一种肺泡表面活性蛋白质(SP-B和SP-C)的分离纯化方法

摘要

本发明提供了一种肺泡表面活性蛋白(SP-B和SP-C)的分离纯化方法，主要包括如下步骤：(1)灌洗猪肺主气管，收集溢出的泡沫；(2)向收集到泡沫中加入氯仿/甲醇(体积比为1∶1)的混合液并进行充分混合后，收集下层清液；(3)将(2)中收集到的下层清液进行减压蒸馏，获得的溶液放入冰箱储存备用；(4)将(3)中得到的溶液加入凝胶色谱柱中进行分离纯化，收集对应排除体积的产品，并对其进行减压蒸馏，获得肺泡表面活性蛋白(SP-B和SP-C)。本发明涉及一种肺泡表面活性蛋白SP-B和SP-C的分离纯化方法，特别是以新鲜猪肺为原料进行分离纯化的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肺表面活性蛋白质(SP-B和SP-C)的分离纯化方法，特别是以新鲜猪肺为原料进行分离纯化的方法。

背景技术

哺乳动物肺泡表面活性物质(Pulmonary Surfactant，简称PS)是由肺泡II型上皮细胞分泌的具有多相的脂质和蛋白质的混合物，PS的主要功能是降低肺泡表面张力，防止肺泡在呼气末期萎缩。SP-B和SP-C是PS中的两种疏水性蛋白，它们在呼吸过程中均扮演着重要角色。

在应用生物学领域，大规模的且经济的蛋白质提纯方法，越来越重要。一般来说，蛋白质主要来自细胞培养，即在哺乳动物细胞或者细菌细胞内植入能够促进目标蛋白质合成的质粒。有关蛋白质纯化的方法，中国专利CN1214614A提出了一种油料籽仁蛋白质的提取方法，该方法使用食品级盐溶液，通过浸提具有相当脂肪含量的油料籽仁粗粉，来促使油料籽仁粗粉中的蛋白质及脂肪发生溶解，形成蛋白质水溶液，再通过冷却蛋白质水溶液的方法除去蛋白质水溶液中脂肪的方法。中国专利CN1216685A提出了一种富含葡糖苷配基异黄酮的植物蛋白提取物和分离物及其生产和回收方法。该方法用具有高于大约蛋白质物质等电点的pH的含水提取剂提取包含葡糖苷异黄酮的植物蛋白物质。目前尚无有关SP-B和SP-C从哺乳动物细胞中的分离和纯化的相关报道，为了填补这一空白，本发明提出了如下方案，获得纯化的SP-B和SP-C。

发明内容

本发明的目的是将哺乳动物肺部细胞内的表面活性蛋白质(SP-B和SP-C)分离出来并进行纯化。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)一只正常的新鲜猪肺，用自来水冲去表面血迹后，顺着主气管向其中灌入温度为25～40℃的生理盐水，并挤压猪肺，收集溢出的泡沫，重复上述过程10～20次，直至猪肺的主气管内基本无泡沫溢出，得到泡沫与生理盐水的混合物；

(2)将步骤(1)所得混合物倒入2000ml的分液漏斗中，静置5min，放出下层液体，并将剩余物转移至离心管内进行离心分离，离心机转速为3000转/分，离心时间为45min；

(3)离心完毕，将泡沫层刮出，放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(体积比为1∶1)混合液50～60ml，充分混合后静置30min，收集下层清液；

(4)将步骤(3)所得下层清液倒入250ml单口烧瓶中，减压蒸馏，除去部分溶剂，得浓缩液20～30ml；

(5)将步骤(4)所得浓缩液加入层析柱中进行分离，柱子的固定相为葡聚糖凝胶LH-60，柱长为50cm，柱子内经为1cm，流动相为氯仿/甲醇(体积比1∶1)的混合溶液，收集排出体积为90～130ml的产品共40ml，即为SP-B溶液，再收集排出体积为170～210ml的产品共40ml，即为SP-C溶液；

