient co-transformation of a cointegrate vector T-DNA and a binary vectorT-DNA in one Agrobacterium tumefaciens strain.Plant Cell Rep，2008，27(10)：1635-1644

Xuan Gao，Li Zhang，Shiyi Zhou，et al.AtMYB12gene：a novel visible marker for wheattransformation.Mol Biol Rep，2010，published online

Zubko E，Scutt C，Meyer P.Intrachromosomal recombination between attp regions as a tool to removeselectable marker genes from tobacco transgenes.Nat Biotechnology，2000，18：442-445.

序列表

序列表SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>紫色幼叶融合基因及其作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2408

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)番茄(Lycopersicon esculentum)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(25)

<223>atgtgattat tccaaataca tactt

<220>

<221>primerbind

<222>(1)...(25)

<223>tgacttatgg aatctacttg attaa

<400>1

atgtgattat tccaaataca tactttggat gtttaaactt aatcttgttt cttcctacgt    60

ataaatatta atcatcgagg taaaaaaagt tttgtcttat tttcgcgatg catgaaggat    120

aaacctaatg actttaattt tttgaaaatg taaccctttt actcatagat taattaccgt    180

atgtttttgt tgccataatg acagcctcta caactgtgat agtcaatttt ttctgcaaat    240

attaaattag gaattcaatg ctactatcaa tagaagaaac agctgagtat tacattttaa    300

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cctataatgt atttcctatg ttcttaaaat attttttttt atatttagtt ataaatacat    420

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aattattaat atttagtcaa taacaatgca tagaaagttc caaaaaaaat tttgttaaca    540

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ggacaacaat gaaaacggaa ttaaaatatt aactttaaaa taaataaaaa tttgagtaaa    780

tgtgttttct gactattgag gggcaaaaaa aagacaatgc caaaagtcta cgggtttgac    840

tgtccagttc ggtaataatc taataactct gtctttgacc gcacgctcgt gtaggggtcc    900

ttctgacatt ttcactgttc tacccctact cgtgagccca cccttttccc atatcctaag    960

ggtaattttg gaaatcccaa tttaaaccga ttgagaccgt accggacttc ctgggattct    1020

gctggagcat ttatcaaaaa ttattagcac gaatgggttt attaatttaa aaactcacaa    1080

cttgatcaga taaaatttca taaacacttt tacgatggat tcgtacgatc tatctaatga    1140

cttttttttt tctaccacgg tggatgaaag ttatagtact attagccaga gacaattgat    1200

tatagatata tccattaatc catgatattt atgatataaa tagctgttaa actatttcag    1260

catcgcagct ttctgcaact tttgttttta atttaagagt ttaataaata aaagtattaa    1320

aaggagcata acgaggcaac aaaagtaatg aacacggaga aacaaaagcc atgaagctca    1380

ttggttaggt ttaagcttaa taagaagatt ttattaaatt ttaatgacga tgataacaat    1440

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gattgaggtg gctgaattat ctaaggccac atatcaagag aggtgacttt gaacaagatg    1800

aagtggatct cattttgagg cttcataagc tcttaggcaa cagatggtca cttattgctg    1860

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