提高真菌产酶和次级代谢物的方法

摘要

本发明是一种利用真菌生产次级代谢物、蛋白和其它生物活性物质的方法，通过(1)孢子液制备、(2)种子培养、(3)发酵生产、(4)分离提取等步骤获得酶和次级代谢产物；采用的菌种为土曲霉、黑曲霉、变色栓菌、绿色木霉；发酵生产中添加非离子型表面活性剂泊洛沙姆F68作为的剪切力保护剂进行酶或代谢物的生产；本发明的积极效果是：通过在发酵培养基中添加剪切力保护剂，改善了因搅拌和通气产生的剪切力对代谢及产物合成的影响，提高了工业生产中真菌发酵生产酶和次级代谢产物的效率。

说明书

【技术领域】

本发明涉及微生物、医药和化工技术领域，具体地说，是一种利用真菌生产次级代谢物、蛋白和其它生物活性物质的方法。

【背景技术】

丝状真菌作为多种产物的生产菌，广泛应用于工业生产领域，尤其是用于次级代谢物、蛋白和其它生物活性物质，如抗生素、多糖、酶制剂的生产。利用丝状真菌的生产过程既有固体、半固体发酵工艺，也有深层液体发酵工艺。前两种工艺可直接利用低值原料，水和能量输入少，操作简单，但生产效率偏低，难于进行规模化和稳定的生产；此外，采用固态发酵工艺，氧的传递是一个限制因素，不利于需氧量大的产物合成。相比之下，深层液体发酵工艺更适合大规模生产，其传质传热效果都远远优于固态发酵，也容易实现生产全过程的控制。然而，采用深层液体发酵工艺，由机械搅拌和通气引起的剪切力会对菌体形态、生长和产物合成产生重要的影响，导致生产效率和产量降低。有文献报道，在利用真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)生产纤维素酶时，由于纤维素酶对剪切力非常敏感，当剪切力增加时纤维素酶的失活率非常高。

目前，针对这一问题的解决方案有两类：一是对反应器的改进，包括利用固定床、滴流床、转鼓式、泡罩塔和气升式反应器等多设备，同时对搅拌桨的结构和形式进行改进；二是通过生产过程(工艺)的控制，即控制搅拌速率和通气量。这些手段虽然可以有效减少剪切力的形成，但是对于某些真菌的产酶和次级代谢物的生成，仍然有较大的局限，效果并不十分理想，需要进一步改善和提高。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的、能减少剪切力的形成，降低其产生的影响、提高真菌发酵效率生产酶和次级代谢物的方法。

为减小剪切力的形成，减少纤维素酶的失活，除了在技术背景中介绍的两种解决方案以外，改变真菌培养基组成——添加剪切力保护剂，减少对发酵过程的影响，从而提高酶和次级代谢产物的生产率是一种简单易行的方法。在动植物细胞培养中，葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆(Pluronic)F68、血清白蛋白常作为剪切力保护剂添加到培养基中，其产生的效果取决于剪切力保护剂的物化性质、浓度、生产过程、保护机制、菌株和产物。其中，泊洛沙姆(Pluronic)F68作为剪切力保护剂的主要作用是降低界面张力和阻遏细胞对气泡的附着。而关于泊洛沙姆(Pluronic)F68在真菌培养过程的作用目前尚未见有报道。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种提高真菌产酶和次级代谢物的方法，其步骤为包括：

(1)制备孢子液：将真菌菌种接种于马铃薯/葡萄糖/琼脂培养基上，在25～30℃温度下培养5～7天，孢子形成后，用生理盐水洗下孢子，其中孢子的数量可达到10⁷/ml，用纱布过滤存放于4℃的冰箱内；

采用的真菌菌种为土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、变色栓菌(Trametes versicolor)、绿色木霉(Trichoderma viride)丝状真菌；