(6)分别将步骤(5)得到的SP-B溶液和SP-C溶液进行减压蒸馏，除去溶剂即得纯化的肺表面活性蛋白质。

所述的每次向猪肺主气管中灌入的生理盐水的体积为60～80ml，最后获得的泡沫与生理盐水的混合物的体积约为600～1600ml。

所述的由步骤(1)得到的泡沫与生理盐水的混合物静置后，放出的下层液体体积约为450～1450ml。

所述的两次减压蒸馏的温度均为40～50℃。

所述的柱层析分离法中，柱子温度为30～40℃，层析分离时控制流动相流速为15～20ml/h。

本发明的创新点在于提取猪肺中的表面活性物质，并采用葡聚糖凝胶色谱柱分离出表面活性蛋白，所得的蛋白质具有较高的纯度。

具体实施方式

实施例1

一只正常的新鲜猪肺，用自来水冲去表面血迹后，顺着主气管向其中灌入温度为25℃的生理盐水60ml，并挤压猪肺，收集溢出物，重复上述过程10次，直至猪肺的主气管内基本无泡沫溢出，共获得泡沫与生理盐水的混合物约为600ml。将混合物倒入2000ml分液漏斗中，静置5min，放出下层液体约450ml，并将剩余物转移至离心管内进行离心分离。离心机转速为3000转/分，离心时间为45min。离心完毕，用小勺将分离得到的上层泡沫刮出，放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(体积比为1∶1)混合液50ml，充分混合后静置30min，收集下层清液。将下层清液倒入250ml单口烧瓶中，在40℃减压蒸馏，除去部分溶剂，得到浓缩溶液20ml；将该浓缩液加入层析柱中进行分离，柱子的固定相为葡聚糖凝胶LH-60，流动相为氯仿/甲醇(体积比1∶1)的混合溶液，柱长为50cm，柱子内经为1cm，柱子温度为30℃，控制流动相流速为15ml/h，收集排出体积为90～130ml的产品共40ml，即为SP-B溶液，采用液相色谱分析，纯度为98.8％(不计溶剂)，再收集排出体积为170～210ml的产品共40ml，即为SP-C溶液，采用液相色谱分析，纯度为98.5％(不计溶剂)；分别将上述两种溶液在40℃下减压蒸馏，分别得SP-B(98.8％)4.1mg、SP-C(98.5％)2.0mg。

实施例2

一只正常的新鲜猪肺，用自来水冲去表面血迹后，顺着主气管向其中灌入温度为40℃的生理盐水80ml，并挤压猪肺，收集溢出物，重复上述过程10次，直至猪肺的主气管内基本无泡沫溢出，共获得泡沫与生理盐水的混合物约为800ml。将混合物倒入2000ml分液漏斗中，静置5min，放出下层液体约650ml，并将剩余物转移至离心管内进行离心分离。离心机转速为3000转/分，离心时间为45min。离心完毕，用小勺将分离得到的上层泡沫刮出，放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(体积比为1∶1)混合液60ml，充分混合后静置30min，收集下层清液。将下层清液倒入250ml单口烧瓶中，在50℃减压蒸馏，除去部分溶剂，即得到浓缩溶液30ml；将该浓缩液加入层析柱中进行分离，柱子的固定相为葡聚糖凝胶LH-60，流动相为氯仿/甲醇(体积比1∶1)的混合溶液；柱长为50cm，柱子内经为1cm，柱子温度为40℃，控制流动相流速为20ml/h。收集经过柱层析分离得到的产品，收集排出体积为90～130ml的产品共40ml，即为SP-B溶液，采用液相色谱分析，纯度为98.5％(不计溶剂)，再收集排出体积为170～210ml的产品共40ml，即为SP-C溶液，采用液相色谱分析，纯度为98.7％(不计溶剂)；分别将上述两种溶液在40℃下减压蒸馏，分别得SP-B(98.5％)5.6mg，SP-C(98.7％)2.6mg。

实施例3

一只正常的新鲜猪肺，用自来水冲去表面血迹后，顺着主气管向其中灌入温度为30℃的生理盐水70ml，并挤压猪肺，收集溢出物，重复上述过程16次，直至猪肺的主气管内基本无泡沫溢出，共获得泡沫与生理盐水的混合物约为1150ml；将混合物倒入2000ml分液漏斗中，静置5min，放出下层液体约980ml，并将剩余物转移至离心管内进行离心分离，离心机转速为3000转/分，离心时间为45min，离心完毕，用小勺将分离得到的上层泡沫刮出，放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(体积比为1∶1)混合液55ml，充分混合后静置30min，收集下层清液。将下层清液倒入250ml单口烧瓶中，在45℃减压蒸馏，除去部分溶剂，得到浓缩溶液26ml；将该浓缩液加入层析柱中进行分离，柱子的固定相为葡聚糖凝胶LH-60，流动相为氯仿/甲醇(体积比1∶1)的混合溶液；柱长为50cm，柱子内经为1cm，柱子温度为35℃，控制流动相流速为20ml/h，收集排出体积为90～130ml的产品共40ml，即为SP-B溶液，采用液相色谱分析，纯度为99.0％(不计溶剂)，再收集排出体积为170～210ml的产品共40ml，即为SP-C溶液，采用液相色谱分析，纯度为98.7％(不计溶剂)；分别将上述两种溶液在45℃下减压蒸馏，分别得SP-B(99.0％)4.9mg，SP-C(98.7％)2.2mg。

实施例4

一只正常的新鲜猪肺，用自来水冲去表面血迹后，顺着主气管向其中灌入温度为35℃的生理盐水80ml，并挤压猪肺，收集溢出物，重复上述过程20次，直至猪肺的主气管内基本无泡沫溢出，共获得泡沫与生理盐水的混合物约为1600ml。将混合物倒入2000ml分液漏斗中，静置5min，放出下层液体约1450ml，并将剩余物转移至离心管内进行离心分离。离心机转速为3000转/分，离心时间为45min，离心完毕，用小勺将分离得到的上层泡沫刮出，放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(体积比为1∶1)混合液60ml，充分混合后静置30min，收集下层清液，将下层清液倒入250ml单口烧瓶中，在45℃减压蒸馏，除去部分溶剂，得浓缩液30ml；将该浓缩液加入层析柱中进行分离，柱子的固定相为葡聚糖凝胶LH-60，流动相为氯仿/甲醇(体积比1∶1)的混合溶液，柱长为50cm，柱子内经为1cm，柱子温度为30℃，控制流动相流速为18ml/h，收集排出体积为90～130ml的产品共40ml，即为SP-B溶液，采用液相色谱分析，纯度为98.9％(不计溶剂)，再收集排出体积为170～210ml的产品共40ml，即为SP-C溶液，采用液相色谱分析，纯度为98.7％(不计溶剂)；分别将上述两种溶液在50℃下减压蒸馏，分别得SP-B(99.0％)6.2mg，SP-C(98.7％)3.0mg。