(2)种子培养：将步骤(1)得到的真菌孢子分别接种到种子培养基中，在25～30℃温度下、150～200rpm摇床中培养16～28小时，得到有众多菌丝或菌丝球的菌种培养液；

其特征是，

(3)发酵生产：将步骤(2)得到的菌种培养液以10～15％的比例接种到添加有剪切力保护剂的发酵培养基中进行酶或代谢物的生产，在28～37℃温度下、于150～250rpm摇床中培养4～7天，获得含有酶或次级代谢物的发酵液；

(4)将含有酶和次级代谢产物的发酵液进行分离、提取，获得酶和次级代谢产物。

所述的剪切力保护剂选自非离子型表面活性剂。

所述的剪切力保护剂为泊洛沙姆(Pluronic)F68。

发酵培养基中添加的剪切力保护剂的浓度为0.1～3g/L。

所述的酶和次级代谢产物主要为纤维素水解酶、木聚糖酶、木质素水解酶和洛伐他丁(lovastatin)。

所述的酶和次级代谢产物包含抗生素、多糖、酶制剂和其它生物活性物质。

本发明提高真菌产酶和次级代谢物的方法的积极效果是：

(1)将泊洛沙姆(Pluronic)F68作为剪切力保护剂用于真菌的培养过程。

(2)通过在发酵培养基中添加剪切力保护剂，改善了因搅拌和通气产生的剪切力对真菌代谢及产物合成的影响，提高了酶活和次级代谢产物的浓度。

(3)提高了工业化生产中真菌发酵生产酶和次级代谢产物的效率。

【附图说明】

附图为LiP和MnP生产过程中添加剪切力保护剂的对比图，

图中，◆◇为LiP酶活，

■□为MnP酶活，

■为添加了Pluronic F68的结果。

【具体实施方式】

以下给出本发明提高真菌产酶和次级代谢物的方法的4个具体实施例，但本发明不限于以下的实施例。

实施例1木质素水解酶的生产

(1)采用变色栓菌(Trametes versicolor)菌株，其编号为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)5.48，中国微生物保藏中心等菌株保藏机构均可提供；

(2)将1ml变色栓菌(Trametes versicolor)菌株的孢子悬液接入土豆/葡萄糖培养基，在30℃条件下、150～200rpm培养24～28小时，得菌种培养液；

(3)发酵培养基的组成：

磷酸二氢钾         2.0g/L，

硫酸铵(NH4)₂SO₄    1.4g/L，

CaCl₂·2H₂O        0.1g/L，

MgSO₄·7H₂O        0.5g/L，

Glucose            10g/L，

微量元素溶液       1-10ml，

维生素B1           0.001g/L，

酒石酸二铵         0.02g/L，

泊洛沙姆(Pluronic)F68  0-3g/L；

(4)发酵条件：将步骤(2)得到菌种培养液以10～15％的比例接种于发酵培养基中，在37℃条件下、于150～200rpm摇床中培养4～7天。

(5)酶的分析：

LiP的酶活分析体系为1.0ml 0.2M，pH3.0酒石酸缓冲液(含藜芦醇0.8mM和过氧化氢0.4mM)和100μl发酵滤液，反应在室温下进行，并于310nm测定，酶活单位定义为每分钟氧化1μmol底物为一个酶活单位。

MnP的酶活分析体系为1.0ml 0.2M，pH4.5酒石酸缓冲液(含0.2mMMnSO4，8mM Guaiacol)和100μl发酵滤液，反应在室温下进行，并于465nm测定，酶活单位定义为每分钟产生1μmol为一个单位。

结果参见附表和附图：

附表.不同浓度添加剂对产酶的影响

附图为LiP和MnP生产过程中添加剪切力保护剂的对比图。

实施例2纤维素水解酶的生产

(1)采用绿色木霉(Trichoderma viride)菌株，其编号为：3.1912，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)等菌株保藏机构均可提供；

(2)将1ml绿色木霉(Trichoderma viride)菌株的孢子悬液接入种子培养基，在30℃条件下、150～200rpm培养16～24小时；

(3)发酵培养基的组成：

无机营养液：

KH₂PO₄         2.0g/L，

Urea           0.3g/L，

(NH4)₂SO₄      1.4g/L，

CaCl₂          0.3g/L，

MgSO₄·7H₂O    0.3g/L，

FeSO₄·7H₂O    0.005g/L，

MnSO₄·H₂O     0.0016g/L，

ZnSO₄          0.0014g/L，

CoCl₂          0.002g/L；

在无机营养液的基础上添加：

乳糖           10g/L，

葡萄糖         10g/L，

Pluronic F68   2g/L；

(4)发酵条件：在28～30℃条件下，于180～220rpm摇床中培养4～5天；

(5)酶的分析：用20mg新华滤纸为底物，加入pH4.8，0.1M的柠檬酸缓冲液1ml，再加稀释的酶液0.1ml，50℃反应1小时，用DNS方法测定还原糖，以葡萄糖为标准，每分钟产生1mg葡萄糖为一个酶活单位。

发酵5天时，纤维素酶活为1.8IU/ml，是未添加剪切力保护剂的2.1倍。

实施例3木聚糖酶的生产

(1)采用黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，其编号为：3.3147，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)等菌株保藏机构均可提供；

(2)将1ml黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的孢子悬液接入马铃薯/葡萄糖种子培养基，在30℃条件下、150～200rpm培养16～24小时；

(3)发酵培养基的组成：

无机营养液：

KH₂PO₄            2.0g/L，

(NH4)₂SO₄         1.4g/L，

CaCl₂             0.3g/L，

MgSO₄·7H₂O       0.3g/L，

FeSO₄·7H₂O       0.005g/L，

MnSO₄·H₂O        0.0016g/L，

ZnSO₄             0.0014g/L，

CoCl₂             0.002g/L；

发酵培养基：以无机营养液为基础液，添加

蛋白胨            1g/L，

乳糖              10g/L，

Pluronic F68      1g/L；

(4)发酵条件：在28～30℃条件下，于180～220rpm摇床中培养4～5天；

(5)酶的分析：取0.5ml稀释的粗酶液，加入1ml 0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液(pH4.8)和0.5ml 2％(w/v)木聚糖溶液(0.1mol/L，pH4.8NaAc-HAc缓冲液配制)，50℃下反应30分钟。用DNS法测定木聚糖酶的活力，定义：每毫升酶液每分钟催化木聚糖所产生的木糖的微摩尔数为1个酶活力单位。

发酵5天，酶活检测为295IU/ml，是未添加Pluronic F68的1.8倍。

实施例4洛伐他丁(lovastatin)的生产

(1)采用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株，其编号为：CPCC440480，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)等菌株保藏机构均可提供；

(2)将1ml土曲霉(Aspergillus terreus)菌株的孢子悬液接入种子培养基，在28～30℃条件下、150～200rpm培养16～20小时；

种子培养基为：

玉米浆            5g/L，

酵母抽提物        5g/L，

豆饼粉            5g/L，

葡萄糖            15g/L，

微量元素溶液      10ml；

(3)发酵培养基的组成：

乳糖              70g/L，

玉米浆            10g/L，

酵母抽提物        8g/L，

豆饼粉            4.2g/L，

葡萄糖            20g/L，

甘油              30g/L，

Pluronic F68      0.5g/L；

(4)发酵条件：在28～30℃条件下，于180～250rpm摇床中培养4～5天；

(5)产物分析：用纯甲醇萃取发酵液中的产物(比例1∶1)，离心收集上清进行HPLC测定，进样量20uL。流动相甲醇∶水(4∶1，pH3.5)，C18柱，紫外检测(237nm)。检测分析发酵4天的产物，洛伐他丁(lovastatin)浓度达620mg/L，是未添加剪切力保护剂的1.6倍。